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胃癌细胞系SGC7901通过间充质干细胞原纤毛调控钙信号对成骨分化的影响

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中华骨质疏松和骨矿盐疾病杂志 2023年第1期16卷 23-32页

作者：陈茜李梦雪王吉春刘杰许洁汪长东重庆医科大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室分子医学与肿瘤研究中心重庆400016

目的探究胃癌细胞系SGC7901如何影响间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)成骨分化。方法分离SD大鼠乳鼠股骨,获取原代MSCs。将原代MSCs和经血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)处理的原代MSCs分别与胃黏膜细胞系GES-1和胃癌细胞系... 详细信息

目的探究胃癌细胞系SGC7901如何影响间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)成骨分化。方法分离SD大鼠乳鼠股骨,获取原代MSCs。将原代MSCs和经血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)处理的原代MSCs分别与胃黏膜细胞系GES-1和胃癌细胞系SGC7901共培养,并以成骨诱导培养基(OS培养基)诱导72 h,提取MSCs总蛋白和总RNA。对总RNA进行RNA-seq检测并对显著差异基因进行京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)和真核直系同源群(euKaryotic Ortholog Groups,KOG)可视化分析;以GAPDH为内参,Western blot检测成骨标志蛋白,钙信号相关蛋白和原纤毛结构相关蛋白表达;对共培养后获取的MSCs总蛋白进行碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性检测。结果MSCs原代培养细胞呈多角形或梭形;经过成骨诱导培养基(OS培养基)诱导,茜素红染色矿化结节呈红色;以SGC7901为对照,MSCs细胞高表达CD44,低表达CD34。与GES-1共培养相比,SGC7901共培养的MSCs中骨钙蛋白(osteocalcin,OCN)和Runx2表达均降低(P<0.01),ALP酶活力显著降低(P<0.001)。SGC7901共培养上调了MSCs中乙酰化α-微管蛋白和γ-微管蛋白表达(P<0.01)。RNA-seq分析显著差异基因共3712个,2756个基因表达上调,956个基因表达下调;SGC7901共培养的MSCs中ADRB3和PLN表达均降低(P<0.001)。经过AngⅡ处理后,SGC7901共培养抑制的Runx2和骨桥蛋白(osteopontin,OPN)表达水平增加(P<0.05),ALP酶活力增强(P<0.001)。结论胃癌细胞SGC7901通过促进MSCs原纤毛生长,抑制钙信号从而抑制MSCs成骨分化。

关键词： SGC7901 间充质干细胞成骨分化原纤毛钙信号

C反应蛋白激活原纤毛抑制颅骨成骨细胞的增殖和分化

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中国骨质疏松杂志 2021年第8期27卷 1163-1168页

作者：许洁刘杰汪长东重庆医科大学生物化学与分子生物学教研室肿瘤与分子医学中心基础医学院重庆400016

目的研究C反应蛋白(C-reactive protein,CRP)对原代培养SD大鼠乳鼠颅骨成骨细胞(rat calvarial osteoblasts,ROB)增殖及成骨分化的影响。方法取SD乳鼠颅骨组织用胰蛋白酶和胶原蛋白酶Ⅰ消化得到原代ROB,随后将ROB用α-MEM培养基培养,传... 详细信息

目的研究C反应蛋白(C-reactive protein,CRP)对原代培养SD大鼠乳鼠颅骨成骨细胞(rat calvarial osteoblasts,ROB)增殖及成骨分化的影响。方法取SD乳鼠颅骨组织用胰蛋白酶和胶原蛋白酶Ⅰ消化得到原代ROB,随后将ROB用α-MEM培养基培养,传代3次后用于后续实验。在对照组和5 mg/mL CRP的处理组中,成骨分化培养基诱导3 d进行免疫荧光检测两组Ki-67和acetylated-α-tubulin和γ-tubulin表达情况;同时,蛋白质印迹分析osteopontin(OPN)、alkaline phosphatase(ALP)、acetylated-α-tubulin和γ-tubulin的表达;成骨分化培养基诱导21 d茜素红染色检测成骨基质矿化结节量。结果免疫荧光显示,5 mg/mL CRP抑制成骨细胞增殖,与对照组差异有统计学意义(P<0.001);蛋白质免疫印迹和茜素红染色显示,处理组OPN和ALP表达降低(P<0.01),矿化结节生成数量减少(P<0.001),与对照组比较差异均有统计学意义;免疫荧光结果显示,细胞原纤毛长度增加(P<0.001),免疫印迹结果显示acetylated-α-tubulin和γ-tubulin蛋白的表达均升高(P<0.001)。结论5 mg/mL CRP显著抑制ROB增殖与成骨分化矿化并且显著激活细胞原纤毛。CRP为炎症因子典型代表,这些数据表明炎症因子激活细胞原纤毛发挥其抑制成骨细胞的增殖与分化作用,提示抑制原纤毛或阻断炎症因子的释放可以治疗炎症引起的骨丢失疾病。

