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鸡胚免疫新城疫疫苗后宿主法氏囊转录组学分析

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中国畜牧兽医 2024年第4期51卷 1632-1641页

作者：蒋立人冯贺龙姜鑫瑞王梓晨张高峰商雨曾哲姚伦汪宏才罗青平田光明温国元长江大学动物科学技术学院荆州434025 湖北省农业科学院畜牧兽医研究所农业农村部畜禽细菌病防治制剂创制重点实验室&畜禽病原微生物学湖北重点实验室武汉430064 湖北洪山实验室武汉430070

【目的】通过转录组学分析鸡胚免疫新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)TS09-C株后宿主法氏囊内免疫关键基因及信号通路分子转录差异,探究免疫后宿主法氏囊内免疫相关分子的调控反应。【方法】将60只18胚龄SPF鸡胚随机分为免疫组... 详细信息

【目的】通过转录组学分析鸡胚免疫新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)TS09-C株后宿主法氏囊内免疫关键基因及信号通路分子转录差异,探究免疫后宿主法氏囊内免疫相关分子的调控反应。【方法】将60只18胚龄SPF鸡胚随机分为免疫组和对照组,30枚/组,免疫组将NDV TS09-C株通过羊膜腔接种鸡胚,剂量为103.0 EID 50/枚,注射体积为0.1 mL,对照组以同样的方法接种等体积PBS。检测免疫后不同时间点肺脏、胸腺、脾脏和法氏囊组织的病毒载量。选取病毒载量最高的法氏囊组织进行转录组学测序后,筛选免疫相关差异表达基因并分析其参与的主要功能及通路。【结果】免疫后1 d法氏囊组织中即可监测到病毒,免疫后3 d病毒载量达到最高。将免疫后3 d的法氏囊进行转录组学分析,与对照组相比,免疫组有453个基因上调、98个基因下调,其中免疫相关基因有36个上调、10个下调。免疫相关差异表达基因主要富集于自噬和细胞因子-细胞因子受体相互作用的免疫相关通路。差异表达基因蛋白互作分析显示,自噬通路中富集的BCL2与其他免疫相关基因有较多互作关系,且在B细胞活化、分化、免疫系统发育等功能注释中均有参与。【结论】本研究结果揭示了鸡胚免疫NDV TS09-C株后法氏囊内调控B细胞活化、分化的潜在靶向基因及通路,为进一步研究该毒株鸡胚免疫后B淋巴细胞调控的分子机制提供新的信息。

关键词：新城疫病毒(NDV) TS09-C株鸡胚免疫法氏囊转录组分析

水禽细小病毒SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法的建立与应用

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湖北农业科学 2024年第6期63卷 218-222页

作者：汪宏才商雨马瑶曾哲张蓉蓉姚伦罗玲李丽温国元罗青平湖北省农业科学院畜牧兽医研究所武汉430064 湖北省农业科学院农业农村部畜禽细菌病防治制剂创制重点实验室武汉430064 湖北省农业科学院畜禽病原微生物学湖北重点实验室武汉430064 湖北洪山实验室武汉430070

为了建立水禽细小病毒(WPV)快速检测方法,根据序列比对结果在水禽细小病毒NS基因SF3保守区域内设计特异性引物,建立SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR通用检测方法。该方法的扩增效率(E)为90.0%,相关系数(R~2)=0.99,标准曲线方程为y=-3.607x+38.... 详细信息

为了建立水禽细小病毒(WPV)快速检测方法,根据序列比对结果在水禽细小病毒NS基因SF3保守区域内设计特异性引物,建立SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR通用检测方法。该方法的扩增效率(E)为90.0%,相关系数(R~2)=0.99,标准曲线方程为y=-3.607x+38.77;除WPV出现S形扩增曲线外,新城疫病毒(NDV)、H9亚型禽流感病毒(H9 AIV)、鸭坦布苏病毒(DTMUV)、鸭肝炎病毒(DHAV)、鸭肠炎病毒(DEV)、鸭呼肠孤病毒(DRV)样品均未出现S形阳性扩增曲线;批内变异系数(CV)为0.15%~0.23%,批间变异系数为0.09%~0.28%。结果表明,SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法重复性好、灵敏度高和特异性强。临床样品检测结果表明,SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR与普通PCR的符合率达98.4%,灵敏度是普通PCR的1 000倍。SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法不仅能定性检测WPV,还可以进行定量检测,可用于种鸭场、种鹅场的WPV净化检测,也可用于WPV临床大量样品的快速检测。

