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半枝莲化学成分和抗肿瘤活性的初步研究

半枝莲化学成分和抗肿瘤活性的初步研究

作者：汪铁山南方医科大学

学位级别：硕士

目的半枝莲为唇形科黄芩属植物半枝莲（Scutellaria barbata）的干燥全草,是中医处方和成药中的常用中药材,临床上常与其他中草药配伍治疗原发性肝癌、肺癌、胃癌、鼻咽癌、妇科肿瘤。半枝莲全草含黄酮类、二萜、生物碱、甾体、多... 详细信息

目的半枝莲为唇形科黄芩属植物半枝莲（Scutellaria barbata）的干燥全草,是中医处方和成药中的常用中药材,临床上常与其他中草药配伍治疗原发性肝癌、肺癌、胃癌、鼻咽癌、妇科肿瘤。半枝莲全草含黄酮类、二萜、生物碱、甾体、多糖、挥发油、有机酸等化学成分,能否得到合理有效利用,关键在于对其化学成分的药理活性及作用机理研究。近年来,国内外学者对半枝莲抗肿瘤活性的研究结果表明半枝莲粗提取物体外对多种肿瘤细胞增殖具有抑制作用,但其粗提取物中所含化学成分与抗肿瘤活性的关系尚不明确,缺乏对半枝莲生物活性物质基础及作用机制的研究。此外,大量研究表明植物中所含的某些生物碱类化合物具有明显的抗肿瘤活性。因此,本课题对半枝莲生物碱提取物（Alkaloid Extract of Scutellaria barbata, AESB）的体外抗肿瘤活性进行研究,旨在阐明AESB对人肝癌HepG-2细胞和人鼻咽癌CNE-1细胞的体外增殖抑制作用及其可能作用机制;并对AESB所含化学成分进行分离,以期得到具有抗肿瘤活性的单体化合物,从而为更好地开发和利用中草药半枝莲提供理论依据。方法 ***溶液的制备半枝莲干燥地上部分,粉碎,过筛,酸性乙醇（12 mol/L HCl-95% EtOH,2：100,V/V）浸泡72 h,超声波提取3次,每次45 min,提取液减压抽滤后于旋转蒸发仪上减压浓缩至浸膏状,将浸膏用2%稀盐酸溶液混悬,静置过夜,减压抽滤后合并滤液于分液漏斗中氨水调PH=I0,氯仿萃取至萃取液无生物碱反应为止,合并氯仿萃取液,减压浓缩即得半枝莲粗生物碱浸膏;将半枝莲粗生物碱浸膏再次用2%稀盐酸溶液溶解,氨水调PH=10,氯仿萃取至萃取液无生物碱反应为止,合并氯仿萃取液减压浓缩即得AESB。电子天平称取0.30 g AESB,2%稀盐酸溶液溶解,稀NaOH溶液调PH=7.4,生理盐水稀释至10 mL,于超净台中用0.22μm微孔滤膜过滤除菌即得30 mg/mL原药液,备用。实验前用含10%小牛血清的RPMI-1640培养基分别稀释至终浓度为0.75、1.0、1.5和2.0 mg/mL。 2.细胞培养人肝癌HepG-2细胞和人鼻咽癌CNE-1细胞均用含10%小牛血清的RPMI-1640培养基（内含100 U/mL青霉素和100 U/mL链霉素）,置于37℃,5%CO2培养箱中常规培养,隔天换液,待培养瓶中细胞生长至约80%融和时,进行传代培养。 ***法测定HepG-2和CNE-1细胞的生长抑制率取对数生长期的HepG-2和CNE-1细胞,胰酶消化后混悬于含10%小牛血清的RPMI-1640培养基中,细胞计数板计数调整细胞密度为1×105个/mL,接种于96孔板中,每孔100μL,置37℃,5%C02的培养箱中培养。待24 h细胞完全贴壁后,吸弃96孔板内原培养基,PBS洗涤2遍,每孔加90μL新鲜培养基,试验组加入10μL不同浓度的AESB溶液（终质量浓度分别为0.75、1.0、1.5和2.0 mg/mL）,阳性组加入10μL生理盐水稀释的5-FU溶液（终质量浓度为250μg/mL）,阴性组加入等体积生理盐水,每个组设3个平行复孔,分别培养24、48、72和96h;到各时间点后取出,吸弃原培养基,每孔加入90μL新鲜培养基,然后加入10μL MTT溶液,继续培养4h,小心吸弃96孔板内上清液,每孔加入150μL DMSO溶液,轻微震荡10 min使结晶充分溶解后于酶标仪570nm波长处测定各孔OD值,计算细胞生长抑制率。细胞生长抑制率（%）=（阴性组OD值-试验组OD值）/阴性组OD值×100%。 4. Annexin V-FITC/PI双染检测HepG-2和CNE-1细胞早期凋亡率取对数生长期的HepG-2和CNE-1细胞,胰酶消化后混悬于含10%小牛血清的RPMI-1640培养基中,细胞计数板计数调整细胞密度为2×105个/mL,接种于6孔板中,每孔2 mL,置37℃,5%CO2的培养箱中培养。待24 h细胞完全贴壁后,吸弃6孔板内原培养基,PBS洗涤2遍,每孔加180μL新鲜培养基,试验组加入20μLAESB溶液（终质量浓度为0.75 mg/mL）,阳性组加入20μL生理盐水稀释的5-FU溶液（终质量浓度为250μg/mL）,阴性组加入等体积生理盐水;细胞继续培养48小时后,吸出原培养基置于离心管中,胰酶（不含EDTA）消化贴壁细胞成单细胞悬液,倒入离心管,PBS洗涤6孔板2次,1000 rpm离心5 min,弃上清,PBS洗涤2次,细胞按Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒操作步骤处理后,于流式细胞仪检测细胞早期凋亡率。 5.流式细胞仪检测

