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易错PCR技术改造β-环糊精葡萄糖基转移酶的催化特性

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现代食品科技 2023年第5期39卷 25-31页

作者：郑婉刘振杨郑金珠武国干吴华伟长江大学生命科学学院湖北荆州434025 上海市农业科学院上海200000

β-环糊精是一种环状多糖,可用于改变某些大分子化合物的理化性质,在食品、生物及医药等领域都具有很高的工业应用前景。通过利用β-环糊精葡萄糖基转移酶(β-CGTase),使其作用于淀粉等含有葡萄糖基的多糖化合物,可转化生成β-环糊精。... 详细信息

β-环糊精是一种环状多糖,可用于改变某些大分子化合物的理化性质,在食品、生物及医药等领域都具有很高的工业应用前景。通过利用β-环糊精葡萄糖基转移酶(β-CGTase),使其作用于淀粉等含有葡萄糖基的多糖化合物,可转化生成β-环糊精。该研究采用易错PCR技术对来源于Paenibacillus campinasensis的β-CGTase进行定向进化,得到酶活力高的突变体,并对突变体进行镍柱亲和纯化与酶学性质分析。实验最终获得了一株突变体Q280L,其酶活力与原始β-CGTase相比提高了42.10%,对β-环糊精的转化率提高了7.60%,最适反应pH值和稳定性均有所变化,底物亲和力提高46.13%。经序列比对及结构分析,发现突变体Q280L与野生β-CGTase相比,第280位氨基酸残基种类以及周围氢键发生变化。该试验结果表明,基于易错PCR技术对β-CGTase基因进行定向进化,可提高酶活力和改善酶学性质,为实现β-环糊精的工业生产提供参考意义。

关键词： Paenibacillus campinasensis β-CGTase 定向进化易错PCR 酶学性质

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嗜热乙醇杆菌中醛/醇脱氢酶的双启动子分析

微生物学通报 2007年第4期34卷 727-730页

作者：彭惠毛忠贵武国干邵蔚蓝江南大学工业生物技术教育部重点实验室南京师范大学微生物工程重点实验室南京师范大学微生物工程重点实验室南京210097

克隆了嗜热乙醇杆菌(Thermoanaerobacter ethanolicus)中乙醇代谢的关键酶之一醛/醇脱氢酶(alcohol/acetaldehydedehy drogenase,AdhE)基因的上游假定启动子序列,并进行了结构分析。结果表明,adhE的上游序列是启动子,能启动报告基因在... 详细信息

克隆了嗜热乙醇杆菌(Thermoanaerobacter ethanolicus)中乙醇代谢的关键酶之一醛/醇脱氢酶(alcohol/acetaldehydedehy drogenase,AdhE)基因的上游假定启动子序列,并进行了结构分析。结果表明,adhE的上游序列是启动子,能启动报告基因在大肠杆菌中持续表达。首次发现adhE的启动子序列中存在两个独立的启动子(P172和P37)和核糖体结合位点(SD172和SD37),分别都具有完整功能,但其活性均低于完整的启动子序列。由此推测嗜热乙醇杆菌中adhE的表达受这两个启动子协同调控。

关键词：启动子醛/醇脱氢酶报告基因系统嗜热乙醇杆菌

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嗜热乙醇杆菌中醇脱氢酶E的功能与调控

食品与生物技术学报 2008年第2期27卷 84-87页

作者：彭惠毛忠贵武国干邵蔚蓝食品科学与技术国家重点实验室江南大学江苏无锡214122 南京师范大学微生物工程重点实验室江苏南京210097

对嗜热乙醇杆菌中的醇脱氢酶E(alcohol dehydrogenase E,AdhE)进行了克隆、表达和鉴定,证明先前报道的醛脱氢酶其实是AdhE。对AdhE在乙醇代谢中的功能与调控进行了研究。通过分析测定AdhE的酶学性质、AdhE在嗜热乙醇杆菌的不同生长时期... 详细信息

对嗜热乙醇杆菌中的醇脱氢酶E(alcohol dehydrogenase E,AdhE)进行了克隆、表达和鉴定,证明先前报道的醛脱氢酶其实是AdhE。对AdhE在乙醇代谢中的功能与调控进行了研究。通过分析测定AdhE的酶学性质、AdhE在嗜热乙醇杆菌的不同生长时期的表达情况以及AdhE高表达时嗜热乙醇杆菌产乙醇/乙酸的比率变化,证明了AdhE的主要生理功能是促使乙醇产生。分析了嗜热乙醇杆菌在山梨糖(强还原性碳源)、葡萄糖(氧化还原性居中的碳源)和葡糖醛酸(强氧化性碳源)诱导培养下的AdhE表达量,证明氧化还原力是AdhE的表达调控信号之一。