关键词：水禽细小病毒检测方法 SYBR GreenⅠ 荧光定量PCR

激活干扰素β信号通路鸭坦布苏病毒结构蛋白的鉴定

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中国兽医科学 2022年第3期52卷 333-338页

作者：贺言李国红商雨温国元张蓉蓉曾驰武汉轻工大学生命科学与技术学院湖北武汉430023 湖北省农业科学院畜牧兽医研究所农业农村部畜禽细菌病防治制剂创制重点实验室湖北武汉430064 武汉科前生物股份有限公司湖北武汉430070

为了初步探究鸭坦布苏病毒(DTMUV)介导的鸭体天然免疫反应分子机制,本研究首先筛选出能显著激活IFN-β的DTMUV毒株,并将DTMUV的3个结构蛋白(C、PrM、E)克隆至真核表达载体pCAGGSHA,再分别与鸭源IFN-β启动子的双荧光素酶报告质粒duIFN-... 详细信息

为了初步探究鸭坦布苏病毒(DTMUV)介导的鸭体天然免疫反应分子机制,本研究首先筛选出能显著激活IFN-β的DTMUV毒株,并将DTMUV的3个结构蛋白(C、PrM、E)克隆至真核表达载体pCAGGSHA,再分别与鸭源IFN-β启动子的双荧光素酶报告质粒duIFN-β-Luc、内参质粒pRL-TK共转染DEFs,使其在细胞内过表达,通过双荧光素酶报告试验检测DTMUV这3个结构蛋白激活鸭源IFN-β启动子的能力。结果显示,只有囊膜蛋白能显著激活IFN-β启动子,Western-blot试验证实这3个结构蛋白转染至DEFs均能正常表达。本研究结果表明,在DEFs中DTMUV的结构蛋白仅囊膜蛋白在激活机体天然免疫反应方面发挥了一定的作用。

关键词：鸭坦布苏病毒结构蛋白双荧光素酶报告试验 IFN-β

基于全基因组序列合成的禽副黏病毒Ⅱ型反向遗传操作系统的建立

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中国兽医学报 2022年第3期42卷 464-471页

作者：王国康李丽贾妙妙冯贺龙曾驰罗青平温国元湖北省农业科学院畜牧兽医研究所湖北武汉430064 农业农村部畜禽细菌病防治制剂创制重点实验室湖北武汉430064 畜禽病原微生物学湖北省重点实验室湖北武汉430064 武汉轻工大学生物与制药工程学院湖北武汉430023

为建立禽副黏病毒Ⅱ型(avian paramyxovirus 2,APMV-2)的反向遗传操作平台,对NCBI已经公布的12条APMV-2全基因组序列进行分析比对,选取较为保守的F8株为模板,将该毒株基因组中特有的10处核苷酸突变为其他毒株共有的一致序列,增加一段大... 详细信息

为建立禽副黏病毒Ⅱ型(avian paramyxovirus 2,APMV-2)的反向遗传操作平台,对NCBI已经公布的12条APMV-2全基因组序列进行分析比对,选取较为保守的F8株为模板,将该毒株基因组中特有的10处核苷酸突变为其他毒株共有的一致序列,增加一段大部分毒株共有的非编码区序列,获得了1株新的APMV-2(命名为Y2株)的全基因组序列。通过人工合成和克隆的方法,构建并获得了Y2株全长cDNA克隆质粒和3个分别表达NP、P和L的辅助质粒。将4个重组质粒共转染至感染痘病毒的BHK-21细胞,成功拯救出APMV-2Y2株。生物学特性测定结果显示,Y2株的鸡胚最低致死剂量的平均致死时间(MDT)大于168h,1日龄雏鸡的脑内致病指数(ICPI)为0.09,判定为弱毒株,鸡胚尿囊液的病毒含量为10^(8.83) EID_(50)/mL,HA效价为9log_(2)。病毒增殖曲线测定结果显示,Y2株感染BHK-21细胞后60h滴度达到峰值。APMV-2Y2株反向遗传操作系统的建立为该病原的致病机理研究及新型禽用疫苗研发提供了依据。

关键词：禽副黏病毒Ⅱ型反向遗传技术新城疫病毒人工合成

鸭源新型鹅细小病毒抗体间接ELISA检测方法的建立及应用

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中国兽医学报 2023年第10期43卷 2042-2049页

