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慢病毒介导TLR2基因沉默抑制角膜移植术后排斥反应的实验研究

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慢病毒介导TLR2基因沉默抑制角膜移植术后排斥反应的实验研究

作者：梁伟怡南方医科大学

学位级别：硕士

研究背景角膜盲是严重影响患者的生存质量和身心健康的疾病。角膜移植手术是协助这些患者复明的重要手段。然而,尽管角膜移植手术目前是人体内成功率最高的移植手术之一,然而手术后的排斥反应仍然是威胁到治疗效果的首要原因。角膜移植... 详细信息

研究背景角膜盲是严重影响患者的生存质量和身心健康的疾病。角膜移植手术是协助这些患者复明的重要手段。然而,尽管角膜移植手术目前是人体内成功率最高的移植手术之一,然而手术后的排斥反应仍然是威胁到治疗效果的首要原因。角膜移植排斥反应是一个复杂的免疫反应过程,免疫系统中多种成分参与到排斥反应。尽管目前针对角膜移植排斥反应机制的研究已日趋成熟,临床上也有诸多预防移植排斥反应的药物干预手段,但是角膜移植排斥反应依然未能完全避免。因此,进一步探索和明确角膜移植排斥反应的发生机制,寻找抑制排斥反应的发生、发展的有效途径,仍需进一步研究。迄今为止,角膜移植排斥反应的免疫机制已有较为广泛的研究。角膜移植已经发展为较成熟的移植手术,已在临床上成功实施约100年。因为角膜局部免疫赦免的存在,角膜移植成功率高居首位。免疫赦免的定义是：角膜植片发生排斥反应的机会较少、发生排斥反应的速度和进展较为缓慢。研究发现的排斥反应发生机制主要有以下两个方面：(1)角膜缘局部含有大量携带HLA-DR (Human leucocyte antigen)抗原的朗格汉斯细胞,这可以诱发早期角膜移植排斥反应的发生,促进移植排斥反应的进展。(2)角膜局部的主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex, MHC)和次要抗原分子都参与到角膜移植排斥反应的过程当中,APCs吞噬和摄取外来入侵抗原并行处理之后,由MHC-II类分子表达于细胞的表面,和T细胞表面的TCR形成共刺激分子诱导T细胞识别、区分“异已”成分。急性角膜移植排斥反应是由CD4+T细胞为主导的Ⅳ型超敏反应。反应发生后,即可启动一系列免疫炎症细胞的释放,对角膜植片造成无可挽回的损伤和破坏,最终导致移植手术的失败。目前,临床上针对角膜移植排斥反应的预防和治疗,主要采用以下几种方法：1、对因治疗：抗排斥反应;2、预防和控制术后感染,减少术前高危因素;3、对症支持治疗,改善营养支持。而临床用药抗排斥反应又是所有治疗手段中最常采用和最有效的。目前最常用的药物主要是：糖皮质激素、免疫抑制药物例如环孢素A、白细胞介素-1受体拮抗剂、FK506、抗肿瘤药物等进行治疗。但是这些药物的应用仍然具有一定的副作用。糖皮质激素在人体的长期应用可能会抑制机体免疫功能从而引起感染等症状;环孢素A的副作用较糖皮质激素要轻,但是可增加发生恶性肿瘤特别是皮肤癌的风险。白细胞介素-1受体抑制剂虽然可以通过抑制炎症因子的表达降低APCs的趋化作用,但是长期应用会引起剂量依赖性：FK506属于真菌的代谢产物,作用机制和CsA类似,但是因为成本太高,临床应用仍受到限制。因此,进一步明确角膜移植排斥反的免疫学机制,寻找新的阻断靶点,研制开发出新型的、副作用更小且更有效的药物,将是临床和科研工作者当下极其重要的任务。TLRs (Toll like receptors)是可识别侵入机体的病原体相关分子模式(PAMPs, Pathogen Associated Molecular Patterns)以及损伤相关分子模式(DAMPs, Damage Associated Molecular Patterns)的膜结合蛋白,在免疫系统中占据了重要的地位。截至目前为止,科学家已发现13种TLRS。其中,Toll样受体2(TLR2, Toll like receptor 2)作为所有TLRs中表达范围最广、识别病原微生物和其产物种类最多的蛋白。在炎症发生以后,机体炎症灶和受损器官组织内的外源性配体(如脂蛋白、肽聚糖、脂磷壁酸等)、内源性配体(透明质酸、热休克蛋白70以及高迁移率族蛋白B1等)可以迅速增加,TLR2可以作为天然免疫系统中的重要分子,通过识别结合以上配体,开启机体免疫反应模式。这一作用也让TLR2成为联结天然免疫和固有免疫的重要纽带。科学家对TLRs家族多年的研究,已确认TLRs至少有MyD88依赖性和MyD88非依赖性两条信号途径启动下游通路。目前已经有大量研究发现,TLR2本身主要通过MyD88依赖性途径启动下游信号转导通路,参与移植相关的免疫排斥反应过程。研究显示在肝、肺、肾、胰等实质性器官移植排斥反应的标本中,TLR2和MyD88表达均较正常标本显著升高;有学者发现通过应用激素、环孢素-A、抗体和特异性阻滞剂可阻断TLR2-MyD88信号途径,有效延长移植物的存活时间;另外,TLR2基因敲除的小鼠模型的移植物组织中,炎症细胞浸润程度均较轻,生存时间和较野生型相比显著延长。我们的前期研究工作也显示TLR2和MyD88在大鼠的穿透性角膜移植(penetrating keratoplasty, PKP)排斥反应模型中表达显著增高,应用糖皮质激素和TLR2单克隆抗体(TLR2 monoclonal antibody, TLR

