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重组人源抗狂犬病毒单克隆抗体鸡尾酒暴露后预防效果评价

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病毒学报 2016年第4期32卷 399-403页

作者：孙丽娜刘洋李川李德新梁米芳中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所卫生部医学病毒和病毒病重点实验室北京102206

本研究对重组人源抗狂犬病毒单克隆抗体鸡尾酒暴露后预防效果进行评价,选用狂犬病毒国内代表性疫苗株、实验室固定毒株及街毒株共11株病毒,通过荧光抗体病毒中和试验(FAVN)分析针对狂犬病毒糖蛋白Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ号表位的三株单抗CR57(I)、RV... 详细信息

本研究对重组人源抗狂犬病毒单克隆抗体鸡尾酒暴露后预防效果进行评价,选用狂犬病毒国内代表性疫苗株、实验室固定毒株及街毒株共11株病毒,通过荧光抗体病毒中和试验(FAVN)分析针对狂犬病毒糖蛋白Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ号表位的三株单抗CR57(I)、RV08(II)和RV3A5(Ⅲ)及其鸡尾酒配伍的中和谱,在此基础上选用狂犬病病毒标准攻击毒株CVS-11感染仓鼠腓肠肌,进一步研究重组人源抗狂犬病毒单抗及其鸡尾酒制剂暴露后保护效果,结果显示CR57、RV08、RV3A5及其三联配伍制剂对11株狂犬病毒均具有明确的中和作用,按中和效价1∶1∶1配伍组成的鸡尾酒组合制剂对这些毒株的中和能力没有减弱,表明三株抗体间无相互干扰,对个别毒株(JX08-45、Flury、SRV9)的中和活性表现出协同作用;三株单抗CR57、RV08和RV3A5单独应用或是三联配伍应用的暴露后保护率达100%,与HRIG单独免疫相比较具有更优秀的动物保护活性;在与疫苗联合应用方面重组人源单抗与HRIG在暴露后预防的效果相仿,均可达到100%的保护率,所以重组人源单抗具有替代HRIG应用于狂犬病暴露后预防与保护的潜力,为我国具有自主知识产权的狂犬单抗鸡尾酒制剂的研发打下基础。

关键词：狂犬病毒糖蛋白重组人源单抗

抗埃博拉病毒核蛋白NP人-鼠嵌合抗体的研究

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病毒学报 2016年第1期32卷 14-18页

作者：周荣苹孙丽娜刘洋芜为李川梁米芳仇佩虹温州医科大学温州325035 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所北京102206

埃博拉病毒感染致死率最高可达90%,属烈性传染病,检测诊断对于疫情控制就显得异常重要。目前我国实验室通过实时定量荧光PCR检测埃博拉病毒核酸进行确诊,但耗时相对较长,对检测的人员和仪器要求较高。ELISA法检测血清是病原学诊断的主... 详细信息

埃博拉病毒感染致死率最高可达90%,属烈性传染病,检测诊断对于疫情控制就显得异常重要。目前我国实验室通过实时定量荧光PCR检测埃博拉病毒核酸进行确诊,但耗时相对较长,对检测的人员和仪器要求较高。ELISA法检测血清是病原学诊断的主要指标,该种检测方法简单易操作,能够有效判断患者是否感染埃博拉以及感染程度,可用于流行病学调查,血清学指标的检测可以作为核酸检测的有力补充。由于埃博拉出血热在我国境内尚无病例出现,尤其需要储备血清学检测阳性质控物。通过基因工程抗体技术构建并表达抗埃博拉病毒核蛋白NP人-鼠嵌合抗体,为埃博拉出血热血清学检测做人源阳性对照储备。采用RT-PCR技术,从分泌抗埃博拉核蛋白单克隆抗体的鼠杂交瘤细胞株中分离克隆抗体轻重链可变区基因,对其进行序列分析。根据序列分析的结果,设计特异性引物将鼠源抗体可变区基因VH、VL分别克隆至携带有人抗体轻重链恒定区基因的真核表达载体HL51-14,瞬时转染293T细胞,表达并纯化获得人鼠嵌合IgG抗体,随后对其进行了免疫学检测和功能鉴定。结果表明正确构建抗埃博拉病毒核蛋白人鼠嵌合抗体真核表达载体,成功表达并纯化获得两株人鼠嵌合单抗。

