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携带绿色荧光蛋白基因重组猫泛白细胞减少症病毒的拯救

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中国畜牧兽医 2020年第6期47卷 1853-1860页

作者：殷娟斌周亚花殷相平张志东中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室兰州730046

本研究旨在构建携带绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的重组猫泛白细胞减少症病毒(feline panleukopenia virus,FPV),以便更快速有效的检测中和抗体。参照GenBank中GFP基因序列设计特异性引物,应用PCR技术扩增获得携带AgeⅠ... 详细信息

本研究旨在构建携带绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的重组猫泛白细胞减少症病毒(feline panleukopenia virus,FPV),以便更快速有效的检测中和抗体。参照GenBank中GFP基因序列设计特异性引物,应用PCR技术扩增获得携带AgeⅠ和NheⅠ酶切位点的GFP基因,并对pFPV质粒进行定点突变,从而获得AgeⅠ和NheⅠ酶切位点,然后用AgeⅠ和NheⅠ同时双酶切pFPV和GFP基因,经4℃过夜连接、转化,成功构建携带GFP基因的重组猫泛白细胞减少症病毒质粒pFPV-GFP,应用脂质体转染法将重组质粒pFPV-GFP导入猫肾细胞(F81),利用GFP独特的发光机制可在荧光显微镜下对标记的重组病毒rFPV-GFP进行细胞内活体观察,利用Western blotting鉴定重组病毒rFPV-GFP中GFP的表达情况。结果显示,重组质粒pFPV-GFP转染F81细胞24 h时可观察到绿色荧光蛋白,且随着转染时间的延长观察到的绿色荧光蛋白数量增多,说明重组质粒pFPV-GFP成功转染到F81细胞中,Western blotting鉴定出GFP在重组病毒rFPV-GFP中稳定表达。本研究通过在pFPV上成功插入GFP并拯救出病毒,说明pFPV上可以插入外源基因,为其他外源基因在pFPV上的插入奠定基础,同时GFP的插入为FPV的研究提供了更加有利的研究工具,为FPV的基础研究以及中和抗体的快速检测奠定基础。

关键词：猫泛白细胞减少症病毒(FPV) 绿色荧光蛋白(GFP) 重组病毒拯救

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建Nup155基因敲除的PK-15细胞系

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中国兽医科学 2024年

作者：孙瑜嘉殷娟斌刘瀛李可卿曹轶梅朵红卢曾军赵志荀张强中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室甘肃省病原生物学基础学科研究中心青海大学畜牧兽医科学院

本研究计划使用CRISPR/Cas9基因编辑技术，构成Nup155基因缺失的PK-15细胞株，并检测敲除Nup155基因后对PK-15细胞的影响。首先设计精确靶向Nup155基因的4条sgRNA，与载体LentiCRISPR v2连接后进行慢病毒包装；再使用2 μg/mL嘌呤霉素... 详细信息

本研究计划使用CRISPR/Cas9基因编辑技术，构成Nup155基因缺失的PK-15细胞株，并检测敲除Nup155基因后对PK-15细胞的影响。首先设计精确靶向Nup155基因的4条sgRNA，与载体LentiCRISPR v2连接后进行慢病毒包装；再使用2 μg/mL嘌呤霉素筛选细胞株；通过RT-qPCR和Western -blot来确认细胞中Nup155基因是否被敲除；最终通过CCK8试验检测Nup155基因敲除对PK-15细胞活性的影响。RT-qPCR及Western -blot结果显示，细胞株Nup155基因的mRNA和蛋白表达水平显著降低；CCK8试验结果显示，部分敲除Nup155基因的PK-15细胞活力下降。本研究利用CRISPR/Cas9技术成功构建了1株Nup155基因部分敲除的PK-15细胞系，并发现部分敲除Nup155基因会显著影响PK-15细胞活力，为深入研究Nup155基因的功能机制提供了理想的细胞模型。

关键词： PK-15细胞基因敲除 Nup155 慢病毒包装

肺炎克雷伯菌榆中分离株OmpK17基因的克隆、生物信息学分析及免疫原性研究

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中国畜牧兽医 2019年第5期46卷 1456-1465页

作者：程家海殷娟斌白珊泽田泽暘庞红红包世俊甘肃农业大学动物医学院兰州730070

试验旨在研究肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)外膜蛋白OmpK17基因序列特征及其免疫原性。参照GenBank中肺炎克雷伯菌外膜蛋白OmpK17基因序列(登录号:U52843.1)设计1对特异性引物,应用PCR技术扩增获得了肺炎克雷伯菌榆中分离株(YZ株... 详细信息

