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奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌Csa1A、Hlɑ和EsxA-B重组蛋白表达及免疫效果评价

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中国预防兽医学报 2021年

作者：王宇段跃强李建云内蒙古农业大学兽医学院/农业农村部动物临床诊疗技术重点实验室内蒙古华希生物科技有限公司内蒙古综合疾病预防控制中心

为评价Csa1A、Hlɑ和EsxA-B重组蛋白的免疫保护作用。本研究构建了重组质粒pGEX-4T-2-Csa1A、pET-22b-Hlα、pGEX-4T-2-EsxA-B并分别转化大肠杆菌BL21（DE3），经IPTG诱导表达、利用层析柱进行纯化，并以SDS-PAGE电泳检测重组蛋白，得到... 详细信息

为评价Csa1A、Hlɑ和EsxA-B重组蛋白的免疫保护作用。本研究构建了重组质粒pGEX-4T-2-Csa1A、pET-22b-Hlα、pGEX-4T-2-EsxA-B并分别转化大肠杆菌BL21（DE3），经IPTG诱导表达、利用层析柱进行纯化，并以SDS-PAGE电泳检测重组蛋白，得到Csa1A、Hlɑ和EsxA-B重组蛋白，3种蛋白纯度分别为89%、95%、85%，大小分别为54 ku、33 ku和39 ku。以纯化的重组Csa1A、Hlɑ和EsxA-B蛋白为抗原，分别免疫Balb/c小鼠，免3次，每次间隔14d，静脉采血，制备血清，采用间接ELISA法检测抗体效价，3种重组蛋白免疫小鼠后均能刺激小鼠机体产生较高效价的抗体，三免后抗体效价分别为14700，16890，15760。再分别以3种血清型金黄色葡萄球菌尾静脉注射攻毒，观察并统计小鼠的发病率和死亡率，评价重组蛋白的免疫保护性。结果表明，Csa1A、Hlɑ和EsxA-B重组蛋白免疫组针对SACP5、SACP8、SACP336型菌株的保护率分别为60%、60%、50%；80%、70%、70%；50%、60%、60%，其中重组Hlα蛋白免疫保护效果最佳，其对3种攻毒菌株保护率均大于70%，是较为理想的疫苗候选抗原。以上结果表明，金黄色葡萄球菌Hlα重组蛋白能够使免疫动物产生抗体，对攻毒小鼠具有不同程度的保护性，为奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌亚单位疫苗的研制和应用的有效性提供科学依据。

关键词：奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌 α-溶血素亚单位疫苗免疫原性免疫保护力

致奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌Csa1A、Hlɑ和EsxA-B重组蛋白的表达及免疫效果的评价

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中国预防兽医学报 2021年第8期43卷 867-872页

作者：王宇段跃强李建云内蒙古农业大学兽医学院/农业农村部动物临床诊疗技术重点实验室内蒙古呼和浩特010018 内蒙古华希生物科技有限公司内蒙古呼和浩特010111 内蒙古综合疾病预防控制中心内蒙古呼和浩特010031

