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建立TetO诱导重编程的猪体细胞系

建立TetO诱导重编程的猪体细胞系

作者：段安琴西北农林科技大学

学位级别：硕士

将外源多能转录因子(Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc)介导成体干细胞，诱导得到多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)，其具有与ES (embryonic stem)细胞相同的特性，不涉及胚胎伦理问题。近年，iPSCs技术发展迅猛，成为生命科... 详细信息

将外源多能转录因子(Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc)介导成体干细胞，诱导得到多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)，其具有与ES (embryonic stem)细胞相同的特性，不涉及胚胎伦理问题。近年，iPSCs技术发展迅猛，成为生命科学研究及临床应用的热点研究领域。国内外多家实验室成功地将猪体细胞诱导为iPSCs。但不同实验室得到的猪iPSCs，由于采用的方法和培养条件不同，使其表观遗传特性存在差异。重编程过程需要高滴度的和一定化学剂量的转录因子表达，诱导时4个转录因子随机整合，形成的iPSCs通常拥有不同的拷贝数。这种病毒载体随机拷贝插入和重编程的随机性，给研究细胞重编程机制和利用小分子替代转录因子的研究带来了困难。本实验将携带4个鼠源多能转录因子的慢病毒载体TetO-FUW-OSKM和辅助载体FUW-M2rtTA同时感染猪胎儿成纤维细胞(Porcine Embryonic Fibroblasts，PEF)，将串联的四因子整合到体细胞基因组中，在添加Dox (deoxycycline)的多能细胞培养条件下形成iPSCs，称其为一代iPSCs。随后，将第一代iPSCs再分化为成纤维样细胞，称其为TetO-PEF。 TetO-PEF含有TetO-FUW-OSKM和FUW-M2rtTA，无需再导入质粒，可在添加Dox的条件下外源整合的四因子被激活，启动细胞重编程，高效率的获得iPSCs。本研究建立的TetO-PEF细胞系，解决了四因子拷贝数不均一的问题，为研究猪重编程机制、猪iPSCs培养条件优化、小分子化合物诱导重编程等研究提供了新的实验平台。主要获得了以下结果： 1.建立TetO诱导重编程一代细胞系本实验成功分离了猪胎儿成纤维细胞。并将TetO诱导表达系统质粒TetO-FUW-OSKM和FUW-M2rtTA包装成病毒，感染PEF细胞，在添加Dox的iPSCs条件培养条件下重编程为一代iPSCs。第一代iPSCs，AP染色呈阳性，且能在无血清培养条件下正常传代。经PCR、RT-PCR检测，证实外源基因成功整合基因组且外源四因子正常表达。 2.建立直接诱导TetO第二代成纤维细胞重编程为二代iPSCs的体系本研究通过将第一代iPSCs形成EB (Embryoid Body, EB)并将其定向分化为成纤维细胞，获得了含有TetO-FUW-OSKM和FUW-M2rtTA质粒的TetO-PEF。由于一代iPSCs基因型一致，由此分化得到的TetO-PEF具有一致的基因型。TetO-PEF在Dox培养条件下可以快速形成二代iPSCs。经免疫荧光染色检测，二代iPSCs高表达OCT4、SOX2、SSEA-1、TRA-1-60，弱表达SSEA-4，而不表达TRA-1-81。

关键词：猪胎儿成纤维 Dox诱导慢病毒载体体细胞重编程

水牛DDR1基因生物信息学及细胞学功能分析

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黑龙江畜牧兽医 2023年第9期 48-53,130,131页

作者：陆杏蓉段安琴邓廷贤马小娅杨春艳郑海英冯超黄晨茜尚江华中国农业科学院广西水牛研究所农业农村部水牛遗传繁育技术重点实验室/广西水牛遗传繁育重点实验室南宁530001

为了了解水牛DDR1蛋白的生物信息学和细胞学功能,试验采用ProtParam、ProtScale、SOPMA、SWISS-MODEL、PSORTⅡPredictio、NetPhos 3.1在线软件对水牛DDR1蛋白进行生物信息学分析,采用基因干扰的方法研究水牛DDR1基因对水牛乳腺上皮细... 详细信息