关键词： C反应蛋白颅骨细胞增殖分化炎症

淫羊藿苷促进MC3T3-E1成骨分化通过Hedgehog信号通路

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中国药理学通报 2020年第5期36卷 616-620页

作者：辛红美许洁汪长东重庆医科大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室重庆400016

目的研究淫羊藿苷(icariin,ICA)对MC3T3-E1前成骨细胞系增殖和分化的影响。方法CCK-8检测MC3T3-E1细胞增殖活性;茜素红染色(AR-S)检测成骨分化和钙结节的形成;Western blot检测osteocalcin、ALP、Shh蛋白表达;测定ALP活性。结果CCK-8结... 详细信息

目的研究淫羊藿苷(icariin,ICA)对MC3T3-E1前成骨细胞系增殖和分化的影响。方法CCK-8检测MC3T3-E1细胞增殖活性;茜素红染色(AR-S)检测成骨分化和钙结节的形成;Western blot检测osteocalcin、ALP、Shh蛋白表达;测定ALP活性。结果CCK-8结果显示,ICA(5~40μmol·L^-1)组与对照组相比,显著促进MC3T3-E1细胞增殖;ICA组与对照组相比,ALP活性和蛋白表达量明显升高,且矿化沉积增多;ICA+CYC组与ICA组相比,ALP活性和Shh蛋白表达量明显下降,且茜素红染色定量明显降低。结论ICA能够通过Hedgehog信号通路促进成骨细胞增殖和分化。

关键词：淫羊藿苷成骨 Hedgehog信号通路骨钙素碱性磷酸酶细胞增殖细胞分化

高糖损害小鼠胚胎成骨前体细胞糖代谢并通过原纤毛/Hedgehog信号通路抑制成骨分化的研究

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中国糖尿病杂志 2021年第11期29卷 836-842页

作者：刘杰许洁陈茜汪长东重庆医科大学基础医学院 400016

目的研究高糖对小鼠胚胎成骨前体细胞(MC3T3-E1)增殖、成骨分化和糖代谢影响。方法 MC3T3-E1细胞予5.6 mmol/L(Con组)、25.0 mmol/L(HG组)葡萄糖浓度的α-MEM培养。CCK-8、Ki67免疫荧光检测细胞增殖,免疫荧光检测原纤毛;ELISA检测碱性... 详细信息

目的研究高糖对小鼠胚胎成骨前体细胞(MC3T3-E1)增殖、成骨分化和糖代谢影响。方法 MC3T3-E1细胞予5.6 mmol/L(Con组)、25.0 mmol/L(HG组)葡萄糖浓度的α-MEM培养。CCK-8、Ki67免疫荧光检测细胞增殖,免疫荧光检测原纤毛;ELISA检测碱性磷酸酶(ALP)活力;Western blot检测ALP、骨桥蛋白(OPN)、乙酰化α-tubulin(Ac-α-tubulin)、γ-tubulin、印度/音/沙漠刺猬信号分子(IHH,SHH,DHH)、神经胶质瘤相关癌基因(Gli1/Gli2)、糖原合酶1(GYS1)、GluT4、磷酸果糖激酶(PFKM)、乙酰-CoA羧化酶α(ACACA)、糖原磷酸化酶(PYGL)、丙酮酸脱氢酶磷酸酶1(PDP1)蛋白表达;茜素红染色检测矿化结节。结果与Con组比较,HG组Ki67阳性率升高[(13.85±2.28)%vs(30.23±3.83)%,P<0.01],矿化结节形成受抑制(P<0.01),ALP酶活力降低(P<0.01),ALP、OPN、Gli2、IHH、SHH、GYS1、ACACA、PFKM、GluT4、Ac-α-tubulin、γ-tubulin蛋白表达减低(P<0.05或P<0.01),PYGL、PDP1表达升高(P<0.05或P<0.01),原纤毛Ac-α-tubulin和γ-tubulin平均荧光强度降低(P<0.05或P<0.01)。结论高糖促进MC3T3-E1细胞增殖,损害糖代谢机制,破坏原纤毛,阻断Hedgehog信号,抑制成骨分化和矿化。

