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长枝木霉T6菌株培养条件优化及关键杀线活性蛋白分析

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长枝木霉T6菌株培养条件优化及关键杀线活性蛋白分析

作者：毛维兴甘肃农业大学

学位级别：硕士

禾谷孢囊线虫(Heterodera avenae)是一类重要的植物寄生线虫,主要危害禾本科作物,全世界小麦主产区均有分布,并造成严重经济损失。目前对禾谷孢囊线虫的防治仍以化学防治为主,但化学防治存在污染环境和危害人畜健康等弊端。因此,开发高... 详细信息

禾谷孢囊线虫(Heterodera avenae)是一类重要的植物寄生线虫,主要危害禾本科作物,全世界小麦主产区均有分布,并造成严重经济损失。目前对禾谷孢囊线虫的防治仍以化学防治为主,但化学防治存在污染环境和危害人畜健康等弊端。因此,开发高效安全和对环境友好的微生物型杀线剂已成为国内外的研究热点。本研究以长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)T6菌株和禾谷孢囊线虫作为试验材料,筛选了长枝木霉T6菌株高效杀线活性培养基和优化了其杀线活性培养条件;测定了发酵液杀线稳定性;分析了木霉蛋白种类;分离了关键杀线蛋白。研究结果旨在揭示长枝木霉T6菌株对禾谷孢囊线虫的毒杀作用机制,以及为禾谷孢囊线虫的生物防治提供理论依据。取得的主要研究结果如下:1.筛选获得长枝木霉T6菌株最佳杀线活性培养基为酪蛋白培养基,并通过单因素试验得到最适培养条件为pH=7,温度28℃,培养时间7 d,接种量为1-2 mL,摇瓶装液量为50-70 mL,其中发现温度、pH和培养时间作为影响长枝木霉T6菌株发酵液杀线活性最为显著的3因素。同时,利用响应面优化最终获得长枝木霉T6菌株最佳杀线活性发酵条件为pH=6.64,温度26.52℃,时间6.8 d,且在该预测条件下其发酵液杀线活性高达86.10%,与预测值相吻合。2.不同酸碱度、温度、金属离子、氧化还原和储藏时间对长枝木霉T6菌株发酵液杀线稳定性具有不同程度的影响。当pH 4-10时,长枝木霉T6菌株发酵液对禾谷孢囊线虫2龄幼虫均具有较高的致死作用,处理72 h后其死亡率均大于80%,与对照相比差异性不显著;在温度为30-60℃条件下,其发酵液杀线活性和对照相比无显著差异,而当温度大于70℃时,其杀线活性开始降低;Zn?和K?对发酵液杀线活性具有明显的增强作用,而Cu2?对发酵液杀线活性具有抑制作用,以及Mg2?、Fe3?、Mn2?和Na?对发酵液杀线活性无显著影响;当氧化剂和还原剂浓度分别低于0.08和0.06mol·L时,其对杀线活性无显著影响;发酵液在室温下保存0-60 d后,其杀线活性无显著变化。3.质谱检测长枝木霉T6菌株分泌的蛋白种类,共获得谱图39537张,且经与木霉蛋白库进行匹配后获得4种蛋白,利用氨基酸序列对蛋白理化性质及结构进行预测。对匹配蛋白进行GO功能注释,发现其参与3种分子功能,分别为转化活性、催化活性以及酶结合活性;参与细胞组分形成过程中发现其分别在细胞,细胞膜和细胞器等9种细胞位置上均具有匹配蛋白的存在;生物学过程分析发现其主要参与细胞组成、蛋白质定位、代谢和应激等过程。COG功能注释表明,其主要功能为蛋白的翻译和修饰、蛋白质转运以及蛋白质分子伴侣、能量产生和转化以及氨基酸的转运和代谢。4.采用透明圈法和分光光度法定性和定量分析了长枝木霉T6菌株产生胞外蛋白能力,表明长枝木霉T6菌株能够产生大量的胞外蛋白。采用中性盐析法和柱层析法分离了长枝木霉T6菌株发酵液杀线活性蛋白,结果表明层析共获得3组洗脱峰,其中洗脱峰A和B具有较强的杀线活性,当其浓度分别为12.48μg·mL和9.20μg·mL时,处理线虫72h后其死亡率分别为52.05%和43.89%,而洗脱峰C的杀线活性较低,线虫死亡率仅为22.42%。

关键词：木霉菌禾谷孢囊线虫杀线活性蛋白稳定性测定响应面优化蛋白谱分析活性蛋白分离

绿色木霉B3菌株发酵液杀线活性分析及其稳定性测定

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西北农业学报 2019年第9期28卷 1535-1542页