试验旨在研究肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)外膜蛋白OmpK17基因序列特征及其免疫原性。参照GenBank中肺炎克雷伯菌外膜蛋白OmpK17基因序列(登录号:U52843.1)设计1对特异性引物,应用PCR技术扩增获得了肺炎克雷伯菌榆中分离株(YZ株)OmpK17基因CDS序列,应用相关软件及程序对OmpK17基因核苷酸序列及其推导的氨基酸序列进行生物信息学分析,构建其原核表达载体pET-OmpK17,并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行了表达。表达产物纯化后免疫新西兰兔制备多抗血清,应用ELISA和Western blotting分析了重组蛋白的免疫原性。结果显示,肺炎克雷伯菌YZ株外膜蛋白OmpK17基因高度保守,其CDS序列全长513 bp,编码170个氨基酸,与GenBank中其他肺炎克雷伯菌OmpK17基因序列同源性均高于99.6%;OmpK17蛋白分子质量约为18.5 ku,具有较强的亲水性,含有1个信号肽、1个跨膜区和6个抗原决定簇区域,是一种具有桶状三维结构的跨膜蛋白。SDS-PAGE结果显示,OmpK17基因在大肠杆菌中获得表达且表达产物主要以包涵体形式存在。ELISA及Western blotting结果表明,肺炎克雷伯菌OmpK17蛋白具有良好的免疫原性。本研究克隆和表达了肺炎克雷伯菌OmpK17基因及其编码蛋白,并证实该蛋白具有良好的免疫原性,为OmpK17基因的生物学特性研究和肺炎克雷伯菌检测方法的建立奠定了基础,为肺炎克雷伯菌基因工程疫苗的研发提供了理论依据。

关键词：肺炎克雷伯菌 OmpK17基因克隆生物信息学原核表达免疫原性

犬冠状病毒N蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备

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中国畜牧兽医 2020年第5期47卷 1318-1325页

作者：周亚花殷娟斌刘乐殷相平李彦敏张志东中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室兰州730046

本研究旨在克隆犬冠状病毒(canine coronavirus,CCV)N基因,体外表达N蛋白,并制备抗该蛋白质的多克隆抗体,用于CCV的诊断及其抗原的检测。参考GenBank中CCV的N基因序列(登录号:KY063618.2),选择CCV流行毒株的N基因,通过对该基因密码子进... 详细信息

本研究旨在克隆犬冠状病毒(canine coronavirus,CCV)N基因,体外表达N蛋白,并制备抗该蛋白质的多克隆抗体,用于CCV的诊断及其抗原的检测。参考GenBank中CCV的N基因序列(登录号:KY063618.2),选择CCV流行毒株的N基因,通过对该基因密码子进行优化和基因合成,最后选择一段有效基因构建重组表达质粒pET-B2M-N,将成功构建的重组质粒转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,挑取阳性克隆提取质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,通过0.5 mmol/L IPTG 30℃进行诱导表达。结果表明,优化诱导条件后成功表达出大小约为49 ku的重组蛋白。将重组蛋白与弗氏佐剂按一定比例混合,每隔2周免疫G767、G768两只日本大耳白兔数次,用间接ELISA检测G768抗体效价可达1∶512000,选用G768抗体进行抗体纯化,纯化后浓度可达10 mg/mL,用间接ELISA、Western blotting和间接免疫荧光试验对N蛋白纯化后制备的兔多克隆抗体进行检测分析,表明表达的重组N蛋白免疫原性良好,制备的多克隆抗体具有良好的反应原性。本研究为犬冠状病毒抗原抗体检测以及靶标CCV诊断试剂盒的建立奠定了一定的基础。

关键词：犬冠状病毒(CCV) N基因原核表达多克隆抗体

过表达HDAC6基因的Vero细胞系建立及其对狂犬病病毒增殖效率评价

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中国兽医科学 2023年第2期53卷 150-155页

作者：殷娟斌张志雄王莎莎马小琴梁正基孙跃峰王相伟殷相平中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室甘肃兰州730046