为评价金黄色葡萄球菌(S. aureus)Csa1A、Hlɑ和EsxA-B蛋白的免疫保护作用,本研究构建了重组质粒p GEX-4T-2-Csa1A、pET-22b-Hlα、pGEX-4T-2-EsxA-B并分别转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导并利用相应层析柱纯化后,采用SDS-PAGE检测重组蛋白的表达。结果显示,获得了纯度较高的重组蛋白Csa1A(rCsa1A)、Hlɑ(r Hlɑ)和EsxA-B(r EsxA-B),纯度分别为89%、95%、85%,大小分别为54 ku、33 ku和39 ku。以纯化的r Csa1A、rHlɑ和rEsxA-B 60μg/只分别免疫BALB/c小鼠,共免疫3次,每次间隔14 d,采用间接ELISA法检测各组小鼠免疫后14 d的抗体效价。结果显示,3种重组蛋白免疫后均能刺激小鼠产生较高效价的抗体,三免后抗体效价分别为1:14 700(rCsa1A)、1:16 890(rHlɑ)、1:15 760(rEsxA-B)。利用5型NM2株(2×10^(7)cfu/只)、8型LZ145株(2×10^(7)cfu/只)、336型XJ44株(2×10^(7)cfu/只)3种血清型S. aureus分别经尾静脉注射攻菌,观察并统计各组小鼠的发病和死亡率,评价各重组蛋白的免疫保护率。结果显示,分别经原核表达了rCsa1A、rHlɑ和rEsxAB。攻菌后对照组小鼠全部死亡;3组重组蛋白免疫组96 h内死亡的小鼠在攻菌48 h后出现精神沉郁,食欲不振等症状,而存活小鼠未出现临床症状。r Csa1A、rHlɑ和rEsxA-B免疫组小鼠提供的抵抗NM2、LZ145、XJ44菌株攻击的保护率分别为60%、60%、50%;80%、70%、70%;50%、60%、60%,其中rHlα的免疫保护效果最佳,其对3种攻毒菌株提供的平均保护率为73.3%,是较为理想的亚单位疫苗候选抗原。以上结果表明,S. aureus rHlα能够刺激免疫小鼠产生抗体,对小鼠提供不同程度的保护力。本研究为奶牛乳腺炎S. aureus亚单位疫苗的研制和应用提供参考依据。

关键词：奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌 α-溶血素亚单位疫苗免疫原性免疫保护力

重组IL-1β蛋白表达纯化及佐剂效应的评价

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免疫学杂志 2014年第3期30卷 192-196页

作者：石颖段跃强邢丽杨鹏辉王希良军事医学科学院微生物流行病研究所病原微生物生物安全国家重点实验室北京100071

目的应用原核表达系统制备IL-1β重组蛋白,并作为流感喷鼻疫苗的佐剂,研究其作为喷鼻疫苗佐剂的有效性。方法从Genbank获得IL-1β的基因cDNA序列,在大肠杆菌中表达。分离纯化表达产物,与甲型H1N1流感喷鼻疫苗均匀混合,免疫Balb/c小鼠,... 详细信息

目的应用原核表达系统制备IL-1β重组蛋白,并作为流感喷鼻疫苗的佐剂,研究其作为喷鼻疫苗佐剂的有效性。方法从Genbank获得IL-1β的基因cDNA序列,在大肠杆菌中表达。分离纯化表达产物,与甲型H1N1流感喷鼻疫苗均匀混合,免疫Balb/c小鼠,通过对体液免疫、黏膜免疫和细胞免疫水平的检测,证明rIL-1β蛋白佐剂的有效性。结果 rIL-1β蛋白在大肠杆菌中获得了高效表达,表达量约是30%,纯度是94.5%。制备的rIL-1β蛋白具有无毒、稳定和良好的生物活性。通过对小鼠的免疫实验证明,rIL-1β作为喷鼻疫苗佐剂对体液、黏膜和细胞免疫应答均有良好的增强效果。结论 rIL-1β蛋白具有黏膜佐剂的作用,为深入研究佐剂效应提供了实验数据。

关键词：白介素1—β 原核表达蛋白纯化佐剂

牛呼吸道疾病病原BVDV、IBRV、BPIV3和牛支原体的分离鉴定

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当代畜禽养殖业 2022年第5期 12-16页

作者：吴志强石悦萌寇曌婷王鑫黄素文段跃强内蒙古华希生物科技有限公司内蒙古呼和浩特010111

2021年12月,内蒙古、山西某肉牛场暴发呼吸道疾病。为了确诊病原,无菌采集发病牛血液、鼻拭子接种于MDBK细胞和Hayflick液体培养基进行病毒和细菌的分离鉴定,同时对分离培养物进行PCR鉴定。将分离毒株负染制样,在透射电镜下观察病毒形态... 详细信息

2021年12月,内蒙古、山西某肉牛场暴发呼吸道疾病。为了确诊病原,无菌采集发病牛血液、鼻拭子接种于MDBK细胞和Hayflick液体培养基进行病毒和细菌的分离鉴定,同时对分离培养物进行PCR鉴定。将分离毒株负染制样,在透射电镜下观察病毒形态;并对疑似支原体菌落进行吉姆萨染色、Dienes染色,观察菌体形态。根据病毒和细菌分离结果初步鉴定为多种病原混合感染所引起。从PCR检测以及电镜观察、染色结果可以得出,引起这次牛呼吸道疾病综合征的病原为牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)、牛副流感病毒型(BPIV3)和牛支原体(Mycoplasma bovis)。

