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甲病毒受体研究进展

病毒学报 2020年第5期36卷 969-974页

作者：曾喻兵殷鑫欢徐雷朱玲徐志文四川农业大学动物生物技术中心成都611130 动物疫病与人类健康四川省重点实验室成都611130

甲病毒(Alphavirus)是家畜和人类的重要病原体,感染后虽未危及生命,但可引发慢性疾病,如关节炎、关节痛和斑丘疹等。尽管已开展多年的研究,但甲病毒的侵染机理和宿主抗病毒机制尚未清楚,亦未研制出有效的疫苗和抗病毒药物。目前研究发现... 详细信息

甲病毒(Alphavirus)是家畜和人类的重要病原体,感染后虽未危及生命,但可引发慢性疾病,如关节炎、关节痛和斑丘疹等。尽管已开展多年的研究,但甲病毒的侵染机理和宿主抗病毒机制尚未清楚,亦未研制出有效的疫苗和抗病毒药物。目前研究发现,甲病毒受体有Mxra8分子、抗性相关巨噬细胞蛋白、抑制素、α1β1整合素、层粘连蛋白受体、TIM家族等。本文就已知甲病毒受体及其与病毒相互作用进行总结概述,以期为甲病毒致病机理的深入研究及其所致疾病的预防控制提供新的思路。

关键词：甲病毒病毒受体相互作用点

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致病性大肠杆菌和蜡样芽胞杆菌的分离鉴定

微生物学通报 2019年第4期46卷 811-818页

作者：殷鑫欢曾喻兵赵军徐志文朱玲四川农业大学动物医学院动物生物技术中心四川成都611130

【背景】猪只消化道疾病是养猪业上一大重要疾病,给养猪业带来一定的经济损失。大肠杆菌是引起猪腹泻的一种常见病原菌,可以引起不同日龄的猪腹泻,但主要以幼龄猪为主。【目的】旨在分离鉴定引起四川省眉山市一规模化养猪场病猪大规模... 详细信息

【背景】猪只消化道疾病是养猪业上一大重要疾病,给养猪业带来一定的经济损失。大肠杆菌是引起猪腹泻的一种常见病原菌,可以引起不同日龄的猪腹泻,但主要以幼龄猪为主。【目的】旨在分离鉴定引起四川省眉山市一规模化养猪场病猪大规模腹泻的病原菌。【方法】采用常规细菌分离方法结合16S rRNA基因序列的分析方法从发病猪肝脏、胃以及污染的饲料分离鉴定细菌,并对分离株进行小鼠致病性试验、16S rRNA基因遗传进化树分析、毒力基因的检测、药物敏感试验。【结果】从腹泻猪肝脏中分离到一株致病性大肠杆菌,胃中分离到一株蜡样芽胞杆菌,并且追溯到传染源是该猪场饲料。通过检测这两株菌相应的毒力基因发现大肠杆菌不属于肠外致病性型,蜡样芽胞杆菌检测到了nheA、nheB、nheC、bceT、entFM 5种毒力基因;药敏试验表明常规的氨基糖苷类和头孢类抗生素对大肠杆菌抑菌效果较好,红霉素、氟苯尼考、头孢氨苄、头孢哌酮对蜡样芽胞杆菌抑菌效果较好,而蜡样芽胞杆菌对青霉素、阿莫西林等常规药物不敏感。【结论】饲料存在大肠杆菌和蜡样芽胞杆菌的混合污染。

关键词：大肠杆菌蜡样芽胞杆菌饲料污染毒力基因药敏试验

猪δ冠状病毒重组M蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立与应用

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畜牧兽医学报 2020年第7期51卷 1710-1718页

作者：冯宇殷鑫欢杨晓宇徐雷徐志文朱玲四川农业大学动物医学院成都611130 动物生物技术中心成都611130

本研究旨在建立一种可靠的检测猪δ冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)IgG抗体的间接ELISA方法,了解四川地区PDCoV的流行情况。采用原核表达系统表达PDCoV膜蛋白(M)作为检测抗原,通过反应条件的优化,建立了基于PDCoV M蛋白的间接... 详细信息