为了了解水牛DDR1蛋白的生物信息学和细胞学功能,试验采用ProtParam、ProtScale、SOPMA、SWISS-MODEL、PSORTⅡPredictio、NetPhos 3.1在线软件对水牛DDR1蛋白进行生物信息学分析,采用基因干扰的方法研究水牛DDR1基因对水牛乳腺上皮细胞增殖、凋亡、基因表达和迁移的影响。结果表明:水牛DDR1蛋白由915个氨基酸组成,分子式为C_(4538)H_(7029)N_(1261)O_(1287)S_(43),分子量为101222.99 u,半衰期为30 h,理论等电点为6.22,属于酸性、不稳定、可溶性蛋白质。DDR1蛋白的二级结构由256个α-螺旋(27.98%)、175个延伸链(19.13%)、55个β-折叠(6.01%)、429个无规则卷曲(46.89%)构成。亚细胞定位于内质网(44.4%)、高尔基体(33.3%)和质膜中(22.2%)中。DDR1蛋白共含有65个磷酸化位点,其中丝氨酸磷酸化位点35个,苏氨酸磷酸化位点18个,酪氨酸磷酸化位点12个。DDR1基因的最佳干扰片段为siDDR1-1,最佳干扰时间为48 h。DDR1基因干扰72小时时可极显著抑制水牛乳腺上皮细胞的增殖(P0.05)的表达,但对细胞凋亡率的影响不显著(P>0.05)。此外,DDR1基因干扰可极显著降低水牛乳腺上皮细胞的迁移率(P<0.01)。说明DDR1基因干扰可极显著影响水牛乳腺上皮细胞的增殖和迁移。

关键词： DDR1基因生物信息学分析乳腺上皮细胞增殖凋亡迁移

水牛MFSD2A基因多态性及其与产奶性状的关联分析

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中国畜牧兽医 2022年第10期49卷 3856-3865页

作者：梁莎莎庞春英邓廷贤陆杏蓉段安琴马小娅方艳艳梁贤威中国农业科学院广西水牛研究所广西水牛遗传繁育重点实验室南宁530001

【目的】研究水牛主要促进因子超家族成员2a(major facilitator superfamily domain containing 2a,MFSD2A)基因多态性,并筛选与水牛产奶性状相关联的SNP。【方法】采集383头健康水牛血液DNA,利用PCR扩增和Sequenom MassARRAY飞行时间... 详细信息

【目的】研究水牛主要促进因子超家族成员2a(major facilitator superfamily domain containing 2a,MFSD2A)基因多态性,并筛选与水牛产奶性状相关联的SNP。【方法】采集383头健康水牛血液DNA,利用PCR扩增和Sequenom MassARRAY飞行时间质谱技术对SNP位点进行筛选及基因型检测,并进行遗传多样性、连锁不平衡(LD)和单倍型分析,以及对不同基因型和单倍型与水牛产奶性状进行关联分析。【结果】在水牛MFSD2A基因中检出7个SNPs位点,多态信息含量(PIC)均在0.25~0.40之间,属于中度多态,除g.8290 T>C位点外,其余位点均处于Hardy-Weinberg平衡状态(P>0.05);关联分析结果表明,这7个SNPs位点与305 d产奶量均显著关联(PG和g.701 A>G位点与乳脂率显著关联(P野生纯合子>突变杂合子,g.568 C>G、g.3326 G>A、g.8290 T>C和g.8523 C>G位点与乳蛋白率显著关联(P0.05);连锁不平衡和单倍型分析结果明,g.568 C>G、g.701 A>G和g.3203 T>G位点可组成一个单倍型模块(Block 1),g.8523 C>G和g.9138 G>T位点可组成另一个单倍型模块(Block 2)。其中g.568 C>G和g.701 A>G、g.568 C>G和g.3326 G>A、g.8523 C>G和g.9138 G>T位点的r~2分别为0.87、0.37和0.48,处于强连锁不平衡状态。Block 1中的H1(CAG)单倍型乳蛋白率显著高于H2(CAT)和H3(GCT)(PG和g.701 A>G位点与乳脂率显著关联,g.568 C>G、g.701 A>G、g.3326 G>A、g.8290 T>C和g.8523 C>G位点与乳蛋白率显著关联,这7个SNPs位点与乳尿素氮均无显著关联。纯合子的基因型在高305 d产奶量和乳脂率的选择上更有优势,H1(CAG)和D3(GG)单倍型是提高水牛305 d产奶量和乳蛋白率的有利单倍型。

关键词：水牛 MFSD2A基因连锁不平衡产奶性状关联分析

四环素调控基因(TetO)诱导重编程的猪体细胞系建立

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农业生物技术学报 2014年第9期22卷 1065-1073页