作者：马瑶汪宏才唐晟姚伦曾哲罗青平曾驰商雨温国元湖北省农业科学院畜牧兽医研究所湖北武汉430064 武汉轻工业大学生命科学与技术学院湖北武汉430023 农业农村部畜禽细菌病防治制剂创制重点实验室湖北武汉430064 畜禽病原微生物学湖北重点实验室湖北武汉430064 湖北洪山实验室湖北武汉430070

新型鹅细小病毒(novel goose parvovirus,NGPV)是由鹅细小病毒(goose parvovirus,GPV)变异而来,可感染雏鸭,引起以鸭短喙侏儒综合征为主要特征的传染性疾病。2015年该病在我国鸭群中大暴发,严重影响鸭出栏率,给我国的养殖行业带来巨大... 详细信息

新型鹅细小病毒(novel goose parvovirus,NGPV)是由鹅细小病毒(goose parvovirus,GPV)变异而来,可感染雏鸭,引起以鸭短喙侏儒综合征为主要特征的传染性疾病。2015年该病在我国鸭群中大暴发,严重影响鸭出栏率,给我国的养殖行业带来巨大的经济损失。为建立一种鸭源NGPV抗体的间接ELISA检测方法,用于鸭感染细小病毒的血清学检测和鸭免疫细小病毒疫苗后抗体水平监测,本研究利用生物信息学预测了NGPV YICH株的结构蛋白VP3的抗原表位,选择了抗原富集区域(aa250~525)进行原核表达,经蛋白纯化获得了可溶性的VP3截短蛋白VP3-tr。以VP3-tr为包被抗原,经过棋盘滴定方法优化各个反应条件,建立了NGPV抗体的间接ELISA检测方法。利用优化后的间接ELISA方法对30份GPV阴性鸭血清进行检测,确定阴阳性临界值为0.219。ELISA方法的灵敏性、特异性和重复性检测结果表明,该方法灵敏度较高,特异性良好,不与鸭坦布苏病毒、新城疫病毒、禽流感病毒、鸭疫里默杆菌、大肠杆菌病原阳性血清发生交叉反应;批内和批间重复试验的变异系数均小于6%,重复性良好。用该方法与Western blot检测方法分别对147份临床血清样品进行检测,结果表明ELISA检测阳性率为85.0%,Western blot检测率为69.4%,两者符合率为84.4%。综上所述,本研究成功建立了鸭源NGPV抗体的间接ELISA检测方法,为鸭感染NGPV后的感染情况监测以及疫苗免疫评估提供了更简便可靠的方法。

关键词：新型鹅细小病毒 VP3蛋白间接ELISA

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水禽细小病毒病流行病学及防控研究进展

黑龙江畜牧兽医 2023年第16期 24-28页

作者：马瑶罗青平张蓉蓉曾哲温国元商雨汪宏才湖北省农业科学院畜牧兽医研究所武汉430064 武汉轻工业大学武汉430023 农业农村部畜禽细菌病防治制剂创制重点实验室武汉430064 畜禽病原微生物学湖北重点实验室武汉430064

我国是水禽养殖大国,也是禽肉、禽蛋消费大国。细小病毒是危害水禽重要病原之一,常引起鹅和番鸭的发病甚至死亡,造成严重的经济损失。为了有效防控水禽细小病毒(Waterfowl parvovirus,WPVs)的流行,减少经济损失,国内外学者研制各种疫苗... 详细信息

我国是水禽养殖大国,也是禽肉、禽蛋消费大国。细小病毒是危害水禽重要病原之一,常引起鹅和番鸭的发病甚至死亡,造成严重的经济损失。为了有效防控水禽细小病毒(Waterfowl parvovirus,WPVs)的流行,减少经济损失,国内外学者研制各种疫苗用于WPVs的预防。文章从WPVs流行病学及防控措施(疫苗、卵黄抗体及生物安全管理)方面进行综述,旨在为水禽细小病毒病的综合防控提供参考。

关键词：水禽细小病毒流行病学疫苗卵黄抗体生物安全

新城疫病毒作为人和动物传染病疫苗载体的研究进展

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中国动物传染病学报 2022年第5期30卷 176-182页

作者：王国康李丽贾妙妙樊三铃冯贺龙商雨曾驰温国元湖北省农业科学院畜牧兽医研究所武汉430064 农业农村部畜禽细菌病防治制剂创制重点实验室武汉430064 武汉轻工大学生物与制药工程学院武汉430023

新城疫病毒(NDV)是一种有囊膜的、单股负链RNA病毒,属副黏病毒科、正肺病毒属。其作为新城疫(ND)的病原,可引起包括家禽、水禽、候鸟在内的多种家禽和鸟类发病死亡。反向遗传学技术发展至可操作负链非节段RNA病毒之后,NDV已被作为疫苗... 详细信息

