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TGF-β诱导Treg细胞极化进而调控肝细胞癌的发展

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TGF-β诱导Treg细胞极化进而调控肝细胞癌的发展

作者：沈艺南第二军医大学

学位级别：硕士

研究背景和目的：肝癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一,其发病率位居第三,每年死亡的病例数超过50万。因其恶性程度高,预后差,素有癌中之王的称号。随着肝癌研究的发展及其治疗手段的不断更新,临床上肝癌的疗效取得了一定提高。但大多数... 详细信息

研究背景和目的：肝癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一,其发病率位居第三,每年死亡的病例数超过50万。因其恶性程度高,预后差,素有癌中之王的称号。随着肝癌研究的发展及其治疗手段的不断更新,临床上肝癌的疗效取得了一定提高。但大多数肝癌患者确诊时已是中晚期,常错失手术时机,手术切除率仅有20-30%,而常规放化疗敏感性较差,且肝癌术后复发转移率高,这些因素使得肝癌患者的预后仍不尽人意。统计资料显示,肝癌术后5年复发率达70%,复发转移已经成为进一步提高肝癌远期疗效的最大障碍,也是攻克肝癌的关键问题之一。前期对于肝癌的研究重点主要集中于基因突变方面,比如原癌基因的激活或抑癌基因的失活等,希望找到在肝癌发生发展中起着决定性作用的节点分子,同时也希望像其他肿瘤一样给临床上肝癌一个详细的分型。由于肝癌的异质性,目前这方面的研究不如人意。近期一些研究发现,免疫微环境在HCC的发生发展过程中同样发挥着重要作用,相关肿瘤浸润免疫细胞如Treg细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和Th17细胞等在肝癌的发生发展中具有重要的重用,可通过分泌相关炎性因子作用于肿瘤细胞起促进或抑制作用。Treg细胞对维持免疫微环境的稳定具有重要作用,并参与外周免疫耐受的维持以及防止自身免疫反应的发生,其主要的标志物是Foxp3。相关研究表明,肿瘤组织中浸润的Treg细胞对宿主的免疫应答起着抑制作用,因此其在肿瘤的治疗中起着负面效应。TGF-β主要是有活化的巨噬细胞分泌,一些受损伤的肝细胞也能分泌少量的TGF-p,可通过作用于TGF-β受体后激活下游的smad2/3,促进smad2/3的入核,在肝癌的发生发展中起着重要的作用。相关研究表明TGF-β参与了CD4+自然T细胞分化成为Treg细胞的过程,其在宿主免疫应答以及免疫耐受的调控过程中也发挥重要作用。前期研究表明,TGF-β可以诱导TCR缺陷的CD4+CD25-自然T细胞中Foxp3的表达,导致外周CD4+CD25-自然T细胞向CD4+CD25-Treg细胞分化,具有强大的免疫抑制潜能。此外,研究还发现TGF-β在人类外周血Treg细胞的传代和扩增过程中同样发挥着重要作用。SM-16是特异性的TGF-β一型受体抑制剂,相关研究发现SM-16可通过阻断TGF-β通路抑制肝纤维化的进展,然而SM-16在肝癌中的作用并未见报道。因此,本课题将通过TGF-β一型受体抑制剂SM-16研究TGF-β在肝癌进展中对Treg细胞的作用,并结合临床相关样本分析TGF-p与IL10的相关性。研究方法：将小鼠随机分为三组,即健康小鼠组、DEN小鼠组以及DEN+SM-16阻断小鼠组。研究健康小鼠组、DEN小鼠组以及DEN+SM-16小鼠组中HCC的发展过程、TGF-β以及Foxp3表达水平、血清中TGF-β的水平、血清中IL-10的水平、血清中GP73的水平和Treg细胞的比例。在体外通过流式细胞检测实验分析TGF-β在Treg细胞极化过程中的作用。通过免疫组化的方式鉴定HCC患者肿瘤样本中TGF-β以及IL-10的表达水平,并分析两者的相关性。研究结果：1.在DEN诱导的HCC小鼠模型中,我们证明了SM-16能否成功阻断TGF-β。2.我们于不同的时间段处死三组小鼠,并取得其肝脏组织。PCR结果显示DEN小鼠组的TGF-β表达水平显著高于另外两组。而ELISA的结果显示DEN小鼠组外周血中TGF-p的蛋白浓度显著高于另外两组。在蛋白水平,通过western blot检测,我们同样发现DEN小鼠组的肝脏组织中TGF-β的蛋白水平也明显高于其他两组。3.通过HE染色观察三组小鼠肝脏的组织学变化,发现DEN小鼠组的肝脏损伤明显较另外两组严重,表现为肝组织致密且出现大量中性粒细胞浸润。DEN+SM-16小鼠组的损伤程度与健康组大体相当。可见,TGF-β阻断后对肝脏可起到一定的保护作用。4.从生物指标的角度来看,GP73是一种常见的肝癌早期血清标志物,我们通过Elisa检测其血清含量,发现DEN+SM-16组的GP73血清含量明显低于肝癌组,证明了SM-16处理后,肝癌的恶性程度下降了。5.我们通过流式检测了三组小鼠脾脏中CD4T细胞四种亚型相关基因Th1、Th2、Th17以及Treg细胞的表达。结果发现Treg细胞在TGF-β阻断前后发生了明显的变化,而其余的细胞均保持稳定。6.在转录水平检测了Treg细胞相关基因Foxp3的表达。在血清中,我们又利用ELISA检测Treg细胞效应分子IL-10的蛋白浓度。发现两者在DEN小鼠组中的表达明显高于其他两组。7.我们对所得的结果进行了临床样品的验证。提取不同分期肝癌组织样本的RNA进行转录分析。发现TGF-β与IL-10的表达与肝癌的进展呈正相关。此外,我们对TGF-β以及IL-10的表达进行了相关性分析,发现两者在肝癌患者组织样本中高度相关。结论：本项研究证实SM-16对小鼠DEN诱导肝癌模型中的TGF-β具