关键词：呼吸道疾病综合征牛病毒性腹泻病毒牛传染性鼻气管炎病毒牛副流感病毒3型牛支原体

重组产气荚膜梭菌α毒素对家兔的安全性和免疫效力评价

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中国预防兽医学报 2023年第4期45卷 429-433页

作者：赵晓军王美玲段跃强谭美玲石悦萌陈千林郭庆勇内蒙古伊利实业集团股份有限公司内蒙古呼和浩特010110 新疆农业大学动物医学学院新疆乌鲁木齐830052 内蒙古华希生物科技有限公司内蒙古呼和浩特010110

为探究重组产气荚膜梭菌α毒素对家兔的安全性和免疫保护效力,本研究构建了含产气荚膜梭菌α毒素基因的重组质粒pVL1393-CPA,并通过BD BaculoGoldTM转染试剂盒转染Sf9细胞后,经噬斑纯化获得单克隆重组病毒,将其感染High 5细胞进行表达,... 详细信息

为探究重组产气荚膜梭菌α毒素对家兔的安全性和免疫保护效力,本研究构建了含产气荚膜梭菌α毒素基因的重组质粒pVL1393-CPA,并通过BD BaculoGoldTM转染试剂盒转染Sf9细胞后,经噬斑纯化获得单克隆重组病毒,将其感染High 5细胞进行表达,表达的重组蛋白经SDS-PAGE和western blot检测,结果显示均获得了45 ku的目的蛋白,即为重组α毒素。将重组α毒素用0.1%甲醛溶液灭活脱毒后与ISA 206 VG佐剂乳化制备亚单位疫苗(抗原含量为20μg/mL),以40μg/只肌肉注射体质量1.5 kg~2.0 kg的家兔,同时设PBS对照组,注射后连续观察7 d,结果显示实验兔临床观察无异常,该疫苗对家兔的安全性良好。随后以20μg/只肌肉注射家兔,免疫21 d后以相同剂量加强免疫一次,同时设佐剂对照组和α毒素对照组,首免21 d、二免14 d时采血分离血清,采用ELISA方法检测免疫兔血清IgG抗体效价,同时进行二免血清小鼠体内毒素中和试验以及家兔攻毒免疫保护试验,以评价该疫苗对家兔的免疫保护效力。结果显示,疫苗免疫组家兔血清IgG抗体效价比佐剂对照组和毒素对照组均极显著增高(P<0.001),二免血清对A型产气荚膜梭菌毒素小鼠体内的中和效价为32,疫苗免疫组家兔攻毒后均健活,攻毒保护率达100%,佐剂对照组和毒素对照组家兔攻毒后死亡率则为100%。上述结果表明制备的重组产气荚膜梭菌α毒素疫苗对家兔具有良好的安全性和免疫保护效力,本研究为开发其他各型梭菌亚单位疫苗提供了重要借鉴。

关键词：产气荚膜梭菌 α毒素疫苗中和效价攻毒保护

A/California/07／2009亚型猪流感冷适应减毒疫苗株的拯救及免疫效果评价

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生物化学与生物物理进展 2010年第12期37卷 1289-1295页

作者：段跃强罗德炎邢丽杨鹏辉赵忠鹏贾卫红李培锋王希良军事医学科学院微生物流行病研究所病原微生物生物安全国家重点实验室北京100071 内蒙古农业大学兽医系呼和浩特010018

应用反向遗传学技术,选择冷适应、温度敏感、减毒的A/Ann Arbor/6/60 ca(H2N2)型流感病毒的6个内部基因为骨架,与A/California/07/2009株流感病毒2个抗原基因HA、NA分别克隆到polⅠ-polⅡ转录表达载体pAD3000中,构建8个转录表达载体重... 详细信息

