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维甲酸对大鼠脂肪源干细胞中生殖细胞相关基因及细胞周期的影响

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维甲酸对大鼠脂肪源干细胞中生殖细胞相关基因及细胞周期的影响

作者：段富华南方医科大学

学位级别：硕士

背景原林教授提出的筋膜学两系统理论认为：人体由非特异性结缔组织筋膜支架构成的支持与储备系统和被该筋膜支架所包绕的功能系统所构成。支持与储备系统以干细胞为核心,可为功能系统的更新提供细胞补充,并为功能系统的各种功能细胞... 详细信息

背景原林教授提出的筋膜学两系统理论认为：人体由非特异性结缔组织筋膜支架构成的支持与储备系统和被该筋膜支架所包绕的功能系统所构成。支持与储备系统以干细胞为核心,可为功能系统的更新提供细胞补充,并为功能系统的各种功能细胞的更新、代谢提供一个较为稳定内部环境和干细胞源。疏松结缔组织是支持与储备系统重要的组成部分,其中的脂肪源干细胞(adipose-derived stem cells, ADSCs)是机体重要的干细胞储备之一。目前对脂肪源干细胞的研究已取得重大进展。脂肪源干细胞是从脂肪组织中获取的一类具有多向分化潜能的成体干细胞,称之为adipose-derived stem cells (ADSCs)。Zuk等首次从人的脂肪组织悬液中分离出了可以在体外稳定增殖、具有多向分化能力的脂肪组织提取细胞(processed lipoaspirate ***细胞)。与其他成体干细胞比较,PLA细胞具有来源广泛、取材方便,创伤小且不存在免疫排斥反应等优点,实验证明ADSCs具有跨胚层的多向分化潜能。它可以分化成中胚层来源的脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞、心肌细胞,外胚层来源的神经细胞,也可以分化成内胚层来源的内皮细胞,及肝细胞等。但脂肪干细胞是否能够向生殖细胞方向分化呢? 生殖细胞(germ cell)是多细胞生物体内能繁殖后代的细胞的总称,包括从原始生殖细胞直到最终已分化的生殖细胞。人类胚胎发育到第3周末,胚胎产生三个原始胚层(内胚层、中胚层和外胚层)。发育到第4周,胚外外胚层诱导临近的上胚层内产生原始生殖细胞(primordial germ cell, PGC)。迁移入生殖嵴后的PGC,开始了性别的分化。胚胎生殖细胞具有多能性,细胞标记与ES细胞几乎是一致的,碱性磷酸酶染色和Oct4表达均呈阳性,通常用此标记检测小鼠体内组织中特化的PGC。在胚胎6.25d, Vasa是生殖细胞特异的三磷酸腺(ATP)依赖的RNA解旋酶,Vasa编码的RNA结合蛋白定位于胞质,在生殖嵴区域的PGC中表达,是迁移后期进入性腺的生殖细胞包括生殖母细胞特异性标记基因。、Vasa基因在卵巢和睾丸组织中表达,成体组织中检测不到,是生殖细胞分化的高度特异性标志。到目前为止,Vasa是唯一对于生殖细胞系完全特异的,大多数种属细胞中Vasa表达出现即代表生殖细胞特化。组织非特异碱性磷酸酶(tissue non-specificalkaline phosphatase, TNAP)作为PGC的标志物,可监测PGC由尿囊到生殖嵴的迁移过程。在精子和卵细胞形成过程中,Stra8调节减数分裂起始,减数分裂是通过RA诱导的Stra8实现的。干细胞体外诱导分化的方法大致有3种：①培养基中添加诱导分化因子,目前使用最多最广泛;②与希望诱导分化的目的细胞共培养;③目的基因转染,使拟诱导分化的细胞表达。本实验是在培养基中添加诱导剂维甲酸和睾酮对脂肪干细胞进行诱导。维甲酸是配子形成的一个基本调节者。人们已经很确定的是,维甲酸是由饮食维生素A合成的,是雌雄配子进入减数分裂所需要的,维生素A的缺乏会导致这个过程的停止。雌鼠的性腺性别被决定后减数分裂很快被发起,由于减数分裂是通过RA诱导的Stra8实现的,这种发起会被RA拮抗物或是敲去Stra8所阻断。Stra8主要在减数分裂前生殖细胞中表达,一旦进入减数分裂,Stra8mRNA水平在生殖细胞中大大降低或消失。睾酮是由睾丸分泌的一种类固醇激素,是人体内主要的雄激素,与男性第二性征的发育有关,在精子发生过程中具有重要作用。本实验基于筋膜学理论,研究探索脂肪源干细胞是否在体外诱导情况下具有向生殖系分化潜能,即在体外诱导情况下,观察是否能检测出生殖系特异性基因的表达。目的 MSCs的多组织来源性,与筋膜结缔组织支架的全身分布性具有一致性,其横向、纵向分化的生物学特性,与筋膜结缔组织对机体的支持储备作用也是一致的。ADSCs是筋膜中未分化干细胞的一种储备形式。本实验采用大鼠筋膜结缔组织皮下脂肪作为组织来源,分离培养ADSCs,并对其表型鉴定,探讨筋膜结缔组织中对机体产生支持储备作用的细胞学基础;研究ADSCs在维甲酸诱导下是否能表达生殖细胞相关基因Stra8, Vasa, Oct4, Dazl, Nobox和Piwil,进而判断ADSCs是否具有向生殖细胞分化的潜能;研究在睾酮和维甲酸单独和联合诱导下,ADSCs细胞周期的变化,进而判断睾酮和维甲酸对细胞周期的影响。 1通过细胞分离培养判断非特异性筋膜结缔组织中是否存在未分化的间充质干细胞,以及这种干细胞的相关特性;2、通过RT-PCR技术观察ADSCs在维甲酸诱导下是否能表达生殖细胞相关基因Stra8和Vasa,进而判断ADSCs是否具有向生殖细胞分化的潜能;3、通过定量PCR技术