本研究旨在建立一种可靠的检测猪δ冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)IgG抗体的间接ELISA方法,了解四川地区PDCoV的流行情况。采用原核表达系统表达PDCoV膜蛋白(M)作为检测抗原,通过反应条件的优化,建立了基于PDCoV M蛋白的间接ELISA方法,命名为PDCoV-rM-ELISA,并用该方法对430份临床样品进行检测。成功构建了重组表达菌BL21-pET-32a-M,经诱导表达后获得了重组M蛋白,Western bolt检测表明,重组蛋白具有良好的反应原性。以其作为包被抗原建立的PDCoV-rM-ELISA方法仅对PDCoV血清检测为阳性,与猪流行性腹泻病毒等5种猪常见病原阳性血清均无交叉反应,具有良好的特异性;该方法灵敏性高、重复性好,批间和批内重复性变异系数均小于10%;与成品化PDCoV抗体检测试剂盒同时检测48份临床血清,两种方法的阳性符合率为88.46%,阴性符合率为90.91%,总符合率为89.58%。临床样品检测结果表明,各地样本PDCoV抗体阳性率平均为11.86%,且统计学分析显示,母猪比仔猪和育肥猪高2.25倍的PDCoV感染概率。笔者成功表达了PDCoV M蛋白,建立了PDCoV-rM-ELISA检测方法,该方法具有较高的敏感性、良好的特异性和重复性,可用于临床猪血清样品种PDCoV IgG抗体的检测。

关键词：猪δ冠状病毒重组M蛋白原核表达间接ELISA

猪繁殖与呼吸综合征类NADC30与HP-PRRSV毒株RT-PCR鉴别方法的建立与应用

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江苏农业学报 2019年第1期35卷 109-113页

作者：徐雷赵军杨晓宇殷鑫欢张继宗朱玲四川农业大学动物医学院四川成都611130 动物疫病与人类健康四川省重点实验室四川成都611130

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是一种能够引起大面积呼吸道疾病并快速传播,导致母猪流产和仔猪死亡的RNA病毒,其特性为变异快,存在毒株间的重组。因此,病原的快速检测和鉴定对于该病的防控十分重要。本试验建立了一种能够区分类高致病... 详细信息

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是一种能够引起大面积呼吸道疾病并快速传播,导致母猪流产和仔猪死亡的RNA病毒,其特性为变异快,存在毒株间的重组。因此,病原的快速检测和鉴定对于该病的防控十分重要。本试验建立了一种能够区分类高致病猪繁殖与呼吸综合征病毒类NADC30与HP-PRRSV毒株的检测方法,根据nsp2基因的高变区的比对结果,选择其保守序列,设计一对检测引物,类NADC30扩增片段大小为334 bp,HP-PRRSV毒株扩增片段大小为514 bp,通过优化反应条件,最终建立了一种一对引物就可以区分检测类NADC30与HP-PRRSV毒株的RT-PCR检测方法。应用本试验所建立的RT-PCR方法对2017年12月至2018年2月采至四川多地区的疑似PRRSV感染发病的46份肺脏进行检测。结果显示,类NADC30检出率为32. 6%,高于HP-PRRSV毒株的检出率(10. 9%)。该方法的建立,为类NADC30和HP-PRRSV毒株的快速鉴别诊断提供了方法,具有重要意义。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征类NADC30 HP-PRRSV 鉴别诊断 RT-PCR

猪非典型性瘟病毒与猪流行性腹泻病毒双重PCR方法的建立与应用

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江苏农业学报 2018年第5期34卷 1081-1086页

作者：杨晓宇徐雷殷鑫欢张继宗徐志文朱玲四川农业大学动物医学院四川成都611130 四川农业大学动物疫病与人类健康四川省重点实验室四川成都611130

为了快速准确地检测出猪非典型性瘟病毒(APPV)与猪流行性腹泻病毒(PEDV),根据Gen Bank中发布的PEDV S2基因和APPV NS3基因的序列,分别选取PEDV S2基因和APPV NS3基因的保守序列,设计、合成了1对特异性引物。通过对体系进行优化,分别扩增... 详细信息

为了快速准确地检测出猪非典型性瘟病毒(APPV)与猪流行性腹泻病毒(PEDV),根据Gen Bank中发布的PEDV S2基因和APPV NS3基因的序列,分别选取PEDV S2基因和APPV NS3基因的保守序列,设计、合成了1对特异性引物。通过对体系进行优化,分别扩增出190 bp和500 bp的特异性片段。建立的双重RT-PCR方法对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪轮状病毒(RV)的检测均为阴性。对PEDV和APPV的最低检出量分别为1μl 2.65×10~5和1μl 3.56×10~4,对四川遂宁、眉山等地采集到的腹泻、肌肉震颤的病料进行检测,PEDV、APPV阳性病料检出率分别为41. 18%和11. 76%,经分别与特异性检测APPV和PEDV的单一RT-PCR法检测结果进行比较分析,符合率均为100%。与单一RT-PCR检测方法具有相同特异性和重复性,可用于临床检测。