作者：李通毛维兴薛应钰张树武徐秉良甘肃农业大学植物保护学院甘肃省农作物病虫害生物防治工程实验室

为了明确绿色木霉(Trichoderma viride)B3菌株对禾谷孢囊线虫毒杀活性及其稳定性。通过室内毒力测定,分析不同因素对绿色木霉B3菌株毒杀禾谷孢囊线虫2龄幼虫活性及其稳定性的影响。结果表明,绿色木霉B3菌株发酵液在自然光处理0~96h后,... 详细信息

为了明确绿色木霉(Trichoderma viride)B3菌株对禾谷孢囊线虫毒杀活性及其稳定性。通过室内毒力测定,分析不同因素对绿色木霉B3菌株毒杀禾谷孢囊线虫2龄幼虫活性及其稳定性的影响。结果表明,绿色木霉B3菌株发酵液在自然光处理0~96h后,对其杀线活性无显著影响,2龄幼虫死亡率为71.4%~86.2%;在不同氧化剂、还原剂和酸碱处理下,其抗氧化性、还原性和耐强酸强碱较强。同时,绿色木霉B3菌株发酵液耐贮藏性较好,储存60d后杀线活性无显著差异。

关键词：木霉菌禾谷孢囊线虫杀线活性稳定性

长枝木霉T6与阿维菌素复配对禾谷孢囊线虫的室内毒杀效果

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西北农业学报 2022年第2期31卷 233-239页

作者：吉宝丽毛维兴张树武徐秉良甘肃农业大学植物保护学院甘肃省农作物病虫害生物防治工程实验室兰州730070

旨在采用室内毒力测定法测定长枝木霉与阿维菌素复配对禾谷孢囊线虫2龄幼虫的毒杀效果。试验结果表明,单一长枝木霉T6菌株分生孢子悬浮液和阿维菌素对禾谷孢囊线虫2龄幼虫均表现出较好的毒杀效果,且不同浓度之间存在显著差异,随着处理... 详细信息

旨在采用室内毒力测定法测定长枝木霉与阿维菌素复配对禾谷孢囊线虫2龄幼虫的毒杀效果。试验结果表明,单一长枝木霉T6菌株分生孢子悬浮液和阿维菌素对禾谷孢囊线虫2龄幼虫均表现出较好的毒杀效果,且不同浓度之间存在显著差异,随着处理浓度和时间的增加,毒杀作用增强。经2.0×107 cfu·mL^(-1)的木霉分生孢子悬浮液和0.5μg·mL^(-1)的阿维菌素溶液处理2龄幼虫48 h后,线虫死亡率分别达到71.43%和60.28%;当长枝木霉T6与0.5μg·mL^(-1)的阿维菌素溶液按1∶1比例复配时,其对2龄幼虫的毒杀活性最佳,处理48 h后线虫死亡率高达96.30%,其毒杀作用显著优于单一长枝木霉T6和单一阿维菌素溶液。

关键词：长枝木霉禾谷孢囊线虫阿维菌素复配毒杀作用

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5种植物源药剂对苹果树腐烂病室内防效评价

植物保护 2019年第4期45卷 282-287页

作者：毛维兴李焰张树武薛应钰徐秉良甘肃农业大学植物保护学院甘肃省农作物病虫害生物防治工程实验室

采用菌落生长速率法、分生孢子玻片萌发法和离体枝条烫伤接种法测定了5种植物源药剂对苹果树腐烂病室内防治效果。结果表明,5种植物源药剂对苹果树腐烂病菌菌落生长和分生孢子萌发均具有显著的抑制作用,当0.3%丁子香酚SL、5%香芹酚AS、... 详细信息

采用菌落生长速率法、分生孢子玻片萌发法和离体枝条烫伤接种法测定了5种植物源药剂对苹果树腐烂病室内防治效果。结果表明,5种植物源药剂对苹果树腐烂病菌菌落生长和分生孢子萌发均具有显著的抑制作用,当0.3%丁子香酚SL、5%香芹酚AS、20%乙蒜素EC、0.5%小檗碱AS和1.3%苦参碱AS的有效成分浓度分别为3、50、100、50和14.44μg/mL时,其对苹果树腐烂病菌菌落生长的抑制率分别为98.63%、99.22%、99.22%、100%和79.29%,其EC 50分别为0.43、8.78、11.21、13.68和8.11μg/mL;对苹果树腐烂病菌分生孢子萌发的校正抑制率分别为97.92%、100%、95.83%、77.08%和96.88%,其EC 50分别为0.70、8.56、20.39、28.23和8.04μg/mL。离体枝条保护试验表明,20%乙蒜素EC有效成分浓度为100μg/mL时对离体枝条保护作用最佳。本研究通过筛选明确了5种植物源药剂中0.3%丁子香酚SL可作为抑制苹果树腐烂病菌菌丝生长和分生孢子萌发的最佳药剂,以及20%乙蒜素EC可作为离体枝条保护作用的最佳药剂。

