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表达传染性支气管炎病毒S1重组腺病毒的构建及免疫原性分析

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中国病原生物学杂志 2024年第7期19卷 751-755页

作者：何杰珩袁子岚程晴梁志鹏张新宇陈高婕池仕红袁生郭锦玥黄淑坚温峰佛山科学技术学院生命科学与工程学院广东佛山528225

目的构建表达传染性支气管炎病毒S1蛋白的重组腺病毒,并进行初步免疫原性分析。方法本研究利用腺病毒表达载体系统,利用同义点突变技术,消除IBV-S1基因中的PacⅠ和PmeⅠ限制性酶切位点;将已突变的S1基因克隆至pShuttle-CMV-N-DsRed穿... 详细信息

目的构建表达传染性支气管炎病毒S1蛋白的重组腺病毒,并进行初步免疫原性分析。方法本研究利用腺病毒表达载体系统,利用同义点突变技术,消除IBV-S1基因中的PacⅠ和PmeⅠ限制性酶切位点;将已突变的S1基因克隆至pShuttle-CMV-N-DsRed穿梭质粒中;使用Pme I线性化处理携带目的基因的穿梭质粒,并与pAdEasy-1质粒同时转化进行同源重组;后将重组质粒转染HEK 293细胞,包装成重组Adv,构建S1-CMV-pAd(293)重组病毒;并进行免疫实验验证抗体。结果 PCR扩增出S1基因,大小约为1 700 bp。S1和pShuttle-CMV-N-DsRed穿梭质粒经酶切及测序结果表明,成功构建S1-CMV表达载体;在BJ5183感受态中进行同源重组,测序结果表明成功构建S1-CMV-Pad重组质粒。利用HEK-293细胞包装成重组腺病毒,能稳定产生红色荧光;经Western blot和IFA验证重组病毒成功表达S1 (RBD)蛋白;以106TCID50/mL滴度肌肉免疫雏鸡,7~21 d后均可检测到S1抗体,且抗体浓度仍呈增长趋势。结论本研究所构建的S1-CMV-pAd重组Adv为之后的免疫保护试验研究及IBV-Adv疫苗构建提供了基础实验支撑。

关键词：传染性支气管炎病毒 S1 腺病毒载体重组病毒

三源重组H9N2亚型禽流感病毒NA蛋白原核表达及多克隆抗体制备

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中国病原生物学杂志 2024年第6期19卷 625-630页

作者：梁志鹏刘静刘闰栀张新宇何杰珩陈高婕闫战飞池仕红袁生郭锦玥梁昭平黄淑坚温峰佛山科学技术学院生命科学与工程学院广东佛山528225 华南农业大学兽医学院

目的利用原核表达系统表达华南地区分离的三源重组H9N2亚型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)的神经氨酸酶(NA)蛋白,并制备兔多克隆抗体。方法将1株H9N2亚型AIV的NA基因克隆到pET-32a载体,构建NA原核表达质粒,并转化至*** Rosetta(... 详细信息

目的利用原核表达系统表达华南地区分离的三源重组H9N2亚型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)的神经氨酸酶(NA)蛋白,并制备兔多克隆抗体。方法将1株H9N2亚型AIV的NA基因克隆到pET-32a载体,构建NA原核表达质粒,并转化至*** Rosetta(DE3)感受态细胞进行蛋白表达。优化IPTG浓度、诱导时间和温度,提高蛋白表达量。利用镍柱纯化重组NA蛋白,并免疫新西兰兔,制备兔抗NA蛋白多克隆抗体通过Western blot和间接免疫荧光试验(Indirect immunofluorescence assay,IFA)验证多克隆抗体的特异性。通过间接酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)测定多克隆抗体的效价。结果成功构建了pET-32a-H9N2-NA原核表达质粒;经SDS-PAGE和Western blot验证,表达的重组NA蛋白大小约70 ku,符合预期;对诱导条件进行优化,确定37℃,终浓度为1.2 mmol/L的IPTG,诱导时长6 h为最佳条件;制备的兔抗NA蛋白多克隆抗体的Western blot和IFA的结果显示,该多克隆抗体能和H9N2亚型AIV结合,特异性好;间接ELISA测得兔抗NA蛋白多克隆抗体的效价达到了1∶409600。结论本研究表达的NA蛋白,制备的兔抗NA蛋白多克隆抗体具有特异性,效价高,为NA蛋白的ELISA检测方法的建立和疫苗研制提供帮助。