作者：段安琴王宁于童王华岩西北农林科技大学动物医学院

建立含有TetO-FUW-OSKM和FUW-M2rtTA的第二代猪(Sus scrofa domesticus)成纤维细胞,使其在添加强力霉素(doxycycline,DOX)而无需再次感染病毒的条件下可以重编程。将慢病毒(Lentiviral)质粒四环素调控基因(TetO)-FUW-OSKM和FUW-M2rtTA同时感染猪胎儿成纤维细胞(porcine embryonic fibroblasts,PEF),在添加DOX的培养条件下,形成诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)。随后,将iPSCs通过形成拟胚体(embryoid body,EB)再分化为成纤维样细胞,即TetO-PEF细胞。TetO-PEF携带TetO-FUW-OSKM和FUW-M2rtTA两个载体,且外源四因子拷贝数一致,在+DOX条件下调控四因子表达,直接驱动细胞重编程。本研究建立了TetO-PEF细胞系,为优化猪iPSCs培养条件提供了新的细胞资源。

关键词：猪成纤维细胞四环素调控基因(TetO)诱导系统慢病毒重编程

抑制BMP/Smad信号通路对水牛卵巢颗粒细胞生长和类固醇激素合成的影响

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中国畜牧兽医 2023年第6期50卷 2354-2362页

作者：徐媛媛郑海英杨春艳邓廷贤黄晨茜冯超陆杏蓉段安琴莫霞马小娅尚江华中国农业科学院广西水牛研究所广西水牛遗传繁育重点实验室南宁530001 农业农村部水牛遗传繁育技术重点实验室南宁530001

【目的】探究BMP/Smad信号通路对水牛卵巢颗粒细胞生长和类固醇激素合成的影响。【方法】利用脂质体转染的方法将合成的Smad 4基因的3对siRNAs(Smad4-siRNA1、Smad4-siRNA2和Smad4-siRNA3)和NC-siRNA(对照组)分别转染水牛颗粒细胞,通过... 详细信息

【目的】探究BMP/Smad信号通路对水牛卵巢颗粒细胞生长和类固醇激素合成的影响。【方法】利用脂质体转染的方法将合成的Smad 4基因的3对siRNAs(Smad4-siRNA1、Smad4-siRNA2和Smad4-siRNA3)和NC-siRNA(对照组)分别转染水牛颗粒细胞,通过实时荧光定量PCR检测Smad 4基因的表达水平,比较不同siRNA的干扰效率。然后利用筛选的干扰效率最高的siRNA,转染水牛卵巢颗粒细胞,通过CCK-8法检测对照组和干扰组细胞的增殖情况,实时荧光定量PCR检测上述两组细胞凋亡相关基因Bax和Bcl2,细胞周期相关调控基因CyclinD2和CDK4,以及类固醇激素合成相关基因Cyp19A1和Cyp11A1的表达水平,并通过ELISA检测雌二醇(E 2)和孕酮(P 4)的含量。【结果】基因干扰试验结果表明,3对siRNAs对Smad4基因的表达均具有极显著的干扰作用(P<0.01),其中Smad4-siRNA1的干扰效率最高,达到了64%。CCK-8检测结果显示,与对照组相比,干扰组细胞的增殖效率显著降低(P<0.05)。实时荧光定量PCR结果显示,与对照组相比,干扰组Bcl2、CyclinD2、CDK4和Cyp19A1基因的表达量均显著或极显著下调(P<0.05;P<0.01),而Cyp11A1基因的表达极显著上调(P<0.01),Bax基因的表达未受影响。ELISA检测结果表明,与对照组相比,干扰组雌二醇分泌量减少10.2%,孕酮的分泌量增加24.7%,差异均显著(P<0.05)。【结论】通过RNAi介导的Smad 4基因沉默对内源性BMP/Smad信号通路的中断不仅能够显著抑制水牛颗粒细胞的生长,而且能够诱导水牛颗粒细胞的凋亡,还会改变类固醇激素生成。BMP/Smad信号通路在调控水牛颗粒细胞生长和类固醇生成过程中具有重要的作用。

关键词：水牛 BMP/Smad信号通路 Smad 4基因颗粒细胞 RNA干扰类固醇生成

α-亚麻酸对水牛卵巢颗粒细胞体外培养的影响

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中国畜牧兽医 2023年第6期50卷 2380-2387页

作者：肖鹏尚江华杨春艳李孟琪段安琴马小娅冯超黄晨茜张博周金陈韦科龙郑威郑海英中国农业科学院广西水牛研究所广西水牛遗传繁育重点实验室南宁530001 农业农村部水牛遗传繁育技术重点实验室南宁530001 广西农业职业技术大学动物科技学院南宁530004