关键词：苹果树腐烂病植物源农药抑菌活性防治效果

环境因子和储藏时期对长枝木霉PT6蛋白培养滤液杀线活性评价

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草业科学 2022年第10期39卷 2095-2101页

作者：刘永红毛维兴陈瑞莲马耀杰张树武徐秉良甘肃农业大学植物保护学院/甘肃省农作物病虫害生物防治工程实验室甘肃兰州730070

为了明确长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)PT6蛋白培养滤液对禾谷孢囊线虫(Heterodera avenae)2龄幼虫的毒杀活性及其稳定性。通过室内杀线活性测定,分析和评价了不同环境因子和储藏时期对长枝木霉PT6蛋白培养滤液杀线活性的影响... 详细信息

为了明确长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)PT6蛋白培养滤液对禾谷孢囊线虫(Heterodera avenae)2龄幼虫的毒杀活性及其稳定性。通过室内杀线活性测定,分析和评价了不同环境因子和储藏时期对长枝木霉PT6蛋白培养滤液杀线活性的影响。结果表明,不同pH、金属离子、氧化剂、温度、还原剂和储藏时期对PT6蛋白培养滤液杀线活性和稳定性都有不同的影响。pH 4~10时,PT6蛋白培养滤液对禾谷孢囊线虫2龄幼虫具有较高毒杀作用,处理72 h后其死亡率均大于80%,且与原始蛋白培养滤液(对照)相比差异性不显著(P>0.05);在温度为30~60℃条件下与对照相比,杀线活性无显著差异(P>0.05),当温度超过70℃时,杀线活性开始降低;Cu^(2+)对PT6蛋白培养滤液杀线活性具有显著抑制效果(P0.05);当氧化剂浓度低于0.08 mol·L^(−1)、还原剂低于0.06 mol·L^(−1)时,对杀线活性无显著影响(P>0.05);与对照相比,当PT6蛋白培养滤液在室温下保存0~60 d,其杀线活性无显著变化(P>0.05)。综上所述,PT6蛋白培养滤液对禾谷孢囊线虫具有较强的毒杀作用,且稳定性较好。

关键词：杀线活性稳定性温度酸碱度金属离子氧化剂还原剂

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生防放线菌ZZ-9耐药菌株的微波诱变选育

干旱地区农业研究 2019年第2期37卷 260-265页

作者：陈大为薛应钰沈志彦毛维兴张树武徐秉良甘肃农业大学植物保护学院甘肃省农作物病虫害生物防治工程实验室甘肃兰州730070

为了获得耐甲基硫菌灵的菌株,采用微波诱变法对放线菌ZZ-9菌株进行0～75 s的处理,筛选出在甲基硫菌灵致死浓度下仍能较好生长的突变菌株,并测定其对苹果树腐烂病菌拮抗性和传代稳定性的影响,选育出性能优良的耐药菌株,与甲基硫菌灵协同... 详细信息

为了获得耐甲基硫菌灵的菌株,采用微波诱变法对放线菌ZZ-9菌株进行0～75 s的处理,筛选出在甲基硫菌灵致死浓度下仍能较好生长的突变菌株,并测定其对苹果树腐烂病菌拮抗性和传代稳定性的影响,选育出性能优良的耐药菌株,与甲基硫菌灵协同作用进行防治苹果树腐烂病试验。结果表明,在微波辐照15～60 s条件下,获得4株耐70μg·mL^(-1)甲基硫菌灵的突变菌株ZZ-9A、ZZ-9B、ZZ-9C和ZZ-9D。通过对4株突变菌株进行抑菌率和传代稳定性测定,筛选出一株抑菌率较好且传代稳定的突变菌株ZZ-9B。菌株ZZ-9B与70μg·mL^(-1)甲基硫菌灵协同作用测定表明,当菌株ZZ-9B与甲基硫菌灵配比为8∶2时,在离体枝条上对苹果树腐烂病的协同防效为89.42%,明显高于单独使用突变菌株和甲基硫菌灵的防效。因此,在使用菌株ZZ-9B来防治苹果树腐烂病时,添加少量的甲基硫菌灵,可显著提高防效。