关键词：半枝莲抗肿瘤活性化学成分

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小油桐叶中总多酚的含量测定

南方医科大学学报 2010年第6期30卷 1321-1322页

作者：龚文菲汪铁山林敬明南方医科大学珠江医院药剂科广东广州510282

目的建立小油桐叶中总多酚的含量测定方法。方法以没食子酸为对照品,采用Folin-Ciocalteu比色法最适宜条件下对小油桐叶中总多酚含量进行测定。结果没食子酸对照品在浓度为0.002~0.010 g.L-1范围内与吸光度成良好的线性关系;小油桐叶片... 详细信息

目的建立小油桐叶中总多酚的含量测定方法。方法以没食子酸为对照品,采用Folin-Ciocalteu比色法最适宜条件下对小油桐叶中总多酚含量进行测定。结果没食子酸对照品在浓度为0.002~0.010 g.L-1范围内与吸光度成良好的线性关系;小油桐叶片中总多酚含量为6.74%,RSD为0.75%;样品溶液在10~90 min内基本稳定（RSD=0.28%）;精密度试验RSD为0.23%;重复性实验RSD为1.01%;平均回收率为99.85%。结论该法灵敏度高,重复性好,简便快捷。

关键词：小油桐多酚含量测定

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半枝莲总多酚含量测定与超声提取工艺研究

中药材 2010年第11期33卷 1808-1810页

作者：汪铁山张生潭陈莉婧林敬明南方医科大学珠江医院药剂科广东广州510282

目的：建立半枝莲总多酚含量测定方法,并优选其超声提取工艺;方法：以没食子酸为标准品,采用酒石酸亚铁分光光度法,在波长540 nm处测定半枝莲总多酚含量,并以其为考察指标,通过L9（34）正交试验优选超声法提取半枝莲总多酚的最佳工艺;... 详细信息

目的：建立半枝莲总多酚含量测定方法,并优选其超声提取工艺;方法：以没食子酸为标准品,采用酒石酸亚铁分光光度法,在波长540 nm处测定半枝莲总多酚含量,并以其为考察指标,通过L9（34）正交试验优选超声法提取半枝莲总多酚的最佳工艺;结果：没食子酸浓度在0.01~0.05 mg/mL范围内与吸光度呈良好的线性关系（r=0.99985）,半枝莲总多酚含量为1.46%;最佳提取工艺条件为：乙醇浓度60%,料液比1∶35,超声时间45 min,提取次数3次。结论：该含量测定方法简便、准确,优选出的最佳工艺条件经验证其结果比较可靠。

