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SFTSV感染周期和抗病毒药物的研究进展

中华实验和临床病毒学杂志 2022年第4期36卷 475-480页

作者：刘铁柱梁米芳王世文中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所国家卫生健康委员会医学病毒和病毒病重点实验室北京102206

发热伴血小板减少综合征病毒(severe fever with thrombocytopenia syndrome virus,SFTSV)是一种蜱传的新型布尼亚病毒,在中国大别山地区被首次发现,临床上可以引起严重发热、血小板减少等症状,致死率可达10%~30%。目前,SFTSV的致病机... 详细信息

发热伴血小板减少综合征病毒(severe fever with thrombocytopenia syndrome virus,SFTSV)是一种蜱传的新型布尼亚病毒,在中国大别山地区被首次发现,临床上可以引起严重发热、血小板减少等症状,致死率可达10%~30%。目前,SFTSV的致病机理和感染机制尚不清楚,还没有针对该病毒的特效药物和疫苗。本文对SFTSV的入胞机制、膜融合、复制、装配和出芽过程进行了综述,总结了目前SFTSV相关的治疗性抗体和抗病毒药物的研究进展,以期为我国SFTSV的疫苗和抗病毒药物的研发提供参考。

关键词：发热伴血小板减少综合征病毒感染周期抗病毒药物

基于CRISPR/Cas9系统建立SNX11基因敲除A549细胞系

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病毒学报 2022年第3期38卷 652-657页

作者：刘铁柱李阿茜李川梁米芳王世文中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所医学病毒和病毒病重点实验室北京102206

为了建立SNX11基因稳定敲除A549细胞系,本研究通过构建针对人SNX11基因的特异性打靶慢病毒载体,将该慢病毒感染A549细胞系,使用嘌呤霉素对慢病毒感染阳性的A549细胞进行筛选,利用梯度稀释法获得单细胞并扩增培养,提取细胞基因组DNA,PCR... 详细信息

为了建立SNX11基因稳定敲除A549细胞系,本研究通过构建针对人SNX11基因的特异性打靶慢病毒载体,将该慢病毒感染A549细胞系,使用嘌呤霉素对慢病毒感染阳性的A549细胞进行筛选,利用梯度稀释法获得单细胞并扩增培养,提取细胞基因组DNA,PCR扩增后进行测序验证,同时提取细胞蛋白后利用Western Blot方法进行蛋白敲除验证,最后进行细胞活性检测和脱靶效应评估。最后,本研究获得了一株SNX11基因敲除A549细胞系;通过脱靶效应评估,结果显示最可能的20个脱靶位点均不存在脱靶现象;该基因敲除对细胞增殖活性没有影响。本研究成功构建了一株SNX11基因敲除A549细胞系,为SNX11蛋白的功能研究建立了细胞模型。

关键词： CRISPR/Cas9 SNX11 基因敲除细胞系

基于慢病毒包装和CRISPR技术建立病毒感染关键基因CLTC敲除细胞系

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病毒学报 2023年第3期39卷 800-804页

作者：刘铁柱黄涛李阿茜李川梁米芳王世文中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所医学病毒和病毒病重点实验室北京102206

网格蛋白是病毒进入内体系统时的关键蛋白,同时还可能参与病毒的胞内转运,目前该蛋白的具体作用范围报道还不一致。为了构建网格蛋白重链基因敲除细胞系,以研究其在病毒感染过程中的功能,本研究基于CRISPR/Cas9系统,首先通过包装慢病毒... 详细信息