关键词：嗜热乙醇杆菌醇脱氢酶E 功能调控

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SNP标记用于猪肉产品DNA溯源

食品科学 2017年第24期38卷 278-282页

作者：吴潇吕贝贝王金斌蒋玮李鹏武国干唐雪明上海市农业科学院生物技术研究所

采用基于个体基因组DNA序列的差异而进行个体识别的DNA溯源技术,建立DNA溯源系统对肉产品的质量安全进行控制。在实验群体中(10个品种,233个个体)检测了33个新单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)标记的遗传多样性,通... 详细信息

采用基于个体基因组DNA序列的差异而进行个体识别的DNA溯源技术,建立DNA溯源系统对肉产品的质量安全进行控制。在实验群体中(10个品种,233个个体)检测了33个新单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)标记的遗传多样性,通过杂合度计算筛选出6个SNP标记可用于猪肉产品DNA溯源。进一步在屠宰场采样进行溯源模拟实验,结果表明筛选的18个SNP标记(6个新SNP标记结合已有的12个SNP标记)能有效区分100头猪个体,随机抽取的10个个体的组织样品都能通过基因型比对找到对应的个体。本研究可为早日建立猪肉产品的DNA溯源系统提供一定的技术参考。

关键词：猪肉产品溯源 DNA溯源技术 SNP标记个体识别

嗜热厌氧乙醇菌JW200中乙醛脱氢酶的纯化

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南京师大学报（自然科学版） 2007年第1期30卷 78-81页

作者：彭惠毛忠贵武国干邵蔚蓝江南大学工业生物技术教育部重点实验室江苏无锡214036 南京师范大学微生物工程重点实验室江苏南京210097

研究了嗜热厌氧乙醇菌(Thermoanaerobacter ethanolicus)JW200中乙醇代谢途径的关键酶之一乙酰CoA依赖型的乙醛脱氢酶(acetaldehyde dehydrogenase,ALDH,EC 1.***.1.10)的纯化.结果表明,经DEAE Sepha-rose Fast Flow阴离子交换层析、两次为30%与80%硫酸铵盐析和相应盐浓度的Butyl-HIC疏水层析、TOYOPE-ARL HW-55F分子筛层析等提纯步骤,可得到电泳纯的ALDH,其提纯倍数为910倍,得率为7%.由SDS-PAGE和梯度PAGE测得全酶由4个亚基组成,全酶相对分子质量为360 000,亚基相对分子质量为100 000.

关键词：乙醛脱氢酶嗜热厌氧乙醇菌纯化

ARTP诱变筛选草菇优良菌株及RAPD分析

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核农学报 2014年第11期28卷 1950-1955页

作者：何建华蒋玮吕贝贝李鹏武国干王金斌祝子坪吴潇唐雪明上海市农业科学院生物技术研究所上海201106 上海市农业遗传育种重点实验室上海201106

为构建草菇优良菌株突变体库,首次利用常压室温等离子体技术诱变草菇原生质体,优化的诱变条件是输出功率125 W、处理时间20 s。筛选出3株抗冻能力明显提高的突变菌株,3株突变株在草菇生长的20℃低温环境与对照相比生长速度提高了17%~57%... 详细信息

为构建草菇优良菌株突变体库,首次利用常压室温等离子体技术诱变草菇原生质体,优化的诱变条件是输出功率125 W、处理时间20 s。筛选出3株抗冻能力明显提高的突变菌株,3株突变株在草菇生长的20℃低温环境与对照相比生长速度提高了17%~57%,出菇爬料速度提高了0.8~2.4倍,出菇时间提前了1~2d,抗低温胁迫能力提高了24h。研究运用RAPD技术进行分子鉴定,建立草菇ARTP诱变育种筛选与检测评价平台。

关键词：草菇常压室温等离子体 RAPD

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草菇密码子偏好性分析

生物工程学报 2014年第9期30卷 1424-1435页

作者：蒋玮吕贝贝何建华王金斌吴潇武国干鲍大鹏陈明杰张劲松谭琦唐雪明上海市农业科学院生物技术研究所上海市农业遗传育种重点实验室国家食用菌工程技术研究中心

以草菇全基因组编码序列为研究对象,利用软件CodonW1.4.2分析草菇基因组密码子使用模式,确定了草菇的24个最优密码子。利用Create a condon usage table(CUSP)程序分析计算草菇密码子使用频率,并将它与人、酵母、拟南芥、小鼠、斑马鱼... 详细信息