新城疫病毒(NDV)是一种有囊膜的、单股负链RNA病毒,属副黏病毒科、正肺病毒属。其作为新城疫(ND)的病原,可引起包括家禽、水禽、候鸟在内的多种家禽和鸟类发病死亡。反向遗传学技术发展至可操作负链非节段RNA病毒之后,NDV已被作为疫苗载体用于开发各种疫苗。本文简要综述了NDV的基本信息、分子生物学特征以及其反向遗传系统,重点概述了NDV作为人和动物疫苗载体的研究进展。

关键词：新城疫病毒反向遗传技术载体疫苗

鸡传染性喉气管炎抗体间接ELISA检测方法的建立及应用

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中国动物传染病学报 2023年

作者：王梓晨贺言王鑫李丽商雨姚伦汪宏才张蓉蓉罗青平代江红曾哲曾驰温国元畜禽病原微生物学湖北重点实验室农业农村部畜禽细菌病防治制剂创制重点实验室武汉轻工大学生命科学与技术学院湖北省农业科学院畜牧兽医研究所湖北洪山实验室

鸡传染性喉气管炎（Infectious laryngotracheitis， ILT）是一种可引起鸡生长缓慢、产蛋下降甚至死亡的呼吸道传染病。为建立一种ILTV抗体间接ELISA检测方法，本研究利用生物信息学预测了ILTV WG株结构蛋白gB的抗原表位，选择抗原富集... 详细信息

鸡传染性喉气管炎（Infectious laryngotracheitis， ILT）是一种可引起鸡生长缓慢、产蛋下降甚至死亡的呼吸道传染病。为建立一种ILTV抗体间接ELISA检测方法，本研究利用生物信息学预测了ILTV WG株结构蛋白gB的抗原表位，选择抗原富集区域gB2（aa326-665）进行原核表达，纯化获得截短蛋白gB2。以gB2为包被抗原，利用棋盘滴定法优化反应条件，建立ILTV抗体间接ELISA检测方法。通过对30份ILTV阴性鸡血清的检测结果进行分析，确定阴阳临界值为0.223。ELISA方法的灵敏性、特异性和重复性检测结果表明，该方法特异性良好，重复性良好，灵敏度较高，不与传染性支气管炎、新城疫、禽流感、禽白血病、鸡白痢沙门氏菌和支原体的阳性血清发生交叉反应；批内和批间重复试验的变异系数均小于5%；血清稀释到1∶12 800时，检测结果仍为阳性。用该方法与商品化试剂盒进行临床样本的检测，阳性符合率为94%。本方法相比于其它ELISA检测方法的指标，特别是灵敏度，均有一定提升。综上所述，本研究成功建立了ILTV抗体间接ELISA检测方法，为防控ILT以及评估疫苗免疫效果提供了更简便可靠的方法。

关键词：传染性喉气管炎病毒 gB蛋白间接ELISA

猪瘟病毒感染性cDNA克隆的构建及其致病性

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病毒学报 2005年第1期21卷 43-47页

作者：王毅吴海祥张楚瑜伊光辉曹晟温国元武汉大学生命科学学院武汉430072

为了建立研究猪瘟病毒的技术平台,利用RT PCR技术构建了猪瘟病毒中国石门株(Shimen)的全长有感染性cDNA克隆pT7SM。通过体外转录线性化的pT7SM并将转录的RNA转染至PK 15细胞中,获得了猪瘟病毒粒子。再用间接免疫荧光法测定了其生长曲线... 详细信息

为了建立研究猪瘟病毒的技术平台,利用RT PCR技术构建了猪瘟病毒中国石门株(Shimen)的全长有感染性cDNA克隆pT7SM。通过体外转录线性化的pT7SM并将转录的RNA转染至PK 15细胞中,获得了猪瘟病毒粒子。再用间接免疫荧光法测定了其生长曲线,通过电镜观察到重组病毒呈球形,具有囊膜结构。进一步把获得的猪瘟病毒粒子感染非免疫实验猪,结果子代病毒与石门株类似,对非免疫实验猪有强烈的致病性,证明该全长cD NA克隆可靠稳定,忠实地保留了石门株病毒的感染性和致病特征。由此为进一步探讨猪瘟病毒的致弱机制及病毒与机体相互作用的机制打下了良好的基础。

关键词：猪瘟病毒全长cDNA克隆体外转录电镜观测致病性 RT-PCR 猪瘟疫苗