【目的】研究α-亚麻酸(ALA)对水牛卵巢颗粒细胞体外培养过程中细胞活力、细胞凋亡、细胞周期相关基因表达及激素分泌功能的影响。【方法】为了筛选体外培养水牛卵巢颗粒细胞ALA最适浓度,在96孔板中加入起始细胞数量为1×104/mL的水牛... 详细信息

【目的】研究α-亚麻酸(ALA)对水牛卵巢颗粒细胞体外培养过程中细胞活力、细胞凋亡、细胞周期相关基因表达及激素分泌功能的影响。【方法】为了筛选体外培养水牛卵巢颗粒细胞ALA最适浓度,在96孔板中加入起始细胞数量为1×104/mL的水牛卵巢颗粒细胞,细胞贴壁12 h后更换含0(对照组)、10、50、100、200μmol/L ALA的培养液,在相同条件下处理24 h,用CCK-8进行细胞活力检测,筛选出最适处理浓度,并用于后续试验。后续试验分为对照组(0μmol/L)和处理组(50μmol/L)两组,用实时荧光定量PCR检测颗粒细胞中B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制蛋白1(p21)和增殖细胞核抗原(PCNA)基因的相对表达量,用免疫荧光对颗粒细胞中细胞凋亡相关蛋白Caspase-3和细胞周期相关蛋白p21进行荧光检测和定量分析,用ELISA法检测培养液中水牛颗粒细胞分泌的雌二醇(E 2)和孕酮(P 4)含量。【结果】与对照组相比,水牛卵巢颗粒细胞经ALA处理24 h后,在10~50μmol/L范围内随着ALA浓度升高水牛卵巢颗粒细胞的细胞活力随之升高,处理浓度为50μmol/L时细胞活力相比对照组极显著提高(P0.05),但促凋亡基因Caspase-3和细胞周期基因p 21在mRNA和蛋白水平上的表达量均极显著降低(P<0.01),E 2和P 4水平显著或极显著增高(P<0.05;P<0.01)。【结论】培养液中添加50μmol/L ALA能够提升水牛卵巢颗粒细胞增殖活力、抗凋亡能力及激素分泌能力,本研究为调控水牛卵泡发育提供理论参考。

关键词： α-亚麻酸(ALA) 水牛颗粒细胞增殖活力基因表达

干扰HSD17B4基因对水牛乳腺上皮细胞乳脂和酪蛋白的影响

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中国畜牧兽医 2021年第9期48卷 3128-3137页

作者：段安琴陆杏蓉马小娅梁莎莎邓廷贤中国农业科学院广西水牛研究所广西水牛遗传繁育重点实验室南宁530001

通过将小干扰-17β-羟基固醇脱氢酶Ⅳ(si-HSD17B4)基因转染水牛乳腺上皮细胞,检测酪蛋白、甘油三酯含量及脂肪酸相关基因的表达变化,从而揭示干扰HSD17B4基因对水牛乳腺上皮细胞中乳脂和酪蛋白的影响。采用实时荧光定量PCR检测HSD17B4 m... 详细信息

通过将小干扰-17β-羟基固醇脱氢酶Ⅳ(si-HSD17B4)基因转染水牛乳腺上皮细胞,检测酪蛋白、甘油三酯含量及脂肪酸相关基因的表达变化,从而揭示干扰HSD17B4基因对水牛乳腺上皮细胞中乳脂和酪蛋白的影响。采用实时荧光定量PCR检测HSD17B4 mRNA在水牛各个组织中的相对表达量。合成3条水牛HSD17B4小干扰RNA(siRNA)和1条对照si-HSD17B4-nc(si-nc),并筛选干扰效果最佳的片段和时间。si-HSD17B4转染水牛乳腺上皮细胞后,通过酪蛋白试剂盒检测酪蛋白的表达情况,通过甘油三酯测定和油红O染色检测甘油三酯含量,通过实时荧光定量PCR检测干扰HSD17B4基因对甘油三酯、脂肪酸合成以及氧化相关基因表达的影响。结果表明,HSD17B4基因在水牛心脏和卵巢中相对高表达,且显著高于其他组织(P0.05)、61.15%(P<0.01)、84.91%(P<0.01)、89.34%(P<0.01)、21.88%(P<0.01)、86.48%(P<0.01)、25.35%(P<0.01)、27.24%(P<0.01)、41.74%(P<0.01)、22.17%(P<0.01)、62.70%(P<0.01)和70.33%(P<0.01)。结果表明,HSD17B4基因在水牛组织中广泛表达;si-HSD17B4高效抑制HSD17B4基因在水牛乳腺上皮细胞中的表达,未检测到干扰HSD17B4基因对乳腺上皮细胞酪蛋白的影响,干扰HSD17B4基因上调了FABP3、ACSL1、DGAT1、DGAT2基因的表达,从而促进甘油三酯的合成,同时降低ABCD1、ACOX2、EHHADH、SCP2基因的表达,减少脂肪酸β-氧化。