网格蛋白是病毒进入内体系统时的关键蛋白,同时还可能参与病毒的胞内转运,目前该蛋白的具体作用范围报道还不一致。为了构建网格蛋白重链基因敲除细胞系,以研究其在病毒感染过程中的功能,本研究基于CRISPR/Cas9系统,首先通过包装慢病毒建立网格蛋白重链基因特异性打靶载体,使用嘌呤霉素对慢病毒感染的Huh7细胞进行阳性筛选,利用96孔板梯度稀释法获得单克隆细胞,提取细胞基因组DNA,PCR扩增后进行测序验证,同时提取细胞蛋白,利用Western Blot实验进行蛋白敲除验证,最后进行细胞增殖活性检测和脱靶效应评估。最终本研究获得了一株网格蛋白重链基因敲除Huh7细胞系;通过脱靶效应评估,显示最可能的10个脱靶位点均不存在脱靶现象,且该基因敲除不影响细胞增殖活性。本研究成功构建了一株网格蛋白重链基因敲除Huh7细胞系,为研究网格蛋白在病毒进入宿主细胞时的功能建立了细胞模型。

关键词： CRISPR/Cas9 CLTC 基因敲除

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一种寨卡病毒富集检测方法的性能评价

协和医学杂志 2022年第3期13卷 455-460页

作者：李阿茜孔令君刘洋伊洁李川梁米芳窦亚玲中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所病毒性出血热室北京102206 中国医学科学院北京协和医院检验科北京100730

目的对一种无需核酸提取纯化的寨卡病毒实时荧光定量反转录PCR检测方法的性能进行评价。方法该检测方法基于实时荧光定量反转录PCR技术,样本处理采用病毒富集法:取100~200μL待测样本,加入112~224μL样本处理液Ⅰ,5~10μL样本处理液Ⅱ... 详细信息

目的对一种无需核酸提取纯化的寨卡病毒实时荧光定量反转录PCR检测方法的性能进行评价。方法该检测方法基于实时荧光定量反转录PCR技术,样本处理采用病毒富集法:取100~200μL待测样本,加入112~224μL样本处理液Ⅰ,5~10μL样本处理液Ⅱ,混匀后进行离心富集(12 000 r/min,离心半径8.6 cm,离心5 min)。离心后弃上清液,加入20μL复溶缓冲液重悬沉淀;取10μL重悬液,加入50μL PCR反应液上机检测。从定量检测下限、交叉反应、抗干扰性、精密度方面评价该检测方法的性能。收集北京协和医院检验科临床样本(血清、尿液、唾液样本),随机选取约1/5构建寨卡病毒感染模拟临床样本,进一步评定该检测方法的性能。结果该检测方法对MR766、ZKC2/2016毒株的检测下限均为10;半数组织培养感染剂量(50%tissue culture infective dose, TCID50)/mL;对17种常见虫媒病原体检测结果均为阴性,无交叉反应发生;潜在干扰物质胆红素(15 mg/L)、血红蛋白(100 mg/L)、甘油三酯(2000 mg/L)、IgG(37.5 g/L)和EDTA-Na;(2.5 g/L)对其检测结果无干扰;检测低、中、高浓度寨卡病毒的批次内和批次间Ct值变异系数均<10%,精密度良好。共收集344份北京协和医院检验科临床样本,其中构建寨卡病毒感染模拟临床样本73份。采用该检测方法对344份样本进行检测,结果均与实际相符,无假阳性和假阴性。结论寨卡病毒简单富集后再检测的方法特异性高、重复性好,检测结果不受干扰物质的影响,检测下限满足临床需求,且操作简便,但应用效果仍需在真实临床样本中进一步验证。

关键词：寨卡病毒快速检测病毒富集法性能评价

rViRAL:几种常见呼吸道病毒感染宿主应答的基因表达交互查询系统

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病毒学报 2023年第4期39卷 991-998页

作者：李洋尤翀梁米芳郭琪张益周晓华北京大学重庆大数据研究院北京大学重庆401333 北京大学北京国际数学研究中心北京大学北京100871 国家卫生健康委员会医学病毒和病毒病重点实验室中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所北京102206 首都儿科研究所病毒学研究室儿童病毒病病原学北京市重点实验室北京100020

建立操作便捷、用户友好的在线系统可以实现对海量病毒感染宿主应答数据的深度挖掘,促进对病毒与宿主相互作用的深入了解。通过收录整合1483份批量转录组和超30000个细胞的单细胞转录组数据,以R语言为核心,整合多种先进生物信息工具,设... 详细信息