关键词：禽流感病毒 H9N2亚型神经氨酸酶原核表达多克隆抗体

H5N8亚型禽流感病毒HA蛋白的原核及真核表达及兔多克隆抗体的制备

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中国病原生物学杂志 2024年第7期19卷 745-750页

作者：刘静王聪颖梁志鹏梁昭平刘闰栀张新宇何杰珩陈高婕闫战飞池仕红袁生郭锦玥黄淑坚温峰佛山科学技术学院生命科学与工程学院广东佛山528225 华南农业大学兽医学院

目的构建H5N8亚型禽流感病毒(Avian influenza virus, AIV)HA基因的原核和真核表达载体,分别在*** Rosetta(DE3)和Sf9中进行表达,并制备兔多克隆抗体。方法采用RT-PCR扩增H5N8亚型AIV的HA基因,并将其克隆至原核表达载体pTac-His-MBP-P... 详细信息

目的构建H5N8亚型禽流感病毒(Avian influenza virus, AIV)HA基因的原核和真核表达载体,分别在*** Rosetta(DE3)和Sf9中进行表达,并制备兔多克隆抗体。方法采用RT-PCR扩增H5N8亚型AIV的HA基因,并将其克隆至原核表达载体pTac-His-MBP-PreScission中,再转化至Rosetta(DE3)中,利用IPTG诱导表达。通过SDS-PAGE及蛋白免疫印迹(Western blot, WB)鉴定HA蛋白的表达,并优化IPTG浓度、诱导时间和温度以提高表达效率。将纯化的重组蛋白免疫新西兰大白兔,制备兔抗H5N8亚型AIV的HA蛋白多克隆抗体,通过酶联免疫吸附实验(Enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)检测其特异性和效价。同时,将HA基因克隆到真核表达载体pFastBacHTA中,将其瞬时转染Sf9细胞并扩增3代,最后通过WB和间接免疫荧光试验(Indirect immunofluorescence assay, IFA)验证表达产物。结果成功构建了HA基因的原核重组质粒pTac-HA-DE3和真核重组质粒pFast-HA。经SDS-PAGE及WB验证该蛋白分子质量约110 ku,最佳表达条件为IPTG浓度为0.8 mmol/L、温度37℃和诱导时间为4 h。ELISA检测显示兔多克隆抗体效价为1∶102 400。成功将真核重组质粒pFast-HA转化入DH10Bac感受态细胞中,证明HA基因成功转座。Bacmid-HA转染Sf9细胞后观察到细胞病变,WB和IFA检测表明重组杆状病毒Bac-HA感染的Sf9细胞能够表达HA蛋白。结论本研究初步探究了H5N8亚型AIV HA蛋白的表达条件及免疫原性,并且具有良好的免疫原性和反应原性,为后续建立ELISA诊断试剂盒及H5N8 AIV疫苗的研制提供了一定的参考价值。

关键词：禽流感病毒 H5N8亚型 HA蛋白原核表达真核表达多克隆抗体

中草药饲料添加剂在母猪生产中应用的研究进展

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饲料研究 2022年第24期45卷 127-130页

作者：周鹏宋晨池仕红冯军佛山科学技术学院动物医学系广东佛山528200

中草药是一种安全、绿色和高效的饲料添加剂,可以补充动物机体营养成分,调节生殖激素分泌,促进生殖器官发育,增强免疫力,改善母猪体质,提高养殖的经济效益。文章综述中草药饲料添加剂的生物学功能,阐述其对母猪繁殖性能、免疫功能及血... 详细信息

中草药是一种安全、绿色和高效的饲料添加剂,可以补充动物机体营养成分,调节生殖激素分泌,促进生殖器官发育,增强免疫力,改善母猪体质,提高养殖的经济效益。文章综述中草药饲料添加剂的生物学功能,阐述其对母猪繁殖性能、免疫功能及血清抗氧化性能的影响,分析中草药饲料添加剂在母猪生产中存在的问题,旨在为中草药饲料添加剂在母猪日粮中推广应用提供参考。