应用反向遗传学技术,选择冷适应、温度敏感、减毒的A/Ann Arbor/6/60 ca(H2N2)型流感病毒的6个内部基因为骨架,与A/California/07/2009株流感病毒2个抗原基因HA、NA分别克隆到polⅠ-polⅡ转录表达载体pAD3000中,构建8个转录表达载体重组质粒,共转染Vero细胞,获得重配A/California/07/2009ca株流感病毒.重配病毒的TCID50为7.5,病毒传4代后其血凝素(HA)滴度稳定在1∶256,半数感染剂量EID50为8,鸡胚传20代,经RT-PCR鉴定未发现重组病毒基因突变,电镜观察重配病毒符合流感病毒的主要特征;蔗糖纯化的病毒经肌肉注射(灭活)及滴鼻(减毒活病毒)两种途径免疫BALB/c小鼠,结果显示:滴鼻免疫和肌肉注射都可以产生较高效价的血凝抑制(HI)抗体,肌肉注射组产生的HI抗体略高(P=0.044),但肌肉注射组检测不到高效价IgA抗体;滴鼻免疫组鼻冲洗液中可以检测到高效价的IgA抗体,同型病毒感染后,IL-1β、TNFα、IFN-α等前炎因子分泌较早,且高于肌肉注射组(P<0.05),可见,喷鼻减毒疫苗比灭活全病毒疫苗能更好地激发黏膜免疫反应.通过对小鼠各个器官病毒载量的检测发现,4天后鼻腔、气管、脑、肺、脾脏没有病毒存在,证明减毒活疫苗株在小鼠上是安全的.以上数据可以初步断定,重组病毒有作疫苗候选株的可能,而且喷鼻疫苗具有降低免疫剂量、同时激活体内体液免疫和细胞免疫的功能.

关键词：反向遗传学技术 A/California/07/2009亚型猪流感 8质粒拯救系统

重组嵌合表达G蛋白中和表位的流感病毒载体RSV疫苗构建和免疫保护效果

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免疫学杂志 2013年第5期29卷 369-375页

作者：卞成蓉刘娜邢丽段跃强王希良周娅杨鹏辉宁夏医科大学基础医学院病原生物学和免疫学教研室银川750004 军事医学科学院微生物流行病研究所病原微生物生物安全国家重点实验室北京100071 解放军第302医院临床检验中心北京100039

目的构建和拯救重组嵌合表达G蛋白表位的流感病毒载体RSV疫苗株,并通过动物实验评价其免疫原性及免疫保护性。方法利用流感病毒反向遗传学技术,以流感病毒为载体,将RSV保护性抗原G蛋白表位的基因插入到流感病毒非结构蛋白NS1基因,拯救... 详细信息

目的构建和拯救重组嵌合表达G蛋白表位的流感病毒载体RSV疫苗株,并通过动物实验评价其免疫原性及免疫保护性。方法利用流感病毒反向遗传学技术,以流感病毒为载体,将RSV保护性抗原G蛋白表位的基因插入到流感病毒非结构蛋白NS1基因,拯救重组嵌合表达G蛋白中和表位的流感病毒载体RSV疫苗株rFLU/RSV/G,进而对rFLU/RSV/G的特性进行全面鉴定。rFLU/RSV/G滴鼻免疫Balb/c小鼠,通过检测中和抗体效价、血清抗体(IgG、IgG1、IgG2a)和黏膜抗体sIgA效价以及细胞因子(IL-2、IL-4、IL-5、IFN-γ和TNF-α)的分泌量来评价机体产生的体液、细胞和黏膜免疫反应。攻毒实验评价rFLU/RSV/G的免疫保护性,观测小鼠的体质量变化、病毒载量、存活情况以及肺病理变化。结果成功拯救出重组嵌合表达G蛋白表位的流感病毒载体RSV疫苗株rFLU/RSV/G。重组病毒rFLU/RSV/G与流感病毒颗粒形态和大小分布相符,并且表达针对RSV的特异性蛋白NS1-G。动物实验表明rFLU/RSV/G诱导小鼠机体产生较高的中和抗体、RSV特异性的Th1型细胞免疫反应以及黏膜免疫反应。攻毒实验显示rFLU/RSV/G对RSV A2株和PR8流感病毒野毒株具有一定免疫保护效果,能够有效降低肺鼻的病毒载量,肺组织病变情况明显减轻,且无小鼠死亡。结论重组嵌合表达G蛋白表位的流感病毒载体RSV疫苗株rFLU/RSV/G是一个有前景的RSV候选疫苗株,具有较高的免疫原性和免疫保护性,值得在棉鼠和猴子进行进一步研究。