关键词：脂肪源干细胞筋膜学维甲酸碱性磷酸酶 Vasa Stra8Oct4Dazl Nobox Piwil 细胞周期

季戊四醇酯类热稳定剂的合成及在聚氯乙烯中的应用研究

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季戊四醇酯类热稳定剂的合成及在聚氯乙烯中的应用研究

作者：段富华华南理工大学

学位级别：硕士

季戊四醇酯是一类重要的聚氯乙烯辅助热稳定剂，一般与硬脂酸锌/硬脂酸钙复合使用，不仅无毒且同时具有一定的增塑、润滑作用，能满足聚氯乙烯（PVC）加工过程中多方面的要求，因而得到广泛研究与应用。季戊四醇（PET）和双季戊四醇（D... 详细信息

季戊四醇酯是一类重要的聚氯乙烯辅助热稳定剂，一般与硬脂酸锌/硬脂酸钙复合使用，不仅无毒且同时具有一定的增塑、润滑作用，能满足聚氯乙烯（PVC）加工过程中多方面的要求，因而得到广泛研究与应用。季戊四醇（PET）和双季戊四醇（DPET）分别都具有一定的热稳定作用，但是与PVC的相容性较差;将PET、DPET以及两者的混合物（PET与DPET按一定质量比混合，简称MixPET）与己二酸（AA）酯化，通过控制酯化度，使产物保留一部分的羟基，同时生成一部分酯基，这样得到的季戊四醇酯类与PVC相容性好，且具有热稳定和润滑作用双重效果。本文通过PET，DPET，MixPET分别与己二酸进行酯化反应，得到了三类季戊四醇酯类热稳定剂，研究了各种反应条件如原料配比，反应温度，反应时间，催化剂的种类以及催化剂的添加量等对产物性能的影响，利用傅里叶变换红外光谱法（FTIR）和质谱法（MS）研究了产物的结构。PET的熔点为262℃，DPET的熔点为220℃左右，均高于PVC的加工温度（180℃），不利于加工，而两者的混合物熔点则低于其中的任意一种，且由于熔点较低，酯化反应温度相应降低，通过控制PET与DPET原料比例控制MixPET酯化产物的熔点。采用差示扫描量热分析法（DSC）研究了PET，DPET，MixPET与己二酸的酯化产物的熔融温度，结果表明随着己二酸量的增加，产物的熔点均降低;且对于MixPET体系，随着PET量的增产物的熔点降低更显著;其他因素对产物熔点的影响并不大。其中PET，DPET与己二酸反应的最佳摩尔比分别为2/0.7，2/1.3;在DPET、PET、己二酸三者质量比为41/32/27时，所生成的混合季戊四醇酯的熔点为151.1℃，比双季戊四醇己二酸酯的184.8℃低33.7℃。利用DSC和HAAKE转矩流变实验研究了各因素对产物性能的影响，以此确定了较合适的反应条件，保证了产物不仅具有尽量低的熔点，而且还具有较好的热稳定效果和加工性能。热重分析（TG）研究表明，PET，DPET和MixPET与己二酸的酯化物具有较好的热稳定性，开始分解温度分别为245℃，355℃和285℃，均远高于PVC的加工温度。利用HAAKE转矩流变实验、刚果红实验和热烘箱老化实验研究了三种季戊四醇酯作用于PVC的热稳定效果，结果表明，MixPET体系所得的产物的热稳定效果较PET体系和DPET体系优异，加工性能也较好。

关键词： PVC 热稳定剂季戊四醇双季戊四醇内润滑作用热稳定效果

一例Miller-Dieker综合征胎儿的产前诊断及遗传学分析

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中华医学遗传学杂志 2021年第1期38卷 71-73页

作者：段富华孔祥东郑州大学第一附属医院妇产科遗传与产前诊断中心 450052

目的对1例无脑回畸形胎儿进行遗传学诊断,分析其可能的发生机制,为临床诊断和遗传咨询提供依据。方法应用拷贝数变异分析(copy number variation,CNV)技术检测分析胎儿羊水细胞DNA。结果CNV检测结果显示胎儿染色体17p13.3p13.2区存在5.0... 详细信息