关键词：埃博拉核蛋白杂交瘤细胞人鼠嵌合抗体

人类肠道病毒71型亚单位疫苗壳聚糖佐剂作用的研究

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病毒学报 2014年第3期30卷 221-225页

作者：张硕张福顺李阿茜刘林芜为李川张全福梁米芳李德新中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所卫生部医学病毒和病毒病重点实验室北京102206

为了解人类肠道病毒71型(EV71)重组保护性衣壳蛋白(rVP1)亚单位疫苗壳聚糖佐剂的作用,本研究利用rVP1蛋白与壳聚糖佐剂制备的疫苗口服免疫新西兰白兔,通过ELISA方法检测兔血清、粘膜洗液(小肠、鼻腔和肺)及粪便中特异性IgG、IgA抗体水平... 详细信息

为了解人类肠道病毒71型(EV71)重组保护性衣壳蛋白(rVP1)亚单位疫苗壳聚糖佐剂的作用,本研究利用rVP1蛋白与壳聚糖佐剂制备的疫苗口服免疫新西兰白兔,通过ELISA方法检测兔血清、粘膜洗液(小肠、鼻腔和肺)及粪便中特异性IgG、IgA抗体水平,中和试验检测血清中和抗体滴度,并通过抗原刺激体外培养的兔脾淋巴细胞分泌细胞因子(IFN-γ、IL-4)的水平评价rVP1口服免疫效果。结果显示,单纯口服rVP1蛋白仅可诱导产生较低水平的血清IgG和粘膜IgA抗体,而含佐剂疫苗组与单纯抗原免疫组差异显著,并可诱导产生中和抗体。细胞免疫检测结果显示rVP1含佐剂组兔脾淋巴细胞分泌IFN-γ和IL-4水平明显高于未加佐剂组。本研究为研制EV71VP1口服疫苗奠定了基础。

关键词：肠道病毒71型 VP1蛋白壳聚糖口服疫苗免疫原性

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基因工程抗体亲和力成熟研究进展

中国医药生物技术 2012年第4期7卷 286-289页

作者：于礼梁米芳中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所北京102206

自1975年，Kohler创建杂交瘤技术并成功制备单克隆抗体以来，人们己研制出数以千计的单克隆抗体。单克隆抗体因其高度的靶向特异性已经成为科学研究，疾病诊断，药物靶向治疗等不可或缺的工具。山于杂交瘤技术制备单克隆抗体为鼠源性，... 详细信息

自1975年，Kohler创建杂交瘤技术并成功制备单克隆抗体以来，人们己研制出数以千计的单克隆抗体。单克隆抗体因其高度的靶向特异性已经成为科学研究，疾病诊断，药物靶向治疗等不可或缺的工具。山于杂交瘤技术制备单克隆抗体为鼠源性，在人体应用时易发生免疫排斥反应，难以有效激发人体免疫效应，而人源的基因工程抗体很好地解决了这一问题。借助DNA重组和蛋白质工程技术，人们可以获得人源单克隆抗体，

关键词：基因工程抗体亲和力成熟人源单克隆抗体蛋白质工程技术杂交瘤技术药物靶向治疗免疫排斥反应靶向特异性

抗发热伴血小板减少综合征病毒结构蛋白单克隆抗体的制备和功能分析

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病毒学报 2015年第1期31卷 18-23页

作者：李阿茜刘林张硕李川张全福梁米芳李德新中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所卫生部医学病毒和病毒病重点实验室北京102206

为制备抗发热伴血小板减少综合征病毒（Severe fever with thrombocytopenia syndrome bunyavirus,SFTSV）结构蛋白的单克隆抗体,本研究用灭活纯化的SFTSV病毒颗粒免疫BALB/c小鼠,利用杂交瘤技术获得分别分泌抗糖蛋白单抗和核蛋白单抗... 详细信息