关键词：肝细胞癌 TGF-β Treg细胞 IL10

Kr(?)ppel样因子8对肝癌细胞干细胞样特性影响的研究

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Kr(?)ppel样因子8对肝癌细胞干细胞样特性影响的研究

作者：沈艺南第二军医大学

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研究背景及目的:肝细胞癌(Hepatocelluar carcinoma,HCC)是在肝脏中最常见的原发性恶性肿瘤,其发病率在全球癌症中位列第五,同时也是最常见的肿瘤致死原因之一。HCC的恶性程度极高,由于早期不具有明显的临床症状,许多HCC患者确诊时往往... 详细信息

研究背景及目的:肝细胞癌(Hepatocelluar carcinoma,HCC)是在肝脏中最常见的原发性恶性肿瘤,其发病率在全球癌症中位列第五,同时也是最常见的肿瘤致死原因之一。HCC的恶性程度极高,由于早期不具有明显的临床症状,许多HCC患者确诊时往往已处于晚期。现阶段,针对HCC的治疗已取得了较大的进展,可以选择的治疗方式也相对较多,手术仍然是首选的治疗方式。然而,由于外科手术的低切除率和高复发率,导致HCC的治疗效果并不十分理想,这迫使人们不得不深入研究其发生、发展、侵袭和转移过程中的分子机制,以期能进一步开发更有效的早期诊断和治疗手段。近年来,随着对肿瘤干细胞(Cancer stem cells,CSCs)研究的不断深入,越来越多的证据表明肿瘤的异质性与CSCs的分化密切相关。在肿瘤组织中,虽然CSCs所占比例很少,但已有的研究认为其不仅具有自我更新能力,还具备了多向分化以及无限增殖的潜力。此外,CSCs在肿瘤的多步骤转移、耐药以及复发过程中发挥了重要的作用。具有干细胞样特性的肝脏肿瘤细胞即为肝癌干细胞(Liver cancer stem cells,LCSCs)。深入研究LCSCs的控机制并找到合适的干预靶点有望为HCC的治疗提供新的思路。参与多种重要基因转录的Kruppel样转录因子8(Kruppel like factor 8,KLF8)在HCC发生、增殖和侵袭等恶性生物学行为中起到重要的作用。在既往的研究中,我们首次发现Wnt/β-catenin途径是KLF8蛋白在HCC细胞中潜在的下游信号通路之一,Wnt/β-catenin在HCC细胞中的活性失调可能与KLF8蛋白高表达直接相关,因此KLF8蛋白表达水平异常可能与HCC癌变、侵袭和转移有着直接的联系。但到目前为止,KLF8在干细胞中的研究还很少,其对LCSCs的调控也尚未见报道。本次研究的目的在于探究KLF8成为新型LCSCs标志物的可能性,并阐明其在临床用药指征和联合化疗中的价值,为HCC的诊断和治疗提供新的思路。研究方法:1.临床资料及样本的收集:收集了80例于2008年3月至2011年10月在我院行手术治疗的HCC患者的临床资料及肿瘤组织样本。