关键词：慢病毒载体基因转染角膜上皮细胞角膜基质细胞 TLR2 角膜移植 TLR2/MyD88信号系统排斥反应

TLR2单克隆抗体对大鼠角膜移植术后植片存活的保护作用

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中华实验眼科杂志 2015年第10期33卷 887-891页

作者：白浪郑艳华梁伟怡南方医科大学南方医院眼科广州510515

背景 Toll样受体2（TLR2）在移植免疫相关疾病中的作用越来越受到关注,阻断TLR2对心脏和肾脏移植物的保护作用已有研究报道,但TLR2是否具有抑制角膜移植排斥反应的作用尚未证实.目的观察TLR2单克隆抗体对同种异体大鼠角膜移植术后植片... 详细信息

背景 Toll样受体2（TLR2）在移植免疫相关疾病中的作用越来越受到关注,阻断TLR2对心脏和肾脏移植物的保护作用已有研究报道,但TLR2是否具有抑制角膜移植排斥反应的作用尚未证实.目的观察TLR2单克隆抗体对同种异体大鼠角膜移植术后植片存活情况的影响.方法取24只SPF级雌性Wistar大鼠作为受体,12只SPF级SD大鼠作为供体,体质量均为180～220 g.采用同种异体角膜移植的方法在Wistar大鼠右眼实施穿透角膜移植术,制备大鼠角膜移植模型.采用随机数字表法将模型眼分为单纯模型组和TLR2单克隆抗体组,TLR2单克隆抗体组分别于术后0、2、4、6、8d球结膜下注射TLR2单克隆抗体15 μg/30μl,单纯模型组大鼠同法注射等容量生理盐水.术后每日于裂隙灯显微镜下观察各组大鼠角膜植片水肿程度、透明度和新生血管形成情况,参照Holland等的评分标准对排斥反应指数（RI）进行评分;分别于术后第9天、第15天收集各组3只大鼠角膜组织,另取3只正常Wistar大鼠眼球作为正常对照,行常规组织病理学检查.各组取6只大鼠用于生存分析观察.结果术后1～4 d,裂隙灯显微镜下2个组角膜均轻度水肿,术后9～14d,单纯模型组大鼠角膜植片布满新生血管,可见植片水肿、混浊,而TLR2单克隆抗体组大鼠植片至术后第15天开始混浊.术后5、9、15d,单纯模型组大鼠RI评分均明显高于TLR2单克隆抗体组,差异均有统计学意义（t=4.183、4.954、13.506,均P＜0.05）;TLR2单克隆抗体组角膜植存活时间为15.5d,95％可信区间（CI）为14.9～16.1,单纯模型组角膜植片存活时间为9.5d,95％ CI为8.7～10.3,2个组间差异有统计学意义（Z=12.728,P=0.001）.角膜组织病理学检查显示,单纯模型组大鼠角膜基质层水肿明显,角膜组织中可见大量炎性细胞浸润和新生血管管腔形成,而在TLR2单克隆抗体组中仅见少量炎性细胞和新生血管.结论 TLR2单克隆抗体能减轻角膜移植术后的炎症反应,延长角膜植片的存活时间.