为提高狂犬病病毒(rabies virus,RABV)在细胞中的增殖效率,本研究利用慢病毒包装系统构建组蛋白去乙酰化酶6(histone deacetylase 6,HDAC6)过表达的Vero/HDAC6细胞系,分析RABV在Vero/HDAC6细胞系与Vero细胞中的复制差异。首先以非洲绿猴... 详细信息

为提高狂犬病病毒(rabies virus,RABV)在细胞中的增殖效率,本研究利用慢病毒包装系统构建组蛋白去乙酰化酶6(histone deacetylase 6,HDAC6)过表达的Vero/HDAC6细胞系,分析RABV在Vero/HDAC6细胞系与Vero细胞中的复制差异。首先以非洲绿猴HDAC6基因为目标构建重组质粒plv-SV40-puro-3×flag-HDAC6,并与辅助质粒pMD2.G和psPAX2共转染至HEK-293T细胞进行慢病毒包装。将包装好的慢病毒感染Vero细胞并通过嘌呤霉素筛选获得过表达HDAC6基因的阳性细胞。利用TCID50和Western-blot技术检测RABV在Vero/HDAC6细胞系中的复制能力。结果表明,过表达HDAC6能够明显促进RABV复制,并且RABV在Vero/HDAC6细胞系中的增殖能力高于野生型细胞。本研究构建的Vero/HDAC6细胞系能显著促进RABV的增殖,为RABV疫苗候选细胞株奠定了基础。

关键词：狂犬病病毒 HDAC6 Vero细胞慢病毒包装过表达细胞系

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王之江：中国激光之父

自然辩证法通讯 2025年第1期 98-104页

作者：陈崇斌汪志荣浙江师范大学生命科学学院安徽师范大学物理与电子信息学院

王之江是中国应用光学理论体系的创立者和应用光学实践的学术带头人，中国激光科学事业的主要开创者，在应用光学、激光科学、激光武器探索以及现代光学等很多领域取得了重要成就。王之江的成功，既归功于其个人独特的学习和科研风格，... 详细信息

王之江是中国应用光学理论体系的创立者和应用光学实践的学术带头人，中国激光科学事业的主要开创者，在应用光学、激光科学、激光武器探索以及现代光学等很多领域取得了重要成就。王之江的成功，既归功于其个人独特的学习和科研风格，也有国家需要的有力推动。

关键词：王之江应用光学激光激光武器现代光学

建构产品导向的问题解决模型——“制备光致变色AgBr凝胶”项目式教学

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化学教育(中英文) 2025年第1期 40-45页

作者：蔡玲玲林海斌吴君磊台州市第一中学温岭市新河中学

以“制备光致变色AgBr凝胶”为项目主题，基于学生的真实体验设计“制备透明的AgBr凝胶”“制备紫外光照变色的AgBr凝胶”2个关联任务，建构产品导向的问题解决模型。学生在开放的探究和实践的体验中不断解决问题、创新产品，生成结构... 详细信息

以“制备光致变色AgBr凝胶”为项目主题，基于学生的真实体验设计“制备透明的AgBr凝胶”“制备紫外光照变色的AgBr凝胶”2个关联任务，建构产品导向的问题解决模型。学生在开放的探究和实践的体验中不断解决问题、创新产品，生成结构化的知识和系统化的观念，发展批判思维与创新能力。

关键词：项目式教学产品导向问题解决溴化银凝胶

piR-7472影响电压调控钾离子通道促进小鼠成骨细胞分化的机制

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中国组织工程研究 2025年第14期29卷 2868-2874页

作者：隆宇斌王湘斌樊基耿杨厚志杨洋李勇邵阳市中心医院脊柱外科湖南省邵阳市422000 天津医科大学研究生院天津市300070 邵阳市中心医院肿瘤内科湖南省邵阳市422000

背景:现有研究在PIWI相互作用RNA(piRNA)抗骨质疏松方面取得了重大进展,但piRNA发挥功能的具体靶点和相关机制仍有待探索。目的:探讨piR-7472对小鼠成骨细胞(MC3T3-E1细胞)分化的影响及下游机制。方法:①12只C57/BL6J小鼠随机分为假手... 详细信息