通过检测这些患者肿瘤组织中KLF8的表达水平并结合所记录的随访资料,分析KLF8的表达与患者预后的关系。2.KLF8对HCC细胞系干细胞样特性的影响分析及机制研究:通过低粘附成球培养实验富集LCSCs,并通过qRT-PCR检测LCSCs中KLF8的表达情况;使用慢病毒干扰HCC细胞株中KLF8的表达,然后通过qRT-PCR、流式细胞实验、成球能力实验等多种方式来探究KLF8干扰后对HCC细胞系干细胞样特性的影响;并进一步探究KLF8与Wnt/β-catenin信号通路在HCC细胞干细胞样特性调控中的相互关系。3.KLF8在肝癌细胞耐药中的影响分析:通过流式细胞实验、CCK8实验以及WB实验检测KLF8低表达HCC细胞系对临床常用药物索拉菲尼和顺珀作用的敏感性。实验结果:1.qRT-PCR检测80例HCC组织及对应癌旁组织中KLF8的mRNA表达水平,发现KLF8在76.3%(61/80)HCC组织中的表达量高于癌旁组织;通过WB检测22例HCC组织及对应癌旁组织,发现81.8%(18/22)的样本中,KLF8在肿瘤组织中的蛋白表达水平明显高于其癌旁组织;通过qRT-PCR分别检测了40例HCC患者的肿瘤组织、癌旁组织及门静脉癌栓(Portal vein tumor thrombus,PVTT)中KLF8的mRNA表达水平,发现KLF8在PVTT中的表达显著高于HCC及癌旁组织;通过对80例HCC患者的组织标本及其随访记录进行检测及统计分析,发现KLF8(+)患者的预后更差。2.通过低粘附成球培养及qRT-PCR检测,发现KLF8在三种不同的HCC细胞系(SMMC-7721、MHCC-LM3、HepG2)成球细胞中的mRNA表达水平明显高于贴壁细胞;从原代HCC细胞中分离出相应的成球细胞,发现KLF8在HCC患者原代成球细胞中的mRNA表达水平同样也高于原代贴壁细胞;通过qRT-PCR检测,发现KLF8在CD24(+)、CD90(+)和EpCAM(+)HCC细胞中的mRNA表达水平均明显高于CD24(-)、CD90(-)和EpCAM(-)的HCC细胞。3.通过qRT-PCR检测,发现KLF8被干扰后,两种HCC细胞系(SMMC-7721和MHCC-LM3)的EpCAM、CD24、CD90、CD133的mRNA表达水平均显著下调;利用流式细胞仪对相应HCC细胞进行分析和分选后发现,KLF8被干扰后可降低LM3细胞株中EpCAM(+)细胞的比例;通过6孔板低粘附成球实验以及体外低粘附有限稀释实验,发现KLF8(-)HCC细胞系的成球能力被显著抑制,其成球的数量明显较对照细胞系少;通过qRT-PCR检测证实在KL

关键词：肝细胞癌肝癌干细胞 KLF8蛋白耐药预后

有关国际胰腺外科研究组术后胰瘘定义与分级系统(2016版)更新解读与探讨

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中国实用外科杂志 2017年第3期37卷 259-261页