关键词： Toll样受体2 单克隆抗体/用法和用量穿透角膜移植/病理植片排斥/病理植片存活 /药物作用动物模型

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试论大数据时代下的智慧城市及城乡规划

城市建设理论研究(电子版) 2023年第19期 13-15页

作者：梁伟怡广州市花都区土地开发储备中心

近年来，我国市场竞争情况日益激烈，大数据技术的运用越发受欢迎，逐渐成了城乡规划中的重要一项。在大数据时代下，不但使人们的生产生活出现了巨大变化，而且还可促进城乡规划、智慧城市的建设，通过大数据技术的科学应用，能够为城... 详细信息

近年来，我国市场竞争情况日益激烈，大数据技术的运用越发受欢迎，逐渐成了城乡规划中的重要一项。在大数据时代下，不但使人们的生产生活出现了巨大变化，而且还可促进城乡规划、智慧城市的建设，通过大数据技术的科学应用，能够为城乡规划提供精准定位，为智慧城市的打造提供可视化帮助，从而积极推动我国社会经济的持续健康发展。基于此，本文主要分析大数据时代下的智慧城市及城乡规划，以供相关人员参考。

关键词：大数据时代智慧城市城乡规划

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高校体操教学中存在的问题及优化途径

新西部 2016年第12期 156-156页

作者：梁伟怡电子科技大学体育部

本文在阐述分析高校体育教学发展历程与存在问题的基础上,探讨优化体操教学的途径:确定合适的教学目标;合理设置教学内容;运用科学的教学方法;积极培养大学生骨干;完善考核方式。

关键词：高校体操教学历程存在问题优化途径

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高校体育教学中实施素质教育的新思考

北京体育大学学报 2007年第S1期30卷 272-页

作者：梁伟怡电子科技大学体育部四川成都610054

中国是一个文明古国。前至尧舜时代,就把品德列为第一;及至新中国成立,毛泽东提出了全面发展的教育方针,把德育列为了首位。到现在,在新的市场经济体制下,党中央仍然强调“两个”文明建设的重要地位,要做新时期的合格人才,高校素质教育... 详细信息

中国是一个文明古国。前至尧舜时代,就把品德列为第一;及至新中国成立,毛泽东提出了全面发展的教育方针,把德育列为了首位。到现在,在新的市场经济体制下,党中央仍然强调“两个”文明建设的重要地位,要做新时期的合格人才,高校素质教育变革就显得尤为重要。体育教学正好提供了这样的好场所,好时机,好的活教材。1体育教学是实施高校素质教育的重要途径1.1体育教学特点所决定体育教学绝大多数是学生经过一定的身体练习而有别于其它学科的教学。在身体练习的实践活动中,特定的比赛规则、游戏的法则;必须协调的人际关系,同班同学因体育基础不同而出现的学习热情、动机、兴趣不同等等,这些都是绝好的素质教育时机。1.2体育教材所决定各种体育教材都有一定的特点,教师可以结合教材的特点对学生进行素质教育。如讲授体育功能时,需激发学生的热情,努力锻炼身体。在教基本技术时,要教育学生遵守法则、法规、做文明的、守公德的好公民、培养学生高尚的思想品德。2转变传统体育观念,确立终身体育锻炼的指导思想,是实施素质教育的根本保证我们在对高校体育教育模式进行全面和总结分析的基础上,紧紧把握提高学生素质教育水平的大方向,扩大体育教学的范围,根据培养对象的特点及知识经济...

关键词：高校体育教学实施素质教育体育教材学生体质

Toll样受体2调节Th细胞极化对小鼠角膜移植排斥反应发生的影响

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眼科新进展 2016年第7期36卷 601-604页

作者：苏亚茹白浪刘晶梁伟怡于健孟婷南方医科大学南方医院眼科广东省广州市510000

目的探究Toll样受体2(Toll like receptor 2,TLR2)是否通过调节辅助性T细胞(T helper cells,Th)极化影响角膜移植排斥反应的发生。方法取30只C57BL/6小鼠和30只TLR2基因敲除小鼠为受体,BALB/c小鼠为供体,在受体小鼠右眼行同种异体角膜... 详细信息