背景:现有研究在PIWI相互作用RNA(piRNA)抗骨质疏松方面取得了重大进展,但piRNA发挥功能的具体靶点和相关机制仍有待探索。目的:探讨piR-7472对小鼠成骨细胞(MC3T3-E1细胞)分化的影响及下游机制。方法:①12只C57/BL6J小鼠随机分为假手术组和卵巢切除组,每组6只,术后8周通过Micro-CT检测小鼠的骨量,RT-qPCR检测piR-7472的表达;②将MC3T3-E1细胞分为NC mimics组、piR-7472 mimics组、NC inhibitor组与piR-7472 inhibitor组,转染后成骨诱导7 d采用RT-qPCR检测piR-7472、骨桥蛋白、胶原蛋白Ⅰ、Runt相关转录因子2、钾电压门控通道调节因子亚家族F成员1 mRNA的表达;成骨诱导7 d采用Western blot检测骨桥蛋白、Runt相关转录因子2、骨形态发生蛋白2、钾电压门控通道调节因子亚家族F成员1(KCNF1)蛋白表达;成骨诱导14 d通过碱性磷酸酶染色检测碱性磷酸酶的表达;成骨诱导21 d通过茜素红染色检测矿化结节数量;③双荧光素酶报告基因实验观察piR-7472是否能与钾电压门控通道调节因子亚家族F成员1相结合。结果与结论:①与假手术组相比,卵巢切除组小鼠骨密度、骨体积分数、骨小梁厚度、骨小梁数量明显下降,骨小梁分离度明显升高,并且骨组织中piR-7472 mRNA表达明显下调;②与NC组相比,piR-7472 mimics组骨桥蛋白、胶原蛋白Ⅰ、Runt相关转录因子2的mRNA表达明显升高,骨桥蛋白、Runt相关转录因子2、骨形态发生蛋白2的蛋白表达明显升高,矿化沉积与碱性磷酸酶表达增多;与NC inhibitor组相比,piR-7472 inhibitor组骨桥蛋白、胶原蛋白Ⅰ、Runt相关转录因子2的mRNA表达明显降低,骨桥蛋白、Runt相关转录因子2、骨形态发生蛋白2的蛋白表达明显降低,矿化沉积与碱性磷酸酶表达降低;③通过miRanda数据库预测发现piR-7472能与KCNF1相互作用;双荧光素酶报告基因实验发现piR-7472 mimcis能与钾电压门控通道调节因子亚家族F成员1结合并促进其表达。结果表明:piR-7472能够促进成骨前体细胞MC3T3-E1成骨分化,其发挥作用的机制可能是通过促进KCNF1表达实现的。

关键词：成骨细胞MC3T3-E1 PIWI相互作用RNA 成骨分化骨质疏松症电压调控的钾离子通道 KCNF1

结合Udwadia-Kalaba控制理论的下肢外骨骼步态轨迹跟踪控制

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西安交通大学学报 2025年第1期59卷 148-158页

作者：肖志毅沙连森邹学坤黄锟李永斌刘斌中国科学技术大学生物医学工程学院(苏州) 江苏苏州215000 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所江苏苏州215000

针对现有轨迹跟踪控制方法较难兼顾控制精度与稳定性的问题,提出一种基于Udwadia-Kalaba(U-K)控制理论的鲁棒控制方法。基于拉格朗日法建立机器人动力学模型,将动力学参数分为确定的名义部分与不确定部分;结合U-K理论与系统名义部分参... 详细信息

针对现有轨迹跟踪控制方法较难兼顾控制精度与稳定性的问题,提出一种基于Udwadia-Kalaba(U-K)控制理论的鲁棒控制方法。基于拉格朗日法建立机器人动力学模型,将动力学参数分为确定的名义部分与不确定部分;结合U-K理论与系统名义部分参数确定外骨骼机器人系统理想运动轨迹约束下的名义部分控制力矩;为消除机器人系统不确定部分的影响,引入鲁棒控制器,通过划分不确定性边界确定其应输出的额外控制力矩。仿真结果表明:相较于传统PID算法,基于U-K控制理论的鲁棒控制的外骨骼机器人髋关节、膝关节角度的轨迹跟踪控制精度分别提高了76.4%和96.8%。基于设计的下肢外骨骼机器人样机进行轨迹跟踪对比实验,实验结果表明:基于该方法的下肢外骨骼髋关节、膝关节角度的轨迹跟踪精度为0.467 0°和0.114 1°,相比作为对照的PID算法,分别提高了82.6%和86.8%,同时系统整体控制周期缩短了56.6%,该控制方法具有更高的同步性、控制精度与稳定性。

关键词：下肢外骨骼机器人 Udwadia-Kalaba控制理论鲁棒控制轨迹跟踪控制

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