作者：白雪莉沈艺南马涛梁廷波浙江大学医学院附属第二医院肝胆胰外科浙江省胰腺病研究重点实验室浙江杭州310009

国际胰腺外科研究组(ISGPS)于2005年首次发布的术后胰瘘(POPF)定义与分级系统并受到广泛认可。目前已成为临床指导POPF诊疗的重要参考依据。2016年,ISGPS对该定义和分级系统进行了更新和修订,消除了既往版本中可能存在的"模糊"概念。新... 详细信息

国际胰腺外科研究组(ISGPS)于2005年首次发布的术后胰瘘(POPF)定义与分级系统并受到广泛认可。目前已成为临床指导POPF诊疗的重要参考依据。2016年,ISGPS对该定义和分级系统进行了更新和修订,消除了既往版本中可能存在的"模糊"概念。新版本的定义和分级更为清晰、简明,可对术后胰瘘进行更客观的评价,为广大临床医生提供更细致的参考。

关键词：国际胰腺外科研究组术后胰瘘定义分级系统

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胰腺术后乳糜瘘研究进展

中国实用外科杂志 2017年第7期37卷 808-810页

作者：郭成祥沈艺南白雪莉梁廷波浙江大学医学院附属第二医院肝胆胰外科浙江省胰腺研究重点实验室浙江杭州310009

乳糜瘘是胰腺术后常见并发症之一，发生率约10％。临床对于胰腺术后并发乳糜瘘并未给予足够的重视，不仅相关报道缺乏对照研究或局限于案例分析，且诊断标准尚无统一共识。本文对乳糜瘘的诊断、预防及治疗等方面进展做一综述。

关键词：胰腺手术乳糜瘘诊断标准预防治疗

2017美国国立综合癌症网络胰腺癌诊断与治疗指南（V1版）更新解读

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中华消化外科杂志 2017年第4期16卷 327-329页

作者：沈艺南白雪莉梁廷波浙江大学医学院附属第二医院肝胆胰外科浙江省胰腺病研究重点实验室杭州310009

胰腺癌是一类高度致死性疾病，发病率高且预后极差，相关病死率接近其发生率。基于循证医学为依据的多学科综合诊断与治疗已日渐受到重视并成为胰腺癌诊断与治疗的主要模式。美国国立综合癌症网络（NCCN）每年发布的临床实践指南，已经... 详细信息

胰腺癌是一类高度致死性疾病，发病率高且预后极差，相关病死率接近其发生率。基于循证医学为依据的多学科综合诊断与治疗已日渐受到重视并成为胰腺癌诊断与治疗的主要模式。美国国立综合癌症网络（NCCN）每年发布的临床实践指南，已经得到广泛认可和遵循，2017V1版NCCN胰腺癌诊断与治疗指南已于近期发布。该指南在2016版指南的基础上进行了多处更新和修订。笔者团队就更新部分进行解读，以期为广大临床医师提供最新的胰腺癌诊断与治疗信息。

关键词：胰腺癌诊断治疗指南解读

“第六届亚太肝胆胰学术大会”焦点荟萃及点评

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中国实用外科杂志 2017年第8期37卷 877-880页

作者：沈艺南白雪莉马涛王冀李想梁廷波浙江大学医学院附属第二医院肝胆胰外科浙江省胰腺研究重点实验室浙江杭州310009

由亚太肝胆胰协会(A-PHPBA)主办的"第六届亚太肝胆胰学术大会"于6月7日-10日在日本横滨举行。环亚太地区上千位国际知名学者共襄盛会。会议分别从临床和基础的角度探讨了肝胆胰疾病诊疗方面的最新成果。其中,尤以肝胆胰恶性肿瘤的微创... 详细信息

由亚太肝胆胰协会(A-PHPBA)主办的"第六届亚太肝胆胰学术大会"于6月7日-10日在日本横滨举行。环亚太地区上千位国际知名学者共襄盛会。会议分别从临床和基础的角度探讨了肝胆胰疾病诊疗方面的最新成果。其中,尤以肝胆胰恶性肿瘤的微创治疗、新辅助治疗以及肝脏移植领域的新进展格外引人关注。