为制备抗发热伴血小板减少综合征病毒（Severe fever with thrombocytopenia syndrome bunyavirus,SFTSV）结构蛋白的单克隆抗体,本研究用灭活纯化的SFTSV病毒颗粒免疫BALB/c小鼠,利用杂交瘤技术获得分别分泌抗糖蛋白单抗和核蛋白单抗的杂交瘤细胞株。用免疫荧光法和免疫沉淀方法对制备的单克隆抗体的抗原特异性进行鉴定,并初步进行单抗效价、中和活性及亲和力等功能分析。结果显示,通过细胞融合和克隆化,共筛选出13株稳定分泌抗糖蛋白（Glycoprotein,GP）单抗和7株稳定分泌抗核蛋白（Nucleoprotein,NP）单抗的杂交瘤细胞株。免疫荧光和免疫沉淀鉴定显示获得的单抗有良好的抗原特异性。抗GP单抗中6株针对Gn,7株针对Gc,大部分的间接免疫荧光（Indirect immunofluorescence assay,IFA）滴度在1 280-20 480之间,其中4株抗Gn单抗具有中和活性。获得的7株抗NP单抗均与NP特异性结合,IFA滴度范围在5 120-20 480,均无中和活性。此外,经非竞争ELISA检测的两株抗GP单抗（1C8和1G8）均有较高亲和力。本研究为SFTS诊断方法的发展及SFTSV致病机制研究奠定了基础。

关键词：发热伴血小板减少综合征病毒(SFTSV) 核蛋白(NP) 糖蛋白(GP) 单克隆抗体

发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒结构和非结构蛋白表达研究

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病毒学报 2011年第6期27卷 515-520页

作者：卢静李川张福顺芜为张全福张黎王涛王芹仇佩虹梁米芳李德新中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所北京100052 温州医学院药学院温州325003

发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒(SFTSV)是我国2010年新发现的新布尼亚病毒,可导致人类严重发热伴血小板减少综合征。SFTS新布尼亚病毒全基因组已解析,但病毒分子生物学结构蛋白特征及功能尚需更多研究。本文通过蔗糖密度梯度离心确... 详细信息

发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒(SFTSV)是我国2010年新发现的新布尼亚病毒,可导致人类严重发热伴血小板减少综合征。SFTS新布尼亚病毒全基因组已解析,但病毒分子生物学结构蛋白特征及功能尚需更多研究。本文通过蔗糖密度梯度离心确定发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒(HB29株)病毒颗粒的沉降密度及超离纯化条件,得出该病毒颗粒在蔗糖中的沉降密度为1.135g/mL。利用PCR方法扩增SFTSV病毒株HB29株病毒RNA聚合酶(RdRp)、糖蛋白前体蛋白(M)、包膜糖蛋白(Gn)、包膜糖蛋白(Gc)、核蛋白(NP)及非结构蛋白(NSs)的编码区基因片段,分别克隆入真核表达载体pcDNA5/FRT或VR1012,在293T细胞上获得上述基因表达。通过SDS-PAGE分析纯化病毒颗粒和重组蛋白,并通过免疫印迹(Western blotting)和间接免疫荧光(IFA)确定蛋白活性和分子量。本研究结果将有利于对新布尼亚病毒分子生物学特征的认识,为后期研究提供基础。

关键词：发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒病毒颗粒沉降密度蛋白表达

基于量子点免疫层析技术的新型冠状病毒中和抗体检测方法建立

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中华实验和临床病毒学杂志 2022年第2期36卷 205-213页

作者：殷强玲王恒强陈廷友曲园园孙丽娜芜为黄涛徐骁田婷婷李川李德新梁米芳王世文中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所北京102206 英诺特生物技术股份有限公司北京100070 传染病研究所深圳湾实验室深圳518107

目的建立简便、快速、低成本的2019新型冠状病毒(2019 novel coronavirus,2019-nCoV)中和抗体检测方法。方法基于量子点荧光免疫层析原理,建立新冠RBD IgG检测方法,并用新型冠状病毒肺炎(coronavirus disease 2019,COVID-19)患者恢复期... 详细信息

目的建立简便、快速、低成本的2019新型冠状病毒(2019 novel coronavirus,2019-nCoV)中和抗体检测方法。方法基于量子点荧光免疫层析原理,建立新冠RBD IgG检测方法,并用新型冠状病毒肺炎(coronavirus disease 2019,COVID-19)患者恢复期血清(N=97)、疫苗免疫后血清(N=82)及健康人血清(N=299)对检测方法性能进行评价。同时用指尖血和外周血配对血样(N=54)对指尖血的适用性进行了评价。结果本研究成功建立了基于量子点荧光免疫层析法2019-nCoV RBD IgG检测方法,该方法检测结果与微量中和试验结果具有较强的相关性(Spearman r>0.73,P<0.0001)和较好的一致性(Kappa=0.93,P<0.01);敏感性和特异性较高,分别为92%和99%。指尖血和外周血检测结果差异无统计学意义(P=0.1026),二者具有较强的相关性(Spearman r=0.9326,P<0.0001);指尖血可用于检测。结论本研究建立的2019-nCoV中和抗体检测方法可为群体免疫状态评估提供的即时、高效,低成本的方法选择,为疫苗群体免疫监测和疫情防控提供技术支撑。

