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CD—TK双自杀基因系统联合染料木黄酮对鼠前列腺癌的治疗作用

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中华泌尿外科杂志 2009年第9期30卷 639-640页

作者：朱文辉杜跃军梁中锟姜耀东郑少斌谭万龙南方医科大学南方医院泌尿外科广州510515

CD-TK双自杀基因包含单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV—TK）和大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶（CD）基因，能将丙氧鸟苷（GCV）及5-氟胞嘧啶（5-Fe）等无毒的前体药物转化成毒性药物，抑制RNA及DNA合成，从而导致肿瘤细胞的凋亡，研究表明二者协同可... 详细信息

CD-TK双自杀基因包含单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV—TK）和大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶（CD）基因，能将丙氧鸟苷（GCV）及5-氟胞嘧啶（5-Fe）等无毒的前体药物转化成毒性药物，抑制RNA及DNA合成，从而导致肿瘤细胞的凋亡，研究表明二者协同可以显著增强对肿瘤细胞的杀伤作用。

关键词：自杀基因系统 CD-TK 染料木黄酮治疗作用前列腺癌单纯疱疹病毒胸苷激酶胞嘧啶脱氨酶 5-氟胞嘧啶

SA-hTNF-α膜锚定修饰治疗表浅膀胱癌的实验研究

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南方医科大学学报 2010年第5期30卷 936-940页

作者：陈忠谭万龙黄鑫梁中锟徐翠香高基民南方医科大学南方医院泌尿外科广东广州510515 南方医科大学生物技术学院生物治疗研究所广东广州510515

目的探讨一种新型蛋白质锚定技术与人肿瘤坏死因子α(hTNF-α)相结合在小鼠表浅膀胱癌治疗中的作用。方法将120只雌性C57BL/6j小鼠分为5组:正常未处理组(空白对照组)、PBS对照组、可溶hTNF-α治疗组、SA-GFP锚定组、SA-hTNF-α锚定治疗... 详细信息

目的探讨一种新型蛋白质锚定技术与人肿瘤坏死因子α(hTNF-α)相结合在小鼠表浅膀胱癌治疗中的作用。方法将120只雌性C57BL/6j小鼠分为5组:正常未处理组(空白对照组)、PBS对照组、可溶hTNF-α治疗组、SA-GFP锚定组、SA-hTNF-α锚定治疗组,每组22只小鼠。建立小鼠正位表浅膀胱癌模型,24h后,将小鼠膀胱内膜生物素化,继而将hTNF-α融合蛋白灌注入小鼠膀胱中。每4d重复膀胱灌注锚定治疗1次,共6次。免疫组化检测SA-hTNF-α融合蛋白在生物素化的小鼠膀胱黏膜的存留时间及膀胱黏膜和肿瘤组织中CD4+T淋巴细胞及CD8+T淋巴细胞的分布,观察肿瘤生长情况及小鼠的生存期。检测肿瘤特异性淋巴细胞的杀伤活性。用MB49细胞再次攻击对SA-hTNF-α融合蛋白治疗有效的小鼠,观察肿瘤生长情况及小鼠的存活期。结果免疫组化显示:SA-hTNF-α融合蛋白可以在膀胱黏膜表面上稳定存留7d;MB49肿瘤细胞膀胱内种植后第60天,SA-hTNF-α锚定治疗组有18只小鼠存活(18/22),其中9只小鼠体外无触及肿瘤;PBS组全部死亡。对9只无瘤存活的小鼠再次用MB49细胞皮下攻击,60d后5只小鼠仍存活(5/9),与对照组有显著性差异(P<0.05)。膀胱癌病灶中CD4+T淋巴细胞及CD8+T淋巴细胞,SA-hTNF-α锚定治疗组较PBS对照组明显增多(P<0.05)。SA-hTNF-α锚定治疗组小鼠的杀伤效应明显强于正常组小鼠(P<0.05)。结论 SA-hTNF-α稳定的原位锚定于小鼠膀胱黏膜表面,可有效抑制小鼠表浅膀胱癌进展,显著延长荷瘤小鼠的生存时间,有效抵抗同源肿瘤细胞的再次攻击。

关键词：肿瘤坏死因子α 链亲和素生物免疫治疗膀胱癌

腺病毒介导TK/GCV基因系统联合肿瘤坏死因子对膀胱癌细胞的体外杀伤作用

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南方医科大学学报 2008年第5期28卷 750-753,757页

作者：石向华谭万龙朱文辉梁中锟杜跃军南方医科大学南方医院泌尿外科广东广州510515

目的研究腺病毒介导TK/GCV系统联合肿瘤坏死因子(TNF-α)对膀胱癌细胞的体外杀伤作用。方法采用含有TK基因、绿色荧光蛋白(GFP)基因的复制缺陷腺病毒(adv+)转染MB49细胞,观测转染率,RT-PCR检测转染细胞TK基因产物。以MB49细胞为对照,测... 详细信息