关键词：亚太肝胆胰协会横滨

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二醋酸纤维/天丝混纺面料的生产实践

印染 2024年第6期50卷 32-34页

作者：王清树沈艺江苏天翔家纺有限公司江苏南通226600

针对二醋酸纤维与天丝纤维的特点,采用低温分散染料染二醋酸纤维、低碱活性染料染天丝的二浴法染色工艺,并结合生产关键点的控制,确保了产品质量。成品的醋酸纤维质量分数为29%,各项色牢度指标均达要求。

关键词：前处理染色混纺面料二醋酸天丝

程序性死亡⁃受体1和程序性死亡⁃配体1抑制剂与传统一线药物治疗实体瘤临床疗效的Meta分析

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中华消化外科杂志 2020年第6期19卷 666-672页

作者：姚伟云沈艺南郭成祥白雪莉梁廷波浙江大学医学院附属第二医院长兴院区长兴县人民医院普通外科浙江湖州313100 浙江大学医学院附属第一医院肝胆胰外科浙江省胰腺病研究重点实验室杭州310009

目的系统评价程序性死亡⁃受体1和程序性死亡⁃配体1(PD⁃1/PD⁃L1)抑制剂与传统一线药物治疗实体瘤的临床疗效。方法以PD⁃1/PD⁃L1、solid tumors、melanoma、non⁃small cell lung cancer、renal cell carcinoma、immunotherapy为检索词,检索PubMed、Embase、the Cochrane Library数据库。检索时间为上述数据库建库至2018年10月。纳入评价PD⁃1/PD⁃L1抑制剂与传统一线药物治疗实体瘤的随机对照研究或高质量非随机对照研究。治疗组为PD⁃1/PD⁃L1抑制剂免疫治疗,对照组为传统一线药物治疗。由2名评价者独立筛选文献并提取数据,进行质量评价。计数资料采用优势比(OR)及其95%可信区间(95%CI)表示。采用I2对纳入文献进行异质性分析。纳入文献≥5篇,采用漏斗图检验潜在发表偏倚;纳入文献0.05)。9篇文献进行漏斗图分析,其结果显示:漏斗图左右对称,表明发表偏倚对Meta分析结果影响较小。⑤治疗组与对照组患者整体不良事件和3级以上不良事件发生率比较,差异均有统计学意义(OR=0.53,0.54,95%CI为0.38~0.74,0.31~0.93,P<0.05)。11篇文献进行漏斗图分析,其结果显示:漏斗图左右对称,表明发表偏倚对Meta分析结果影响较小。结论与传统一线药物治疗比较,PD⁃1/PD⁃L1抑制剂治疗可提高实体瘤客观缓解率,降低不良事件发生率。

关键词：实体瘤 PD⁃1/PD⁃L1抑制剂一线抗肿瘤药物临床疗效 Meta分析

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肝再生终止相关分子机制的研究进展

中华肝胆外科杂志 2017年第9期23卷 637-640页

作者：陈文沈艺南白雪莉梁廷波浙江大学医学院附属第二医院肝胆胰外科浙江省胰腺研究重点实验室杭州310009

肝脏是人体内唯一可以在部分切除后完全再生，并恢复至与术前相同体积、质量的脏器。此前，相关的基础研究主要集中在肝再生的起始或增殖阶段。近年来，随着肝再生终止机制的重要性被广泛认可，相关研究也逐渐开展。探究肝再生终止机制... 详细信息

肝脏是人体内唯一可以在部分切除后完全再生，并恢复至与术前相同体积、质量的脏器。此前，相关的基础研究主要集中在肝再生的起始或增殖阶段。近年来，随着肝再生终止机制的重要性被广泛认可，相关研究也逐渐开展。探究肝再生终止机制一方面能够帮助我们进一步了解肝脏适应性生长的原理，另一方面可以更深入地探索肝再生终止过程破坏与肿瘤发生发展的潜在联系。本文就近年来有关肝切除后肝再生终止阶段相关机制的研究进展做一综述。

关键词：肝再生终止机制整合素连接激酶磷脂酰肌醇聚糖3