目的对1例无脑回畸形胎儿进行遗传学诊断,分析其可能的发生机制,为临床诊断和遗传咨询提供依据。方法应用拷贝数变异分析(copy number variation,CNV)技术检测分析胎儿羊水细胞DNA。结果CNV检测结果显示胎儿染色体17p13.3p13.2区存在5.02 Mb杂合缺失,该缺失片段完全覆盖Miller-Dieker综合征所在区域(chr17:1~2588909)。结论胎儿诊断为Miller-Dieker综合征,17号染色体短臂末端PAFAH1B1基因缺失可能是造成胎儿无脑回畸形的关键基因。

关键词： Miller-Dieker综合征 PAFAH1B1基因无脑回畸形

一例无汗型外胚层发育不良患儿的临床及遗传学分析

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中华医学遗传学杂志 2021年第5期38卷 469-471页

作者：段富华翟仪稳孔祥东郑州大学第一附属医院妇产科遗传与产前诊断中心 450052

目的探讨1例无汗型外胚层发育不良患儿的临床及遗传学特点。方法搜集患儿的临床资料,抽取患儿及其父母血样,采用全基因组拷贝数变异联合全外显子组测序的方法对患儿进行基因检测。结果患儿临床表现毛发稀疏、无汗,多囊性肾发育不良、外... 详细信息

目的探讨1例无汗型外胚层发育不良患儿的临床及遗传学特点。方法搜集患儿的临床资料,抽取患儿及其父母血样,采用全基因组拷贝数变异联合全外显子组测序的方法对患儿进行基因检测。结果患儿临床表现毛发稀疏、无汗,多囊性肾发育不良、外生殖器发育畸形、肛门闭锁。检测到患儿X染色体1区3带68836147~68836553位置存在半合子缺失(约406 bp),该缺失区域涉及EDA基因第1外显子。患儿母亲检测到该位点的杂合缺失,患儿父亲该位点未见缺失或重复。结论EDA基因第1外显子半合子缺失可能为该外胚层发育不良患儿的致病原因,基因检测结果可以为该家系的遗传咨询及产前基因诊断提供依据。

关键词：无汗型外胚层发育不良 EDA基因肛门闭锁多囊性肾发育不良

一例Bainbridge-Ropers综合征患儿的基因变异分析

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中华医学遗传学杂志 2021年第3期38卷 275-277页

作者：段富华翟仪稳孔祥东郑州大学第一附属医院妇产科遗传与产前诊断中心450052

目的分析1例Bainbridge-Ropers综合征患儿及其父母ASXL3基因的变异类型,明确其可能的遗传学病因,为其临床诊断和遗传咨询提供依据。方法采集患儿和父母的外周血样,应用全外显子测序的方法对患儿基因进行检测,并采用Sanger测序的方法对... 详细信息

目的分析1例Bainbridge-Ropers综合征患儿及其父母ASXL3基因的变异类型,明确其可能的遗传学病因,为其临床诊断和遗传咨询提供依据。方法采集患儿和父母的外周血样,应用全外显子测序的方法对患儿基因进行检测,并采用Sanger测序的方法对变异位点进行验证。结果全外显子测序结果显示,患儿的ASXL3基因c.3106C>T杂合变异(***1036*),父母外周血ASXL3基因该位点未检测到c.3106C>T变异。该变异为无义变异,会产生截短蛋白。根据美国医学遗传学与基因组学学会变异分类标准与指南,c.3106C>T变异为致病性变异(PVS1+PS2+PP4)。结论ASXL3基因c.3106C>T杂合变异可能为患儿的致病原因,通过ASXL3基因变异分析,可以为其临床诊断和遗传咨询提供依据。

关键词： Bainbridge-Ropers综合征 ASXL3基因精神运动发育落后

一例X连锁隐性遗传的无汗型外胚层发育不良胎儿的产前遗传学诊断

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中华医学遗传学杂志 2020年第11期37卷 1269-1271页

作者：段富华王聪慧任淑敏孔祥东郑州大学第一附属医院妇产医学部遗传与产前诊断中心 450052

目的对1例产前超声提示牙胚完全缺失疑为X-连锁无汗型外胚层发育不良胎儿及其母亲进行EDA基因变异分析,为产前诊断和遗传咨询提供依据。方法采集母亲的临床资料及血样,提取基因组DNA,扩增产物纯化后NGS测序,变异位点再进行Sanger测序验... 详细信息

目的对1例产前超声提示牙胚完全缺失疑为X-连锁无汗型外胚层发育不良胎儿及其母亲进行EDA基因变异分析,为产前诊断和遗传咨询提供依据。方法采集母亲的临床资料及血样,提取基因组DNA,扩增产物纯化后NGS测序,变异位点再进行Sanger测序验证,在胎儿的羊水细胞中采用Sanger测序验证同一位点。结果母亲的EDA基因第8外显子检测到c.574G>A杂合错义变异(***192Thr),胎儿为同一位点的半合子变异。根据变异类型及生物信息学软件预测可能均为致病性变异。结论EDA基因第8外显子的c.574G>A错义变异可能为该家系的致病性变异,结合临床资料符合X连锁隐性遗传规律,为产前诊断和遗传咨询提供依据。

关键词：无汗型外胚层发育不良 EDA基因牙胚缺失