目的研究腺病毒介导TK/GCV系统联合肿瘤坏死因子(TNF-α)对膀胱癌细胞的体外杀伤作用。方法采用含有TK基因、绿色荧光蛋白(GFP)基因的复制缺陷腺病毒(adv+)转染MB49细胞,观测转染率,RT-PCR检测转染细胞TK基因产物。以MB49细胞为对照,测定不同浓度TNF-α作用下MB49细胞、不同浓度GCV作用下MB49/TK细胞的存活率,采用GCV联合低浓度TNF-α对MB49/TK细胞进行体外杀伤研究;流式细胞仪检测TK/GCV、TNF-α、TNF-α+TK/GCV对MB49细胞作用8h后细胞凋亡情况。结果随着浓度的增高GCV对MB49/TK细胞、TNF-α对MB49细胞的生长抑制率逐渐增高。GCV联合TNF-α对细胞杀伤率均较同浓度下单纯GCV及单纯TNF-α作用时的细胞杀伤率有明显增强,且随TNF-α浓度增高联合治疗组杀伤效率增强:单纯50μg/mlGCV组、5μg/mlTNF-α+50μg/mlGCV组、20μg/mlTNF-α+50μg/mlGCV组杀伤率分别(24.39±1.10)%、(40.05±0.97)%、(65.47±0.67)%。流式细胞仪检测细胞周期示TK/GCV、TNF-α、TK/GCV+TNF-α组作用细胞8h均可见典型sub-G1期细胞凋亡峰,联合作用组凋亡率最高。结论TNF-α能明显增强TK/GCV自杀基因系统对膀胱癌的杀伤作用,两者联合能够有效促进膀胱癌细胞的凋亡。

关键词：基因治疗 TK基因 TNF-α 膀胱癌细胞凋亡

粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子修饰MB49制备膀胱肿瘤疫苗及应用

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中华实验外科杂志 2011年第6期28卷 841-843页

作者：梁中锟张琳谭万龙高基民陈忠黄鑫南方医科大学附属南方医院泌尿外科广州510515 温州医学院浙江省医学遗传学重点实验室南方医科大学生命技术学院生物治疗研究所

目的链亲和素标记的细胞因子锚定MIM9细胞和成瘤小鼠膀胱，探讨锚定率、锚定量与时间的关系。方法MB49细胞与链亲和素标记的绿色荧光蛋白（SA—GFP）体外锚定后，在荧光显微镜下观察；建立小鼠原位表浅膀胱癌模型后，实验组膀胱灌注锚... 详细信息

目的链亲和素标记的细胞因子锚定MIM9细胞和成瘤小鼠膀胱，探讨锚定率、锚定量与时间的关系。方法MB49细胞与链亲和素标记的绿色荧光蛋白（SA—GFP）体外锚定后，在荧光显微镜下观察；建立小鼠原位表浅膀胱癌模型后，实验组膀胱灌注锚定链亲和素标记的粒细胞一巨噬细胞集落刺激因子（SA—GM—CSF）；对照组小鼠不锚定直接膀胱灌注SA—GM—CSF。取膀胱作冰冻切片免疫组织化学分析。结果MB49细胞基本被SA—GFP锚定，锚定率为98．78％；冰冻切片免疫组织化学显示实验组膀胱黏膜有阳性显色，以第1天最浓，以后逐日变淡，至第7天仍可见较明显染色；对照组膀胱黏膜无阳性显色。结论链亲和素标记的细胞因子可以锚定在细胞表面，且锚定效率高、保留时间长。

关键词：膀胱肿瘤疫苗粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 MB49 膜表面修饰

SA-hIL2双功能融合蛋白的研制及其生物学鉴定

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中国生物工程杂志 2009年第7期29卷 12-16页

作者：张琳胡志明法萍萍梁中锟高基民温州医学院浙江省医学遗传学重点实验室温州325035 南方医科大学生物技术学院生物治疗研究所广州510515

目的:制备链亲和素标记的人白细胞介素-2(SA-hIL2)融合蛋白,并研究其生物学功能。方法:构建SA-L-IL2-pET24重组表达质粒,在大肠杆菌中表达SA-hIL2融合蛋白,对表达的SA-hIL2融合蛋白采用镍金属螯合(Ni-NTA)层析柱进行纯化,透析复性。CCK-... 详细信息