关键词：微波诱变选育耐药菌株放线菌ZZ-9 协同作用

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木霉D5菌株的鉴定及其杀线活性测定

植物保护 2023年第3期49卷 199-205页

作者：陈瑞莲毛维兴刘永红张树武徐秉良甘肃农业大学植物保护学院兰州730070 甘肃省农作物病虫害生物防治工程实验室兰州730070

通过形态学和分子生物学方法鉴定了1株杀线木霉D5菌株的种类,并评价了其孢子悬浮液和发酵液对禾谷孢囊线虫Heterodera avenae 2龄幼虫的毒杀活性。结果表明,木霉D5菌株为绿色木霉Trichoderma viride(ITS序列登录号:OL661629;TEF序列登录... 详细信息

通过形态学和分子生物学方法鉴定了1株杀线木霉D5菌株的种类,并评价了其孢子悬浮液和发酵液对禾谷孢囊线虫Heterodera avenae 2龄幼虫的毒杀活性。结果表明,木霉D5菌株为绿色木霉Trichoderma viride(ITS序列登录号:OL661629;TEF序列登录号:ON241311)。浓度为1.0×10^(7)cfu/mL的D5菌株孢子悬浮液和发酵液原液处理2龄幼虫72 h后,线虫死亡率分别为85.20%和86.57%。在温度为20~80℃范围内以及pH为2~10时,发酵液均具有较高杀线活性。

关键词：绿色木霉鉴定禾谷孢囊线虫发酵液杀线活性

深绿木霉T2菌株对苹果霉心病的防治效果研究

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中国果树 2018年第5期 11-14页

作者：张文军毛维兴张树武薛应钰徐秉良甘肃农业大学植物保护学院兰州730070

为了明确深绿木霉(Trichoderma atroviride)T2菌株对苹果霉心病的防治效果,采用对峙培养的方法测定了T2菌株对苹果霉心病3种主要病原菌的抑制作用。结果表明,T2菌株及其发酵液对苹果霉心病的主要病原菌粉红单端孢(Trichothecium roseum... 详细信息

为了明确深绿木霉(Trichoderma atroviride)T2菌株对苹果霉心病的防治效果,采用对峙培养的方法测定了T2菌株对苹果霉心病3种主要病原菌的抑制作用。结果表明,T2菌株及其发酵液对苹果霉心病的主要病原菌粉红单端孢(Trichothecium roseum)、砖红镰刀菌(Fusarium lateritium)和苹果链格孢(Alternaria mali)均具有较强的抑制作用。拮抗效果测定结果表明,T2菌株对砖红镰刀菌和苹果链格孢有很强的抑制作用,抑制率分别为81.44%、85.51%。T2菌株发酵原液对苹果链格孢和砖红镰刀菌的抑菌作用较强,抑制率均在80%以上,与生物源农药3%多抗霉素(6.67μg/m L)对3种苹果霉心病病原菌的抑菌作用相比,无显著差异。离体果实防效结果表明,T2菌株发酵液对苹果霉心病具有较好的防治效果,处理后第5d其防效平均为78.59%。综上,T2菌株对苹果霉心病具有较好的防治效果,研究结果可为苹果霉心病的防治及其生防制剂的研发提供理论基础。

关键词：深绿木霉T2 苹果霉心病抑菌活性防治

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不同杀菌剂对苹果树腐烂病防治效果研究

中国果树 2019年第3期 77-80页

作者：韩玉红张树武毛维兴石明明李宝谢佳丽徐秉良甘肃农业大学植物保护学院甘肃省农作物病虫害生物防治工程实验室兰州730070

为了筛选有效防治苹果树腐烂病的杀菌剂,测定了5种化学杀菌剂对苹果树腐烂病菌的室内抑制活性和田间防治效果,并比较了不同"杀菌剂+助剂+刮治"的病疤处理方式在田间的防治效果。室内试验结果表明:5种杀菌剂对苹果树腐烂病菌均具有抑制作... 详细信息

为了筛选有效防治苹果树腐烂病的杀菌剂,测定了5种化学杀菌剂对苹果树腐烂病菌的室内抑制活性和田间防治效果,并比较了不同"杀菌剂+助剂+刮治"的病疤处理方式在田间的防治效果。室内试验结果表明:5种杀菌剂对苹果树腐烂病菌均具有抑制作用,其中噻霉酮和甲硫·萘乙酸抑菌作用最为显著,抑菌率分别为93.19%和90.07%,丁香菌酯防效最差,抑菌率仅为48.60%;显微观察发现,5种杀菌剂处理能够导致苹果树腐烂病菌菌丝发生不同程度的畸形、顶端膨大和原生质外溢,并且菌丝变形程度随处理时间延长而加重。田间试验结果表明,以"甲硫·萘乙酸+乙基化和甲基化植物油+刮治"的处理方式对苹果树腐烂病菌的防治效果最佳,病疤愈合度大于33%。

关键词：苹果树腐烂病杀菌剂室内抑制活性田间防效