关键词：水牛乳腺上皮细胞 HSD17B4 乳脂酪蛋白

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沼泽型水牛微卫星DNA的遗传多样性分析

中国畜牧兽医 2016年第11期43卷 2989-2996页

作者：邓廷贤庞春英朱鹏陆杏蓉段安琴梁贤威中国农业科学院广西水牛研究所广西水牛遗传繁育重点实验室南宁530001

为探究中国沼泽型水牛品种或类群的遗传多样性,本研究采用了沼泽型水牛30个微卫星标记结合LabChip芯片检测法对德昌水牛、德宏水牛、温州水牛、贵州水牛、西林水牛、富钟水牛及两个引进品种摩拉水牛、尼里-拉菲水牛等40个样本进行了检... 详细信息

为探究中国沼泽型水牛品种或类群的遗传多样性,本研究采用了沼泽型水牛30个微卫星标记结合LabChip芯片检测法对德昌水牛、德宏水牛、温州水牛、贵州水牛、西林水牛、富钟水牛及两个引进品种摩拉水牛、尼里-拉菲水牛等40个样本进行了检测和遗传多样性分析。结果表明,在30个微卫星DNA标记上共发现332个等位基因,平均基因多样性和PIC值分别为0.7808和0.7554。聚类分析结果显示,德宏水牛和德昌水牛先聚为一类,随后与富钟水牛、贵州水牛、温州水牛、西林水牛聚为一类;摩拉水牛与尼里-拉菲水牛聚为一类。本研究证实了所选的30个沼泽型水牛微卫星DNA标记可作为有效的遗传标记用于水牛品种间的遗传多样性分析,同时也丰富了当前的水牛微卫星标记资源。

关键词：水牛微卫星遗传多样性芯片检测

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水牛HSD17B1基因启动子荧光素酶报告基因载体构建与分析

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中国畜牧兽医 2021年第10期48卷 3512-3521页

作者：陆杏蓉段安琴马小娅梁莎莎邓廷贤中国农业科学院广西水牛研究所广西水牛遗传繁育重点实验室南宁530001

试验旨在筛选水牛HSD17B1基因启动子活性区域及影响因素,并预测其转录结合因子,为探究该基因在水牛繁殖性能中的调控机理提供理论依据。以水牛血液基因组DNA为模板,PCR扩增得到3个HSD17B1基因启动子活性区域序列,并定向克隆至pGL3-promo... 详细信息

试验旨在筛选水牛HSD17B1基因启动子活性区域及影响因素,并预测其转录结合因子,为探究该基因在水牛繁殖性能中的调控机理提供理论依据。以水牛血液基因组DNA为模板,PCR扩增得到3个HSD17B1基因启动子活性区域序列,并定向克隆至pGL3-promoter载体;将重组质粒转染到水牛卵泡颗粒细胞,通过双荧光素酶检测系统测定相对荧光素酶活性,并探究其与促黄体素(luteinizing hormone,LH)和促卵泡素(follicle stimulating hormone,FSH)的关系;利用生物信息学方法对HSD17B1基因启动子区进行转录结合因子预测。结果显示,本试验成功克隆了3个不同长度的HSD17B1基因启动子片段,并成功构建了双荧光素酶报告载体。经不同长度启动子片段的活性检测发现,pGL-pro-HSD17B1-1500活性最强,证实-866/-1500 bp为HSD17B1基因核心启动子区域,表明该区域对HSD17B1基因转录调控有重要作用。荧光素酶活性检测结果显示,添加LH可增强HSD17B1基因启动子活性。生物信息学分析发现,HSD17B1基因启动子区存在6个转录因子结合位点:Sp1(-2327/-2317 bp)、HOXA4(-2162/-2146 bp)、Sp1(-1409/-1395 bp)、Sp1(-1391/-1380 bp)、Sp1(-1345/-1319 bp)和GATA1(-812/-801 bp),但无CpG岛,有1个TATA-box和2个CAAT-box。本研究成功构建了HSD17B1基因启动子荧光素酶报告载体,确定了HSD17B1基因启动子核心区域,并证明LH可增强启动子活性。

关键词：水牛 HSD17B1基因启动子