关键词：流感病毒 RSV G蛋白表位病毒载体

呼吸道合胞病毒样颗粒疫苗制备及免疫效果研究

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免疫学杂志 2014年第5期30卷 387-392页

作者：孙苏静谷宏婧陈锐段跃强王希良杨鹏辉军事医学科学院微生物流行病研究所北京100071

目的利用昆虫表达系统表达以流感病毒基质蛋白M1为骨架制备的嵌合呼吸道合胞病毒(RSV)融合蛋白F和表面糖蛋白G蛋白的呼吸道合胞病毒样颗粒(RSV-F/G VLPs)疫苗候选株,并滴鼻免疫Balb/c小鼠,评价其免疫原性与免疫保护性。方法通过基因重... 详细信息

目的利用昆虫表达系统表达以流感病毒基质蛋白M1为骨架制备的嵌合呼吸道合胞病毒(RSV)融合蛋白F和表面糖蛋白G蛋白的呼吸道合胞病毒样颗粒(RSV-F/G VLPs)疫苗候选株,并滴鼻免疫Balb/c小鼠,评价其免疫原性与免疫保护性。方法通过基因重组技术制备以流感基质蛋白M1为骨架,并嵌合RSV F/G蛋白的RSV-F/G VLPs,经超滤浓缩、蔗糖密度梯度离心纯化VLP,滴鼻免疫Balb/c小鼠,检测血清抗体IgG、IgG1、IgG2a,黏膜sIgA效价以及细胞因子IL-4、INF-γ等,评价候选疫苗的免疫原性;二免后2周RSV A2株攻毒,通过检测小鼠体质量变化,肺病毒载量及肺病理切片来评价候选疫苗的免疫保护性。结果成功制备了RSV-F VLPs、RSV-G VLPs疫苗抗原,动物实验结果证实,候选疫苗株RSV-F/G VLPs可刺激机体产生特异性Th1型细胞免疫及黏膜免疫;攻毒实验结果表明候选疫苗株RSV-F/G VLPs针对RSV A2株的攻击可以产生一定的保护效果。结论成功制备了RSV-F VLPs、RSV-G VLPs候选疫苗抗原,并通过动物实验证明RSV-F/G VLPs具有良好的免疫原性和免疫保护性,为发展新型RSV疫苗提供实验依据。

关键词：呼吸道合胞病毒病毒样颗粒疫苗

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猪轮状病毒的分离与电镜观察

畜牧与兽医 2014年第1期46卷 77-80页

作者：王振玲章丽娇段跃强赵德明中国农业大学动物医学院北京100193 北京农业职业学院北京102442 中国人民解放军军事医学科学院北京100071

近年来,北京地区猪轮状病毒感染,不仅严重威胁养殖业的发展,同时威胁到肉食品和人类的安全。取胶体金抗原检测为阳性的2头哺乳仔猪病料用Marc-145细胞培养,分离到1株轮状病毒,连续盲传至4代出现细胞病变,用Marc-145细胞进行病毒噬斑纯化... 详细信息

近年来,北京地区猪轮状病毒感染,不仅严重威胁养殖业的发展,同时威胁到肉食品和人类的安全。取胶体金抗原检测为阳性的2头哺乳仔猪病料用Marc-145细胞培养,分离到1株轮状病毒,连续盲传至4代出现细胞病变,用Marc-145细胞进行病毒噬斑纯化,挑取单克隆病毒株扩大培养后,将病毒感染Marc-145细胞7 d后,应用Reed-Muench法计算轮状病毒TCID50为106.6/0.1 mL,用感染细胞超薄切片进行电镜观察,可见典型的晶格状排列的轮状病毒粒子,为轮状病毒感染的诊断提供了科学依据。

关键词：猪轮状病毒分离电镜观察北京