目的探究Toll样受体2(Toll like receptor 2,TLR2)是否通过调节辅助性T细胞(T helper cells,Th)极化影响角膜移植排斥反应的发生。方法取30只C57BL/6小鼠和30只TLR2基因敲除小鼠为受体,BALB/c小鼠为供体,在受体小鼠右眼行同种异体角膜移植术,分别为野生组和基因敲除组;取19只C57BL/6小鼠右眼行自体角膜移植术,为自体组。术后每周两次裂隙灯下观察植片水肿程度和透明度,参照Sonoda评分标准对排斥指数(reject index,RI)进行评分;术后14 d收集角膜。分别取9只C57BL/6小鼠和TLR2基因敲除小鼠作为野生对照组和基因敲除对照组,行常规HE染色和实时荧光定量PCR检测。结果术后随时间变化各手术组植片水肿和混浊程度不一,以野生组最为严重。角膜RI评分显示术后7 d、14 d、21 d,基因敲除组(0.80±0.83、0.90±0.55、1.35±0.99)低于野生组(1.55±0.94、2.25±0.97、2.55±1.19),差异均有统计学意义(P=0.008、0.000、0.000)。HE染色显示,野生组角膜基质层出现水肿和大量炎性细胞;而基因敲除组和自体组炎症反应较轻。PCR检测显示,基因敲除组角膜Th1和Th17细胞因子(IFN-γ和IL^(-1)7)mRNA表达(1.94±0.34、2.62±0.30)比野生组(4.27±0.37、3.99±0.40)低,差异均有统计学意义(P=0.000、0.001);Th2细胞因子(IL-4)三组差异无统计学意义(P>0.05)。结论敲除TLR2可能通过抑制Th向Th1和Th17极化,降低角膜移植排斥率。

关键词： Toll样受体2 角膜移植免疫排斥 Th1 Th2 Th17

TLR2/MyD88信号系统在大鼠角膜移植术后排斥反应中的作用

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眼科新进展 2015年第6期35卷 506-510页

作者：郑艳华白浪梁伟怡于健杨娟谭青南方医科大学研究生院广东省广州市510515 南方医科大学南方医院眼科广东省广州市510515

目的探讨Toll样受体2(Toll like receptor,TLR2)/MyD 88信号系统在大鼠角膜移植术后排斥反应中的作用。方法取14只SD大鼠为供体,28只Wistar大鼠为受体,建立28个同种异体穿透性角膜移植模型。建模后分为同种异体角膜移植组14只(6只用于... 详细信息

目的探讨Toll样受体2(Toll like receptor,TLR2)/MyD 88信号系统在大鼠角膜移植术后排斥反应中的作用。方法取14只SD大鼠为供体,28只Wistar大鼠为受体,建立28个同种异体穿透性角膜移植模型。建模后分为同种异体角膜移植组14只(6只用于术后观察排斥情况),同种异体角膜移植TLR2单克隆抗体组14只(6只用于术后观察排斥情况)。另选16只Wistar大鼠,分为同种自体角膜移植组8只,正常对照组8只。3个手术组大鼠分别行穿透性角膜移植术。术后TLR2单克隆抗体组给予0.5 g·L-1TLR2单克隆抗体,分别于术后0 d、2 d、4 d、6 d、8 d分5次经球结膜下注射给药。正常对照组、同种自体角膜移植组及同种异体角膜移植组给等量生理盐水。术后每天于裂隙灯下观察角膜透明度、新生血管,并用排斥反应指数评分。第9天取材,行HE、免疫组织化学染色和实时荧光定量PCR检测。结果术后随时间变化各手术组角膜植片均出现不同程度的水肿、混浊和新生血管生长,以同种异体角膜移植组最为明显。HE染色结果显示在同种异体角膜移植组,角膜基质层出现水肿、大量炎症细胞浸润和新生血管,而在同种自体角膜移植组和TLR2单克隆抗体组中炎症反应较轻。免疫组织化学检测结果:TLR2和MyD 88分子在正常对照组、同种自体角膜移植组及TLR2单克隆抗体组的角膜上皮中均有微量表达,同种异体角膜移植组角膜上皮、基质细胞中TLR2和MyD 88分子的表达明显增多,尤以基质层明显。实时荧光定量PCR结果显示同种异体角膜移植组角膜组织TLR2 mR NA、MyD 88 mR NA的表达较同种自体角膜移植组(P=0.000、0.004)和正常对照组(P=0.000、0.000)显著增加,两者的表达亦较TLR2单克隆抗体组显著增加(P=0.000、0.003)。结论 TLR2单克隆抗体抑制TLR2及其下游信号分子MyD 88的表达;TLR2/MyD 88信号系统参与了角膜移植术后排斥反应,影响了角膜植片的转归。