建立操作便捷、用户友好的在线系统可以实现对海量病毒感染宿主应答数据的深度挖掘,促进对病毒与宿主相互作用的深入了解。通过收录整合1483份批量转录组和超30000个细胞的单细胞转录组数据,以R语言为核心,整合多种先进生物信息工具,设计开发用户友好的在线平台rViRAL(Respiratory Virus Response interActive anaLysis)。在rViRAL上,研究人员通过用户友好的交互界面即可实现对感染后宿主应答的系列分析,包括:差异表达分析、诊断性能评价以及单细胞层面上的分子变化等。此外,rViRAL还提供跨多种常见呼吸道病毒感染类型,对感兴趣的基因进行泛感染比较分析的功能。借助rViRAL,生物学家可以无需任何计算编程技能就可以对感兴趣的基因进行假设探索与验证,这将极大地促进呼吸道病毒感染免疫的数据挖掘、科学讨论和治疗及诊断靶点的发现。

关键词：病毒感染宿主应答转录组单细胞转录组在线平台

全人源抗人干扰素α1b基因工程抗体与抗原的结合表位鉴定

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免疫学杂志 2012年第2期28卷 157-160页

作者：龚斌梁米芳中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所北京100052 广西钦州学院海洋学院 535000

目的鉴定抗原人干扰素α1b(huIFN-α1b)与1株全人源抗体蛋白AIFNa1IgG1的结合表位。方法从正常人分离纯化淋巴细胞并抽提mRNA进行CDNA合成,以CDNA为模板通过PCR扩增得到huIFN-α1b基因,通过重叠延伸PCR法构建huIFN-α1b蛋白29-35位氨基... 详细信息

目的鉴定抗原人干扰素α1b(huIFN-α1b)与1株全人源抗体蛋白AIFNa1IgG1的结合表位。方法从正常人分离纯化淋巴细胞并抽提mRNA进行CDNA合成,以CDNA为模板通过PCR扩增得到huIFN-α1b基因,通过重叠延伸PCR法构建huIFN-α1b蛋白29-35位氨基酸残基缺失突变体及点突变体,野生型和突变基因与载体pET30a连接构建重组表达载体,将以上重组表达载体转化大肠杆菌表达宿主*** Rosseta(DE3),诱导表达后的huIFN-α1b蛋白及突变体通过Western blot分析其与全人源抗huIFN-α1b基因工程抗体蛋白的结合活性。结果 huIFN-α1b蛋白在*** Rosseta(DE3)细胞中成功表达,Western-blot分析表明野生型huIFN-α1b蛋白与抗体结合,29-35位氨基酸缺失与抗体失去结合活性,其中27位的Ser,33位的Asp,34位的Arg,35的His,36位的Asp突变为Gly后,抗体与huIFN-α1b的结合可减弱到不可检测的水平。结论 huIFN-α1b蛋白29-35位氨基酸形成的表位是与抗体AIFNa1IgG1结合的重要表位。

关键词：抗体全人源抗体人干扰素ctlb 表位重叠延伸PCR

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白蛉病毒属研究进展

病毒学报 2013年第3期29卷 337-341页

作者：牛国宇梁米芳中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所病毒性出血热室北京102206

白蛉病毒属病毒是单股负链RNA病毒,隶属布尼亚病毒科,基因组分为L、M和S三个片段,分别编码RNA依赖的RNA聚合酶、包膜糖蛋白和核蛋白。白蛉病毒是虫媒病毒,主要通过节肢动物传播,迄今为止,文献报道的白蛉病毒已有70多种,68个已知病毒种... 详细信息

白蛉病毒属病毒是单股负链RNA病毒,隶属布尼亚病毒科,基因组分为L、M和S三个片段,分别编码RNA依赖的RNA聚合酶、包膜糖蛋白和核蛋白。白蛉病毒是虫媒病毒,主要通过节肢动物传播,迄今为止,文献报道的白蛉病毒已有70多种,68个已知病毒种被分为白蛉热病毒组和乌库病毒组,其中某些白蛉热病毒组成员与人类疾病密切相关,而且最近又有新型白蛉病毒出现,本文就白蛉病毒属的分子特征、流行病学、诊断、治疗及新发现的白蛉病毒的概况展开综述。