关键词：高糖成骨分化原纤毛糖代谢

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IFT20蛋白在不同肿瘤组织中表达的研究

中国肿瘤临床 2012年第12期29卷 841-843页

作者：姜容刘贵勇陈鹏汪长东重庆医科大学干细胞与组织工程研究室重庆市400016 重庆市巴南区人民医院手足外科广西大学农学院重庆医科大学医学分子与肿瘤研究中心生物化学与分子生物学教研室

目的:探讨IFT20(Intraflagellar Transport,IFT)蛋白在人卵巢癌、肺癌、胰腺癌、小肠癌、前列腺癌、骨癌、胃癌和乳腺癌癌组织和癌旁组织的表达分布情况,为人类肿瘤的诊断和治疗寻找新的靶点。方法:采用免疫组织化学方法,研究IFT20蛋白... 详细信息

目的:探讨IFT20(Intraflagellar Transport,IFT)蛋白在人卵巢癌、肺癌、胰腺癌、小肠癌、前列腺癌、骨癌、胃癌和乳腺癌癌组织和癌旁组织的表达分布情况,为人类肿瘤的诊断和治疗寻找新的靶点。方法:采用免疫组织化学方法,研究IFT20蛋白在人的八种癌组织和癌旁组织的表达。结果:结果发现,IFT20蛋白在卵巢癌组织中大量表达,在卵巢癌癌旁组织低量表达。IFT20蛋白在小肠癌,胃癌和乳腺癌组织中中量表达,在小肠癌,胃癌和乳腺癌癌旁组织中低量表达。IFT20蛋白在胰腺癌,骨癌,肺癌癌组织中低量表达,在胰腺癌、骨癌、肺癌癌旁组织中几乎不表达。IFT20蛋白在前列腺癌组织和癌旁组织中均未见表达。结论:实验结果证实,IFT20蛋白可能经过多种途径直接或间接调节卵巢癌、肺癌、胰腺癌、小肠癌、骨癌、胃癌和乳腺癌的发生,发展过程,并且IFT20可能是卵巢癌、肺癌、胰腺癌、小肠癌、骨癌、胃癌和乳腺癌肿瘤药物治疗的潜在靶点。

关键词：细胞原纤毛免疫组织化学 IFT20 肿瘤

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核酸嘌呤碱鉴定实验改进分析

化工设计通讯 2022年第10期48卷 116-117,170页

作者：赵雨彤朱彩瑜汪长东重庆医科大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室分子医学与肿瘤研究中心重庆400016

通过对核酸中嘌呤碱鉴定实验中,对照组出现黑色颗粒状沉淀的现象进行分析,探究滴加试剂后混合体系中发生的反应和出现黑色颗粒状沉淀的原因,并且通过各反应平衡的建立与移动定量地分析实验中氨水用量与对照组实验现象的关系,为核酸鉴定... 详细信息

通过对核酸中嘌呤碱鉴定实验中,对照组出现黑色颗粒状沉淀的现象进行分析,探究滴加试剂后混合体系中发生的反应和出现黑色颗粒状沉淀的原因,并且通过各反应平衡的建立与移动定量地分析实验中氨水用量与对照组实验现象的关系,为核酸鉴定实验中确定试剂用量提供借鉴。

关键词：嘌呤碱鉴定 Ksp 氨水

低电导钙激活的钾通道(rSK3，rIK)抑制露蜂房蛋白1(NVP(1))抗细胞增殖作用

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中国药理学通报 2009年第5期25卷 577-580页

作者：汪长东陈鹏闫旭何光源华中科技大学生科院中英联合实验室国家教育部重点实验室湖北武汉430074

目的研究rSK3,rIK通道在细胞增殖中的作用。方法用凝胶层析和液相色谱从露蜂房水提物中分离一种纯蛋白,并检测此蛋白的抗细胞增殖作用;转染;Southern blot检测rSK3,rIK基因;细胞计数检测SK通道在细胞增殖中的作用。结果从露蜂房水提物... 详细信息

目的研究rSK3,rIK通道在细胞增殖中的作用。方法用凝胶层析和液相色谱从露蜂房水提物中分离一种纯蛋白,并检测此蛋白的抗细胞增殖作用;转染;Southern blot检测rSK3,rIK基因;细胞计数检测SK通道在细胞增殖中的作用。结果从露蜂房水提物中分离一种纯蛋白,分子量为6.6 ku,命名为NVP(1),能抑制Hek-293细胞增殖。Southern blot检测转基因rSK3,rIK成功。转rSK3,rIK基因后,能消减NVP(1)抗细胞增殖的作用。结论rSK3,rIK促进细胞增殖。