以草菇全基因组编码序列为研究对象,利用软件CodonW1.4.2分析草菇基因组密码子使用模式,确定了草菇的24个最优密码子。利用Create a condon usage table(CUSP)程序分析计算草菇密码子使用频率,并将它与人、酵母、拟南芥、小鼠、斑马鱼、果蝇6个代表性物种及灰盖鬼伞、双孢蘑菇、香菇、平菇4个食用菌进行比较。结果显示草菇密码子偏好性与人、酵母、拟南芥、小鼠、斑马鱼、果蝇和平菇都有较大的差异,与灰盖鬼伞、双孢蘑菇、香菇的密码子偏好性差异较小。利用软件SPSS16.0聚类分析表明密码子偏好性差异大小在一定程度上反映物种间的进化关系,可作为研究物种进化关系的参考。首次以食用菌全基因组为分析对象,解析草菇的密码子偏好性,并将其与其他生物进行比较,这些将为不同来源的外源基因在草菇中的异源表达提供重要参考。

关键词：草菇全基因组最优密码子密码子偏好性

草菇耐低温突变菌株Vtlt-1和原始菌株V23转录组差异的研究

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菌物学报 2015年第6期34卷 1143-1152页

作者：吕贝贝于海龙祝子坪蒋玮何建华吴潇李鹏王金斌武国干谭琦唐雪明上海市农业科学院生物技术研究所上海201106 上海市农业遗传育种重点实验室上海201106 上海市农业科学院食用菌研究所上海201106 台州学院生命科学学院浙江台州318000

为了培育草菇耐低温菌株与解析其耐低温的分子机制,采用紫外诱变的方法,选育出耐低温草菇菌株Vtlt-1,并利用表达谱芯片技术,比较突变菌株Vtlt-1与原始菌株V23的表达差异基因,筛选差异显著基因后利用GO(gene ontology)功能注释和KEGG(kyo... 详细信息

为了培育草菇耐低温菌株与解析其耐低温的分子机制,采用紫外诱变的方法,选育出耐低温草菇菌株Vtlt-1,并利用表达谱芯片技术,比较突变菌株Vtlt-1与原始菌株V23的表达差异基因,筛选差异显著基因后利用GO(gene ontology)功能注释和KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)通路富集等方法分析,结果发现与V23相比Vtlt-1表达显著差异基因共有1 600个,其中704个基因上调表达,896个基因下调表达。针对差异基因的GO功能分类结果发现:生物学过程方面,差异基因主要分布在金属离子结合、氧化还原过程、碳水化合物的代谢与核酸的结合。细胞组分方面主要与细胞核相关;分子功能中,氧化还原活性以及解旋酶活性,依赖于ATP的解旋酶活性、DNA指导的RNA聚合酶活性。KEGG注释结果发现差异表达基因主要富集在氨基酸与氮类物质的代谢、脂肪酸与生物碱的合成这两方面,此外还富集到核糖体的生物合成、细胞色素P450、RNA聚合酶、硫和氨基酸的代谢、核酸的修复等通路。这些结果为解析草菇耐低温机制提供分子依据和理论基础。

关键词：草菇表达谱芯片耐低温 KEGG代谢通路分析

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环介导等温扩增技术在鸭源成分检测中的研究

食品与生物技术学报 2019年第8期38卷 126-133页

作者：吴潇吕贝贝蒋玮白蓝武国干王金斌王荣谈潘爱虎唐雪明上海市农业科学院生物技术研究所上海201106 上海市农业遗传育种重点实验室上海201106 上海瑞丰农业科技有限公司上海201106

为了建立肉产品中鸭源成分的现场快速检测技术,根据动物种间特异性的原则,筛选出一对品种特异的PCR引物,在此引物扩增片段的基础上,设计了环介导等温扩增(LAMP)引物序列,能特异检测鸭源成分。通过条件优化实验,发现在25μL的扩增体系中... 详细信息

为了建立肉产品中鸭源成分的现场快速检测技术,根据动物种间特异性的原则,筛选出一对品种特异的PCR引物,在此引物扩增片段的基础上,设计了环介导等温扩增(LAMP)引物序列,能特异检测鸭源成分。通过条件优化实验,发现在25μL的扩增体系中,内外引物浓度比为1∶4,温度为63.5℃,MgSO4添加量为5mM/μL,dNTPs添加量为1.75mM/μL,BstDNA聚合酶添加量为0.4U/μL,甜菜碱添加量为0.25μmol/μL,LAMP反应时间为30min时,LAMP检测体系检测效果达到最优,鸭肉DNA的检测灵敏度可达到10pg/μL。对牛羊肉中鸭源成分比例的检测灵敏度为0.0001%。应用该方法对上海市闵行区市场中的牛羊肉产品进行抽样检测,结果从21份样品中成功检测出5份含鸭源成分的混合肉。本研究建立的LAMP检测方法灵敏、快捷,可以实现鸭源成分的现场速测,为肉制品市场的监管提供了一种新方法。

关键词：牛、羊肉制品等温扩增技术环介导等温扩增技术可视化检测