关键词：猪非典型性瘟病毒猪流行性腹泻病毒双重RT-PCR

非典型性瘟病毒SYBR Green Ⅱ荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用

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中国预防兽医学报 2018年第12期40卷 1133-1136页

作者：杨晓宇徐雷殷鑫欢张继宗鲁令华冯宇朱玲四川农业大学动物医学院四川成都611130 四川农业大学动物疫病与人类健康四川省重点实验室四川成都611130

为建立一种快速检测猪非典型性瘟病毒(APPV)的方法,本实验建立了APPV SYBR Green Ⅱ荧光定量RT-PCR检测方法。该方法特异性试验结果显示,除APPV外,猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒等常见猪病病原检测... 详细信息

为建立一种快速检测猪非典型性瘟病毒(APPV)的方法,本实验建立了APPV SYBR Green Ⅱ荧光定量RT-PCR检测方法。该方法特异性试验结果显示,除APPV外,猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒等常见猪病病原检测均为阴性,表明其特异性良好;该方法最低检测限为2.8×10~3拷贝/μL,敏感性较高;重复性试验的组内、组间变异系数均小于1%。利用该方法对临床56份来自四川各地的临床病料样品进行检测,检出5份阳性样品,且与常规PCR检测方法的阳性符合率为100%。本研究建立的APPV荧光定量RT-PCR检测方法为APPV临床检出以及后期并发症的研究奠定了基础。

关键词：非典型性瘟病毒荧光定量RT-PCR SYBR Green Ⅱ

2017年～2018年四川省猪δ冠状病毒的检测与遗传进化分析

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中国预防兽医学报 2019年第10期41卷 1059-1062,1071页

作者：冯宇殷鑫欢徐雷杨晓宇鲁令华徐志文朱玲四川农业大学动物生物技术中心四川成都611130 四川动物疫病与人类健康四川省重点实验室四川成都611130

为调查猪δ冠状病毒(PDCoV)在四川省的流行情况,本研究对2017年~2018年采集的141份仔猪腹泻病料样品经RT-PCR检测,并对检测为PDCoV的两株病毒进行全基因扩增与序列分析。结果显示,PDCoV的阳性率为4.96%(7/141),且PDCoV与猪流行性腹泻病... 详细信息

为调查猪δ冠状病毒(PDCoV)在四川省的流行情况,本研究对2017年~2018年采集的141份仔猪腹泻病料样品经RT-PCR检测,并对检测为PDCoV的两株病毒进行全基因扩增与序列分析。结果显示,PDCoV的阳性率为4.96%(7/141),且PDCoV与猪流行性腹泻病毒的混合感染阳性率为2.84%(4/141)。全基因组序列分析显示两株PDCoV之间的同源性为99.3%,与其它PDCoV病毒株间的同源性为97.6%~99.0%。两株PDCoV均与越南和泰国PDCoV株的同源性最低,而之前发现的四川PDCoVCH/Sichuan/S27株与越南和泰国病毒株有较高的同源性。两株PDCoV的全基因组中均有部分碱基的插入或缺失,包括ORF1ab基因中的9 nt插入和S基因中的3 nt缺失,以及在3’UTR区域的11 nt缺失。遗传进化树分析显示,PDCoV呈现出明显的地域特征,同时中国PDCoV株呈现出4个小分支,其中两个新PDCoV株与CH/Sichuan/S27位于不同分支,表明PDCoV的基因存在多样性。本研究丰富了PDCoV在中国的分子流行特征及其遗传进化规律,为后续PDCoV的病毒学研究提供参考。

关键词：猪δ冠状病毒流行全基因遗传进化

2018-2019年四川省伪狂犬病毒的流行病学调查及gC、gE、TK基因遗传进化分析

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微生物学通报 2020年第12期47卷 4142-4154页

作者：殷鑫欢鲁令华王进疆谢勇朱玲周莉媛陈弟诗徐志文四川农业大学动物医学院动物生物技术中心四川成都611130

【背景】伪狂犬病毒(pseudorabies virus,PRV)是养猪生产中的一类重要病原,自2011年以来,我国接种了Bartha-K61疫苗的养殖场暴发了大规模的伪狂犬病疫情。【目的】调查目前四川省PRV的流行病学以及毒株的遗传进化,对2018-2019年从86个... 详细信息