关键词：新型冠状病毒量子点免疫层析中和抗体

六种致病性白蛉病毒原核表达核蛋白抗原性初步研究

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病毒学报 2014年第4期30卷 387-390页

作者：芜为张全福李川张硕梁米芳李德新中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所卫生部医学病毒和病毒病重点实验室北京102206

初步研究六种致病性白蛉病毒原核表达核蛋白(Nucleocapsid protein,NP)抗原的抗原性,为开发相应的血清学诊断试剂提供理论依据。利用原核表达系统表达纯化六种致病性白蛉病毒核蛋白,并分别免疫新西兰白兔。通过间接ELISA方法及Western-b... 详细信息

初步研究六种致病性白蛉病毒原核表达核蛋白(Nucleocapsid protein,NP)抗原的抗原性,为开发相应的血清学诊断试剂提供理论依据。利用原核表达系统表达纯化六种致病性白蛉病毒核蛋白,并分别免疫新西兰白兔。通过间接ELISA方法及Western-blotting方法对所获得的兔免疫血清进行交叉反应检测,确定其抗体ELISA滴度。此外,分别用上述六种致病性白蛉病毒NP抗原包被ELISA反应板并对发热伴血小板减少综合征病毒(Severe fever with thrombocytopenia syndrome virus,SFTSV)病人血清进行间接ELISA检测,确定其血清学交叉反应及IgG抗体滴度。通过原核表达系统表达并纯化的六种白蛉病毒NP抗原浓度及纯度均达到免疫和检测要求。ELISA及Western-blotting检测结果显示六种病毒NP抗原兔免疫血清中的每种血清与其余五种病毒NP抗原可能存在血清学交叉反应。SFTSV病人血清与除SFTSV-NP以外的五种NP抗原亦可能存在部分交叉反应。本研究初步评价了原核表达的六种致病性白蛉病毒核蛋白的抗原性和免疫反应性,为相应诊断试剂的研制奠定了基础。

关键词：白蛉病毒核蛋白间接ELISA 免疫印迹杂交血清学诊断

人源抗乙型肝炎病毒表面抗原基因工程IgG全抗体的表达、纯化及初步鉴定

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中国生物制品学杂志 2007年第12期20卷 873-876页

作者：黄仕和周志军彭祥兵詹骞张爱华闭兰余模松梁米芳武汉生物制品研究所武汉430060 中国疾病预防控制中心病毒病控制所北京100052

目的对人源抗乙型肝炎病毒表面抗原的基因工程IgG全抗体进行表达、纯化及初步鉴定。方法用含Fc片段抗-HBsAg Fab抗体基因的载体pAC-HBs-Fc,与杆状病毒线性DNA共转染昆虫细胞sf9,产生重组抗-HBsAg的全抗体。以不同浓度的HBsAg包被酶标板... 详细信息

目的对人源抗乙型肝炎病毒表面抗原的基因工程IgG全抗体进行表达、纯化及初步鉴定。方法用含Fc片段抗-HBsAg Fab抗体基因的载体pAC-HBs-Fc,与杆状病毒线性DNA共转染昆虫细胞sf9,产生重组抗-HBsAg的全抗体。以不同浓度的HBsAg包被酶标板孔,用间接ELISA法检测培养上清中抗体的表达及特异性;用蛋白G亲和层析柱进行抗体的纯化,并对纯化的抗体进行SDS-PAGE、Western blot和竞争性ELISA分析。结果上清中表达的重组IgG抗体仅与HBsAg呈阳性反应,特异性良好,纯化后其纯度达97.1%。经SDS-PAGE和Western blot分析可见,IgG抗体轻链和重链的相对分子质量分别约为27000和55000,为人源IgG抗体。CHO表达的HBsAg和血源性HBsAg能竞争性抑制该重组IgG抗体与***表达的HBsAg反应,其抑制率分别为55.9%和81.9%。结论人源抗乙型肝炎病毒表面抗原的基因工程IgG全抗体可在杆状病毒载体表达系统中成功表达。

关键词：乙型肝炎病毒表面抗原 IgG 基因工程抗体杆状病毒表达纯化