关键词：半枝莲总多酚含量测定提取工艺

正交试验优选春砂仁挥发油羟丙基-β-环糊精包合工艺

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中国药房 2011年第3期22卷 225-228页

作者：张生潭张帆汪铁山林敬明南方医科大学珠江医院药剂科广州市510282 南方医科大学珠江医院皮肤科广州市510282

目的:研究羟丙基-β-环糊精(HP-β-CD)包合春砂仁挥发油的最佳工艺,并进行包合物鉴定。方法:以挥发油利用率、包合物含油率与最高含油率比值和包合物收率的综合得分为评价指标,对搅拌法、超声法和研磨法进行优选;以挥发油与HP-β-CD的... 详细信息

目的:研究羟丙基-β-环糊精(HP-β-CD)包合春砂仁挥发油的最佳工艺,并进行包合物鉴定。方法:以挥发油利用率、包合物含油率与最高含油率比值和包合物收率的综合得分为评价指标,对搅拌法、超声法和研磨法进行优选;以挥发油与HP-β-CD的投料比、HP-β-CD的浓度、包合时间、包合温度为考察因素,上述综合得分为评价指标,采用正交试验优选最佳包合工艺,并通过显微鉴别、差示扫描量热分析、紫外分光光度、气相色谱质谱联用等方法对包合前、后的包合物进行鉴别。结果:最佳包合方法为超声法,最佳包合工艺条件为挥发油与HP-β-CD的投料比为1:10(V:m),HP-β-CD的浓度为40%,包合时间80min,包合温度55℃。包合前、后成分未见明显变化。结论:春砂仁挥发油的HP-β-CD包合工艺切实可行,可为实际生产研究提供一定的试验依据。

关键词：春砂仁挥发油羟丙基-β-环糊精包合物制备工艺

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油柑叶挥发油的GC-MS分析

南方医科大学学报 2009年第5期29卷 1085-1086页

作者：董勤杜延琪张生潭汪铁山龚文菲林敬明南方医科大学珠江医院药剂科广东广州510282

目的采用GC-MS对油柑叶挥发油成分进行分析。方法以水蒸气蒸馏法提取中药油柑叶中的挥发油,然后经毛细管色谱柱进行分离,用归一化法计算含量。结果从油柑叶挥发油中分离出58个成分,其中鉴定出35个,其主要成分分别为异植物醇(2.64%)、硬... 详细信息

目的采用GC-MS对油柑叶挥发油成分进行分析。方法以水蒸气蒸馏法提取中药油柑叶中的挥发油,然后经毛细管色谱柱进行分离,用归一化法计算含量。结果从油柑叶挥发油中分离出58个成分,其中鉴定出35个,其主要成分分别为异植物醇(2.64%)、硬脂酸(9.24%)、十四烷酸(41.34%)、叶绿醇(2.67%)、反亚麻酸(14.14%)及亚麻酸(10.61%),占挥发油总含量的78.64%。结论油柑叶挥发油中的主要成分为脂肪酸类,与余甘籽油的成分有一定相似。

关键词：油柑叶挥发油气相色谱-质谱联用

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半枝莲全草挥发油的GC-MS分析

南方医科大学学报 2009年第7期29卷 1482-1483页

作者：王兆玉汪铁山陈飞龙林敬明广东药学院生命科学与生物制药学院广东广州510006 南方医科大学珠江医院药剂科广东广州510282 南方医科大学中医药学院广东广州510515

目的分析中草药半枝莲(Scutellaria barbata)全草挥发油的成分。方法采用2005年版《中国药典》附录ⅩD甲法提取半枝莲全草的挥发油成分;然后通过气相色谱-质谱法(GC-MS)进行成分分析,并用归一化法计算各成分相对含量。结果共分析得到83... 详细信息