【背景】伪狂犬病毒(pseudorabies virus,PRV)是养猪生产中的一类重要病原,自2011年以来,我国接种了Bartha-K61疫苗的养殖场暴发了大规模的伪狂犬病疫情。【目的】调查目前四川省PRV的流行病学以及毒株的遗传进化,对2018-2019年从86个猪场收集的384份疑似PRV感染样本进行病原学检测。【方法】根据PRV-g E基因检测引物对采集的384份样品进行PCR扩增,并对不同季节、不同地区的PRV阳性率进行统计,将PRV感染与临床症状的相关性进行统计学分析。选择部分PRV阳性样本在BHK-21细胞上进行病毒的分离,随后进行分离毒株的g C、g E、TK基因的遗传进化分析。【结果】PRV阳性猪只的比率为9.9%(38/384);阳性猪场比率为16.3%(14/86);流产母猪的PRV阳性率为32.1%(27/84);种公猪阳性率为2.0%(4/198);神经症状猪的PRV阳性率为11.4%(4/35);呼吸症状猪的PRV阳性率为4.5%(3/67)。统计学分析表明,PRV感染与母猪和公猪繁殖障碍症状相关(P<0.01)。其中,冬季(12月、1月、2月)PRV阳性率最高,约为33.0%(31/94);春季(3月、4月、5月)的阳性率为9.1%(3/33);夏季和秋季的阳性率分别约为1.5%(2/130)和1.6%(2/127)。在2018-2019年共分离出3株PRV毒株,分别命名为PRV-SN、PRV-DJY、PRV-CD。PRV-XJ为本实验室2016年在四川省分离的一株毒株,为了了解毒株的遗传进化信息,先后扩增了这4个毒株的g C、g E、TK基因。序列比对表明四川分离株与国内株相似,存在额外的零星性突变和缺失。【结论】养殖场仍应加强对种猪群中伪狂犬病的净化。

关键词：伪狂犬病毒基因分析流行病学调查

表达PEDV S和PoRV VP7蛋白的重组伪狂犬毒株构建

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微生物学通报 2019年第12期46卷 3345-3354页

作者：毛汐语周雪珂殷鑫欢邓益超龚双燕李小璟李幽幽徐志文朱玲四川农业大学动物医学院四川成都611130 动物疫病与人类健康四川省重点实验室四川成都611130 四川大学生命科学学院四川成都610064

【背景】猪流行性腹泻、猪轮状病毒病与猪伪狂犬病是严重危害全球养猪业的3种重要传染病,混合感染往往导致猪场更严重的损失。【目的】利用同源重组技术构建共表达猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV) S蛋白和猪轮... 详细信息

【背景】猪流行性腹泻、猪轮状病毒病与猪伪狂犬病是严重危害全球养猪业的3种重要传染病,混合感染往往导致猪场更严重的损失。【目的】利用同源重组技术构建共表达猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV) S蛋白和猪轮状病毒(Rotavirus,PoRV) VP7蛋白的猪伪狂犬三联基因工程疫苗株,并研究其部分生物学特性。【方法】通过序列比对、蛋白结构分析筛选s基因的475-804 aa和vp7基因的17-339 aa作为毒株构建的目的片段,依次构建了pMD-S、pMD-VP7、pMD-VP7.S克隆载体和pEGFP-VP7.S转移载体。将质粒pEGFP-VP7.S和PRV XJ亲本株同源重组,空斑纯化得到重组毒株PRV (CM),对其稳定性和增殖特性进行研究。【结果】构建了共表达S蛋白和VP7蛋白的伪狂犬基因工程病毒,连续传代20次,均能检测到vp7和s基因,而gE基因阴性;Westernblotting证实2种外源基因在重组病毒中均能实现良好的表达;测定亲本毒株和重组毒株的TCID50分别是10-7.59/0.1 mL和10-7.25/0.1 mL。【结论】获得了伪狂犬基因工程重组弱毒株PRV (CM),外源基因稳定存在,毒力基因稳定缺失,增殖特性差异不大,为PRV、PEDV和PoRV基因工程三联苗研究奠定了基础。

关键词：猪伪狂犬病毒猪流行性腹泻病毒猪轮状病毒同源重组毒株构建