关键词：中草药母猪繁殖性能免疫功能抗氧化功能

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中药提取工艺研究进展

中兽医医药杂志 2022年第5期41卷 37-43页

作者：周鹏宋晨池仕红冯军佛山科学技术学院动物医学系广东佛山528200

随着中药行业的发展,提取技术也变得多元化。因为中药所含的成分十分复杂,物理性质和化学性质也都不尽相同,并要结合生产实际考虑生产成本等问题,所以只有进行综合比较,才能确定最佳的提取方案,尽可能地满足生产成本低、实际应用价值高... 详细信息

随着中药行业的发展,提取技术也变得多元化。因为中药所含的成分十分复杂,物理性质和化学性质也都不尽相同,并要结合生产实际考虑生产成本等问题,所以只有进行综合比较,才能确定最佳的提取方案,尽可能地满足生产成本低、实际应用价值高和保留中药药性及提高中药有效成分提取量四者之间的平衡。传统提取工艺有煎煮法、浸渍法、回流法、渗漉法和发酵法,现代提取工艺有超声法辅助提取、微波法辅助提取、超临界流体萃取技术、半仿生酶提取技术和高速逆流色谱分离技术等。传统提取工艺设备要求低,但存在提取物质不纯且溶剂消耗量大等问题;与传统提取工艺相比,现代提取工艺具有提取物纯度高、药效保留充分等优势,同时存在前期资金投入量大、技术理论不完善等问题。本文对中药传统提取技术与现代技术比较分析,阐述提取技术的原理及在实际当中的应用和自身优缺点,旨在为后续提取工艺的研究发展提供理论依据。

关键词：中药有效成分提取技术提取工艺

三源重组H9N2禽流感病毒血凝素蛋白兔多克隆抗体的制备及鉴定

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中国病原生物学杂志 2023年第8期18卷 881-885页

作者：程晴梁志鹏何杰珩池仕红袁生郭锦玥黄淑坚温峰佛山科学技术学院生命科学与工程学院广东佛山528225

目的表达一株华南地区新发的三源重组H9N2亚型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)的血凝素(HA)蛋白,并制备多克隆抗体。方法通过RT-PCR技术扩增华南地区分离的H9N2亚型AIV HA基因,并克隆至pET-32a载体。将重组pET-32a-HA质粒转化到*... 详细信息

目的表达一株华南地区新发的三源重组H9N2亚型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)的血凝素(HA)蛋白,并制备多克隆抗体。方法通过RT-PCR技术扩增华南地区分离的H9N2亚型AIV HA基因,并克隆至pET-32a载体。将重组pET-32a-HA质粒转化到*** Rosetta(DE3)感受态细胞中用IPTG诱导表达,通过SDS-PAGE及Western blot鉴定HA蛋白的表达,并优化诱导表达的IPTG浓度、时间及温度,提高表达效率。用纯化的重组蛋白免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体,通过Western blot、间接免疫荧光和ELISA检测多克隆抗体的特异性和效价,采用HI试验测定其血凝抑制效价。结果PCR扩增出HA基因,大小约为1700 bp。双酶切及测序结果表明,成功构建pET-32a-HA表达载体。经SDS-PAGE及Western blot验证该蛋白分子质量约79 ku,与预期一致,成功表达HA基因。对诱导条件进行优化,HA蛋白在28℃、IPTG终浓度为0.8 mmol/L诱导5 h表达量最高。制备的多克隆抗体可与HA蛋白特异性结合,其血凝抑制效价为1∶128,间接ELISA效价为1∶1638400。结论表达的pET-32a-HA蛋白具有免疫原性,制备的HA多克隆抗体具有良好特异性,且效价高,为建立ELISA检测方法及疫苗的研制奠定了基础。

关键词：禽流感病毒(AIV) H9N2亚型 HA蛋白原核表达多克隆抗体

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氟化物对雏鸡体液免疫功能影响的研究

甘肃畜牧兽医 2000年第5期30卷 12-14页

作者：冯军池仕红王政富佛山科学技术学院动物医学系广东佛山528231

文章研究了氟化物对雏鸡体液免疫功能的影响。试验Ⅰ组和试验Ⅱ组在 4～ 4 2日龄分别喂含氟量为 30 0mg/kg和 50 0mg/kg的饲料 ,4 3～ 56日龄喂常规饲料 ,对照组在整个试验期内喂常规饲料。结果显示 ,在 1～ 3周内 ,氟化物能促进ND病毒... 详细信息