关键词： rsK3 rIK 细胞增殖

AdEasy重组腺病毒系统对Ad-HIF1α的构建和鉴定

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中国生物工程杂志 2014年第3期34卷 34-40页

作者：周年胡宁龚璇汪长东廖军义梁熙黄伟重庆医科大学附属第一医院重庆400016 重庆市中山医院(第十二人民医院) 重庆400020 重庆医科大学医学基础医学院重庆400016

目的:采用AdEasy重组腺病毒系统构建重组腺病毒Ad-HIF1α并进行鉴定。方法:使用高保真PCR从EST克隆中扩增HIF1α基因编码区,并用限制性内切酶BamH I和Xba I对PCR片段限制性酶切,用T4 DNA连接酶将其连接至同样经BamH I和Xba I限制性酶切... 详细信息

目的:采用AdEasy重组腺病毒系统构建重组腺病毒Ad-HIF1α并进行鉴定。方法:使用高保真PCR从EST克隆中扩增HIF1α基因编码区,并用限制性内切酶BamH I和Xba I对PCR片段限制性酶切,用T4 DNA连接酶将其连接至同样经BamH I和Xba I限制性酶切的穿梭载体pAdtrace-TO4,构建穿梭载体pAdtrace-HIF1α;将pAdtrace-HIF1α与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1在细菌BJ5183中同源重组,得到重组腺病毒质粒pAd-HIF1α;pAd-HIF1α经Pac I酶切后转染至E1表达包装细胞系HEK293中进行HIF1α基因表达腺病毒包装,重复扩增,氯化铯密度梯度离心法纯化,获得高滴度Ad-HIF1α;感染干细胞株C3H10T1/2,通过荧光蛋白的表达了解其感染效率,并应用PCR及Western blot验证目的基因的表达,并通过检测下游靶基因VEGF的表达,了解该载体表达的目的蛋白的生物活性。结果:重组腺病毒质粒pAd-HIF1α,经PCR及酶切分析验证构建正确;在HEK293中进行HIF1α基因表达腺病毒包装,经反复冻融4次使细胞裂解,获得高滴度重组腺病毒载体;通过红色荧光蛋白(Red fluorescence protein,RFP)表达,观察到Ad-HIF1α能够高效感染C3H10T1/2细胞,并通过PCR证实了HIF1α在C3H10T1/2细胞较对照组明显高表达;在感染Ad-HIF1α的C3H10T1/2细胞中,HIF-1α下游靶基因血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表达明显增高,证实表达的目的蛋白具有生物活性。结论:应用AdEasy重组腺病毒系统成功构建Ad-HIF1α,并证实其具有生物活性,为后续研究奠定了基础。

关键词：低氧诱导因子1α 重组腺病毒血管内皮生长因子

单羧酸转运蛋白基因过表达对MDA-MB-231乳腺癌细胞生物学行为的影响

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细胞与分子免疫学杂志 2014年第1期30卷 37-41页

作者：马冬梅麦力吴晓彬汪长东余畅李海玉李韵高月宋方洲重庆医科大学生物化学与分子生物学教研室分子医学肿瘤研究中心重庆医科大学生物化学与分子生物学教研室分子肿瘤中心教研室

目的研究单羧酸转运蛋白(MCT)基因过表达对乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡、细胞周期、侵袭和转移能力的影响。方法将真核表达质粒pcDNA3.1/MCT及空质粒pcDNA3.1分别转染乳腺癌MDA-MB-231细胞。采用实时定量PCR(qRTPCR)和Western blot法分别... 详细信息

目的研究单羧酸转运蛋白(MCT)基因过表达对乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡、细胞周期、侵袭和转移能力的影响。方法将真核表达质粒pcDNA3.1/MCT及空质粒pcDNA3.1分别转染乳腺癌MDA-MB-231细胞。采用实时定量PCR(qRTPCR)和Western blot法分别检测转染后细胞内MCT基因的表达。Annexin V-FITC/PI染色和PI单染色结合流式细胞术检测MCT基因过表达对乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡、细胞周期的影响,Transwell实验检测MCT基因过表达对乳腺癌MDA-MB-231细胞侵袭能力的影响,划痕实验检测MCT基因过表达对乳腺癌MDA-MB-231细胞迁移能力的影响。结果实验组MCT的mRNA和蛋白水平明显高于转染空质粒的阴性对照组和未处理组;MCT过表达能促进乳腺癌MDA-MB-231细胞的凋亡,G2期细胞减少、S期细胞增多,同时能抑制癌细胞的侵袭和迁移能力。结论 MCT基因过表达能促进MDA-MB-231细胞的凋亡、调节细胞G2/M期检控点,抑制细胞的侵袭和迁移能力。

关键词： MCT MDA-MB-231 凋亡周期侵袭迁移