目的分析中草药半枝莲(Scutellaria barbata)全草挥发油的成分。方法采用2005年版《中国药典》附录ⅩD甲法提取半枝莲全草的挥发油成分;然后通过气相色谱-质谱法(GC-MS)进行成分分析,并用归一化法计算各成分相对含量。结果共分析得到83个峰,确定了其中的54种化合物(占65.06%);其中含量占1%以上的有11种化合物,总相对含量为70.21%。含量最为丰富的三种物质依次为:棕榈酸,占34.07%;亚油酸,占13.21%;叶绿醇,占5.90%。结论本研究比前人确认了更多的半枝莲全草挥发油的成分,这将为进一步开发半枝莲的药用价值提供有益参考。

关键词：半枝莲挥发油 GC-MS

春砂仁挥发油羟丙基-β-环糊精包合物的稳定性及增溶作用研究

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中国实验方剂学杂志 2011年第4期17卷 53-56页

作者：张生潭汪铁山林敬明南方医科大学珠江医院药剂科广州510282

目的:考察砂仁挥发油包合物的稳定性及羟丙基-β-环糊精对挥发油的增溶作用。方法:以乙酸龙脑酯和樟脑的为考察指标,采用HPLC测定包合物及物理混合物中乙酸龙脑酯及樟脑的含量,在高温高湿及强光照的条件下进行试验,并采用相溶解度法测... 详细信息

目的:考察砂仁挥发油包合物的稳定性及羟丙基-β-环糊精对挥发油的增溶作用。方法:以乙酸龙脑酯和樟脑的为考察指标,采用HPLC测定包合物及物理混合物中乙酸龙脑酯及樟脑的含量,在高温高湿及强光照的条件下进行试验,并采用相溶解度法测定羟丙基-β-环糊精对挥发油的增溶作用。结果:在高温高湿及强光照条件下,包合物中乙酸龙脑酯及樟脑的含量均明显高于物理混合物中的两种成分的含量,增溶试验显示羟丙基-β-环糊精在50%浓度下可提高挥发油的溶解度约35倍。结论:包合物抗高温、高湿、强光照较物理混合物强,且羟丙基-β-环糊精可明显增加砂仁挥发油的溶解度。

关键词：砂仁包合物高效液相色谱法稳定性增溶作用

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鄂州市啤酒厂还建楼地面塌陷形成机理研究

中国水运（下半月） 2013年第5期13卷 258-260页

作者：汪铁山王玲高洋周蒙湖北省地质环境总站黄石站湖北黄石435000

通过对鄂州市啤酒厂还建楼地面塌陷勘查,查明了区内塌陷区水文地质条件、地面塌陷形态特征,对地面塌陷形成机理进行了研究,即为溶洞→扰动土层→地表水下渗掏蚀→振动、荷载效应致塌的塌陷模式,可为类似条件下塌陷预测及防治提供借鉴。

关键词：还建楼地面塌陷扰动土层形成机理

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水蒲桃种子总多酚提取工艺的响应曲面法优化

中国实验方剂学杂志 2011年第17期17卷 41-44页

作者：郑妮张生潭汪铁山林敬明南方医科大学珠江医院药剂科广州510282

目的:确定水蒲桃种子总多酚超声提取的最佳工艺条件。方法:以总多酚含量为指标,采用响应面法对主要工艺参数进行优化并得到回归模型。结果:当提取溶剂乙醇的体积分数38%,提取时间32 min,液料比47∶1时,在此工艺条件下的总多酚提取率为16... 详细信息

目的:确定水蒲桃种子总多酚超声提取的最佳工艺条件。方法:以总多酚含量为指标,采用响应面法对主要工艺参数进行优化并得到回归模型。结果:当提取溶剂乙醇的体积分数38%,提取时间32 min,液料比47∶1时,在此工艺条件下的总多酚提取率为16.32%。结论:响应面分析法回归模型的预测值与实测值的相对误差为0.7%,该回归方程与实际情况拟合较好。

关键词：水蒲桃种子总多酚提取响应面分析