关键词： TLR2单克隆抗体 TLR2/MyD88信号系统角膜移植免疫排斥

慢病毒载体介导TLR2基因干扰大鼠角膜上皮细胞和基质细胞的实验研究

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眼科新进展 2015年第12期35卷 1101-1104页

作者：梁伟怡白浪刘晶苏亚茹于健刘琼杨娟南方医科大学南方医院眼科广东省广州市510515

目的观察慢病毒载体(lentiviral vector,LV)介导TLR2基因干扰大鼠角膜上皮细胞(corneal epithelial cell,CEC)和基质细胞(corneal stromal cell,CSC)的有效性和安全性。方法分别培养大鼠CEC和CSC,转染组用携带绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,eGFP)和TLR2小干扰RNA(small interference RNA,siRNA)的LV转染,空白对照组加入空白培养液,阴性对照组加入不携带目的基因的LV。转染组按最佳感染复数(multiplicity of infection,MOI)分别为10、50、100、200加入LV-TLR2-siRNA-eGFP,选择eGFP表达最强的MOI进行后续实验,观察细胞形态,CCK8检测细胞增殖情况。流式细胞仪检测两种角膜细胞的转染效率,RT-PCR检测转染后TLR2 mRNA的表达情况。结果 MOI=200时转染CEC和CSC荧光表达最高,和空白对照组相比细胞形态未发生明显改变;CCK8结果显示转染组与空白对照组、阴性对照组的IOD值差异均无统计学意义(均为P>0.05);流式细胞仪检测CEC和CSC转染效率分别为77.600% ±1.100%和76.300% ±1.387%,和阴性对照组相比差异均有显著统计学意义(均为P<0.001)。RT-PCR检测转染后CEC和CSC TLR2 mRNA相对表达量均较对照组明显下降,差异均有显著统计学意义(均为P<0.001)。结论 LV-TLR2-siRNA-eGFP可在体外稳定有效转染CEC和CSC,且对细胞安全性无影响,可有效下调TLR2 mRNA的表达。

关键词：慢病毒载体基因转染角膜细胞 TLR2

经鼻塞式持续气道正压通气治疗新生儿呼吸窘迫综合征患儿的效果分析

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中国妇幼卫生杂志 2018年第3期9卷 73-75页

作者：梁伟怡戴怡蘅广东省佛山市妇幼保健院 528000

目的探讨经鼻塞式持续气道正压通气治疗新生儿呼吸窘迫综合征患儿的效果。方法对佛山市妇幼保健院2016年9月-2017年9月间70例新生儿呼吸窘迫综合征患儿进行研究,根据通气方式分为鼻塞组(n=35)和传统组(n=35),鼻塞组进行经鼻塞式持续气... 详细信息

目的探讨经鼻塞式持续气道正压通气治疗新生儿呼吸窘迫综合征患儿的效果。方法对佛山市妇幼保健院2016年9月-2017年9月间70例新生儿呼吸窘迫综合征患儿进行研究,根据通气方式分为鼻塞组(n=35)和传统组(n=35),鼻塞组进行经鼻塞式持续气道正压通气治疗,传统组进行鼻导管或面罩吸氧,分析总结两种通气方式的运用效果。结果鼻塞组患儿治疗24 h后Pa O2(73.8±6.7)mm Hg、p H(7.3±0.1)与传统组(64.2±7.8)mm Hg、(7.2±0.1)相比显著升高,Pa CO2水平(44.8±5.8)mm Hg与传统组(49.5±6.2)mm Hg相比显著降低(P=0.000、0.002、0.000)。鼻塞组患儿通气时间(25.3±5.1)h、住院时间(22.1±4.2)d、住院费用(2.1±1.4)元与传统组(31.2±5.6)h、(28.5±4.6)d、(2.8±1.1)元相比显著降低(P=0.000、0.000、0.023)。鼻塞组患儿并发症发生率8.6%与传统组31.4%相比显著降低(P=0.017),差异具有统计学意义。结论经鼻塞式持续气道正压通气治疗新生儿呼吸窘迫综合征,效果显著。

关键词：鼻塞式持续气道正压通气新生儿呼吸窘迫综合征气管插管血气