关键词：白蛉病毒属流行病学诊断治疗

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人源抗乙型肝炎病毒基因工程全抗体的研制

中华实验和临床病毒学杂志 2004年第2期18卷 105-108,F002页

作者：郭瑜梁米芳毕胜利中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所肝炎室北京100052

目的　研制人源化抗乙型肝炎表面抗原 (HBsAg)的IgG全抗体。方法　采用噬菌体抗体库技术 ,从乙肝疫苗免疫后健康人外周血淋巴细胞中提取抗体基因建立抗体库 ,用纯化的HBsAg筛选Fab抗体 ;再将获得的抗体轻、重链构建到杆状病毒表达载体p... 详细信息

目的　研制人源化抗乙型肝炎表面抗原 (HBsAg)的IgG全抗体。方法　采用噬菌体抗体库技术 ,从乙肝疫苗免疫后健康人外周血淋巴细胞中提取抗体基因建立抗体库 ,用纯化的HBsAg筛选Fab抗体 ;再将获得的抗体轻、重链构建到杆状病毒表达载体pAc κ Fc中 ,转染SF9细胞表达IgG全抗体并进行纯化。免疫荧光检测抗体的表达 ,竞争抑制ELISA检测其与抗原的结合活性及特异性。结果　获得了一株抗乙肝表面抗原的Fab抗体 ;在转染后的SF9培养上清中收获到了IgG抗体 ,竞争ELISA证实该抗体针对HBV表面抗原的特异性抗体。结论　本实验得到了一株人源抗HBsAg的IgG抗体 ,并进行了纯化。

关键词：乙型肝炎病毒基因工程人源重组抗体 IgG全抗体检测

人源抗人干扰素α1b全抗体在昆虫细胞中的表达、纯化和鉴定

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免疫学杂志 2012年第4期28卷 312-316页

作者：龚斌李川梁米芳中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所北京100052 广西钦州学院海洋学院 535000

目的克隆、杆状病毒/昆虫表达系统表达人源抗人干扰素α1b（huIFN-α1b）全抗体基因,获得全抗体蛋白。方法利用PCR技术以gIII-scFv融合表达的噬菌粒质粒为模板,分别克隆了5株抗体基因的轻链和重链;经Nco I/Xho I和Sac I/Hind III分别酶... 详细信息

目的克隆、杆状病毒/昆虫表达系统表达人源抗人干扰素α1b（huIFN-α1b）全抗体基因,获得全抗体蛋白。方法利用PCR技术以gIII-scFv融合表达的噬菌粒质粒为模板,分别克隆了5株抗体基因的轻链和重链;经Nco I/Xho I和Sac I/Hind III分别酶切,与经过相同酶切的pAC-K-CH3载体连接构建了昆虫细胞sf9表达载体pAC-K-CH3-H-L;经测序鉴定正确后,转染进入昆虫细胞sf9进行异源表达。采用免疫荧光（IFA）和ELISA对全抗体的表达和结合情况进行初步鉴定。采用Protein-A亲和层析柱对收获的全抗体IgG蛋白进行纯化,将纯化后的抗体蛋白进行SDS-PAGE电泳和Western blotting鉴定。结果成功扩增了人源抗人干扰素α1b抗体轻链和重链基因;免疫荧光（IFA）鉴定表明5株重组质粒在昆虫细胞sf9表达出了全抗体蛋白,ELISA鉴定表明其中3株与huIFN-α1b特异性结合;经Protein-A亲和层析柱纯化后每升细胞培养上清收获了5~20 mg的蛋白,Western blotting鉴定表明3株纯化的全抗体蛋白和huIFN-α1b特异性结合。结论通过杆状病毒/昆虫表达系统获得了3株人源抗人干扰素α1b（huIFN-α1b）全抗体蛋白。

关键词：杆状病毒/昆虫表达系统人干扰素α1b IgG全抗体表达纯化