文章研究了氟化物对雏鸡体液免疫功能的影响。试验Ⅰ组和试验Ⅱ组在 4～ 4 2日龄分别喂含氟量为 30 0mg/kg和 50 0mg/kg的饲料 ,4 3～ 56日龄喂常规饲料 ,对照组在整个试验期内喂常规饲料。结果显示 ,在 1～ 3周内 ,氟化物能促进ND病毒抗体和血清球蛋白的产生 ,显著提高外周血淋巴细胞ANAE阳性率 ;在 4～ 8周内 ,鸡增重减慢 ,器官指数降低 ,对ND病毒抗体、DRBC抗体和血清球蛋白含量的产生没有影响。这表明 ,在短期内氟化物能增强雏鸡体液免疫功能 ;在较长时间内。

关键词：氟化物雏鸡体液免疫氟中毒法氏囊

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小鼠腹腔巨噬细胞的分离与鉴定方法研究进展

黑龙江畜牧兽医 2018年第15期 63-65页

作者：吕娟容冯军陈志胜池仕红佛山科学技术学院

细胞培养是生物技术中一门最核心、最基础的技术,细胞试验能进行细胞水平上的研究,可降低研究成本,提高工作效率。如今细胞培养技术已广泛应用于生物学、医学、新药研发等各个领域,成为最重要的基础学科之一。特别是在医药领域,细胞培... 详细信息

细胞培养是生物技术中一门最核心、最基础的技术,细胞试验能进行细胞水平上的研究,可降低研究成本,提高工作效率。如今细胞培养技术已广泛应用于生物学、医学、新药研发等各个领域,成为最重要的基础学科之一。特别是在医药领域,细胞培养更具有特殊的作用和价值。出于不同的研究目的,研究中所用细胞的来源也不同。

关键词：小鼠腹腔抗原刺激细胞培养基巨噬细胞组织细胞

H9N2亚型禽流感病毒NP蛋白原核表达及多克隆抗体制备

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中国畜牧兽医 2022年第10期49卷 3963-3971页

作者：杨景张新宇梁志鹏程晴王聪颖池仕红袁生郭锦玥黄淑坚温峰佛山科学技术学院生命科学与工程学院佛山528225

【目的】对华南地区分离到的1株H9N2亚型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)流行株NP蛋白进行原核表达,制备H9N2亚型AIV NP蛋白多克隆抗体。【方法】将1株H9N2亚型AIV的NP基因克隆至pET-32a(+)原核表达载体,构建NP蛋白原核表达质粒... 详细信息

【目的】对华南地区分离到的1株H9N2亚型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)流行株NP蛋白进行原核表达,制备H9N2亚型AIV NP蛋白多克隆抗体。【方法】将1株H9N2亚型AIV的NP基因克隆至pET-32a(+)原核表达载体,构建NP蛋白原核表达质粒。将重组质粒同时转化大肠杆菌BL21(DE3)和Rosetta(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达重组蛋白。通过考马斯亮蓝染色和Western blotting分析并比较NP蛋白在两种表达菌中的表达量,进一步优化诱导剂浓度、诱导时间及诱导温度等条件,提高蛋白的表达效率。采用镍柱亲和层析法对NP蛋白进行纯化,用BCA法测定蛋白浓度。以纯化的NP蛋白免疫新西兰大白兔获得多克隆抗体,通过Western blotting和间接免疫荧光对所制备的多克隆抗体进行鉴定,通过间接ELISA测定抗体效价。【结果】试验成功构建pET-32a-H9N2-NP原核表达质粒并表达重组NP蛋白。考马斯亮蓝染色和Western blotting结果均表明,重组NP蛋白在大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞中表达水平远高于大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,其大小约73 ku。诱导条件优化结果显示,重组NP蛋白在37℃、IPTG终浓度为1 mmol/L诱导7 h时的表达量最大,且通过镍柱纯化后得到纯度较高的重组蛋白。Western blotting和间接免疫荧光结果均表明,所制备的多克隆抗体能高效地与H9N2亚型AIV发生特异性结合。间接ELISA测得多克隆抗体的效价为1∶409600。【结论】本研究制备的兔抗NP蛋白多克隆抗体效价较高,表明NP蛋白具有良好的免疫原性,为今后NP蛋白单克隆抗体的制备和ELISA检测方法的建立奠定了基础。

关键词： H9N2亚型禽流感病毒(AIV) NP蛋白原核表达多克隆抗体

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