目的:制备链亲和素标记的人白细胞介素-2(SA-hIL2)融合蛋白,并研究其生物学功能。方法:构建SA-L-IL2-pET24重组表达质粒,在大肠杆菌中表达SA-hIL2融合蛋白,对表达的SA-hIL2融合蛋白采用镍金属螯合(Ni-NTA)层析柱进行纯化,透析复性。CCK-8法检测SA-hIL2融合蛋白对PHA刺激的人外周血淋巴细胞的增值活性,流式细胞仪分析SA-hIL2融合蛋白对生物素化的B16.F10肿瘤细胞表面锚定修饰效率。结果:SA-hIL2在大肠杆菌中实现了高效表达,约占菌体总蛋白的20%,制备的SA-hIL2融合蛋白纯度达到95%,并具有双重活性,即hIL-2促进PHA刺激的人外周血淋巴细胞的增值活性和SA介导的高效结合至已生物素化的B16.F10肿瘤细胞表面的功能(表面锚定修饰效率约95%)。结论:研制的SA-hIL2融合蛋白具有双重活性,可为研制表面修饰的新型肿瘤细胞疫苗提供基础。

关键词：白细胞介素2 链亲和素融合蛋白锚定

采用哺乳动物细胞表面展示技术构建全长人源膀胱癌特异性抗体基因库

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南方医科大学学报 2013年第5期33卷 684-691页

作者：蓝开健张哲欢梁中锟王俊洁娄海波周元平刘叔文李长征谭万龙周辰南方医科大学南方医院南方医科大学汕头市中心医院广东汕头515000 南方医科大学药学院南方医科大学中医药学院广东广州510515 南方医科大学杭州环捷科技有限公司浙江富阳311400

目的构建大容量且能高效展示于哺乳动物细胞表面的全长人源膀胱癌特异性抗体基因库。方法分离膀胱癌患者的外周血单核细胞(PBMC),提取PBMC的总RNA,用RT-PCR方法扩增全套IgG1重链可变区(VH)和Kappa型轻链全长(LCκ)基因,经过相应的限制... 详细信息

目的构建大容量且能高效展示于哺乳动物细胞表面的全长人源膀胱癌特异性抗体基因库。方法分离膀胱癌患者的外周血单核细胞(PBMC),提取PBMC的总RNA,用RT-PCR方法扩增全套IgG1重链可变区(VH)和Kappa型轻链全长(LCκ)基因,经过相应的限制性内切酶酶切后分别插入pDGB-HC-TM载体,分别构建膀胱癌特异性的抗体重链基因库和轻链基因库(一级抗体库)。随机挑取20个单克隆测定抗体基因序列,并瞬时转染FCHO细胞,结合流式细胞仪检测细胞表面抗体的表达。将上述构建好的轻重链基因库通过4片段连接方法插入双表达载体pDGB4,构建二级抗体库,转染FCHO后用流式细胞仪检测细胞表面抗体表达。结果分别成功构建了膀胱癌特异性的重链基因库和轻链基因库,随机挑取的轻重链单克隆各有7个和9个含有正确的抗体基因编码序列,且能展示于哺乳动物细胞表面,理论库容量达到3.32×10^(11)[(1.7×10~6×70%)×(3.1×10~5×90%)]。成功构建了膀胱癌二级抗体库,库容量为9×10~5。结论利用哺乳动物细胞表面展示技术,我们成功构建了膀胱癌特异性的全长人源抗体基因库,一级抗体库的库容量达到3.32×10^(11),二级抗体库库容量达到9×10~5,为下一步筛选特异性、高亲和力抗膀胱癌抗体奠定了基础。

关键词：膀胱癌哺乳动物细胞表面展示全长人源抗体流式细胞仪检测

链亲和素标记的GM-CSF治疗膀胱癌疗效的初步观察

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临床泌尿外科杂志 2010年第11期25卷 828-831页

目的:将链亲和素标记的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(SA-GM CSF)原位锚定成瘤小鼠膀胱,探求该新疗法的可行性和有效性。方法:选择雌性C57BL/6小鼠50只,随机均分成5组,组1到组4建立原位表浅膀胱癌模型后,按照处理的不同又分为PBS组、GM CS... 详细信息

目的:将链亲和素标记的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(SA-GM CSF)原位锚定成瘤小鼠膀胱,探求该新疗法的可行性和有效性。方法:选择雌性C57BL/6小鼠50只,随机均分成5组,组1到组4建立原位表浅膀胱癌模型后,按照处理的不同又分为PBS组、GM CSF组、SA-GFP组和SA-GM-CSF组,分别给予相应治疗;6次治疗后,SA-GM-CSF组和组5(对照组)接受第二次肿瘤细胞攻击;观察所有小鼠的一般情况、肿瘤情况和生存期,并对死亡小鼠进行解剖,留取器官组织做病理切片或免疫组织化学染色。结果:SA-GM CSF组与其它各组比较,肿瘤出现的时间晚,肿瘤生长速度慢,小鼠生存期长(P_(max)=0.023,P<0.05);MB49细胞二次攻击后,SAGM-CSF组与对照组相比,生存期差异有显著统计学意义(x^2=9.551.P=0.002)。结论:SA GM-CSF原位锚定于雌性C57BL/6成瘤小鼠膀胱黏膜,有效抑制了膀胱肿瘤的生长,延长了小鼠的生存时间,并且能抵抗同源肿瘤的再次攻击,提示可能诱导了小鼠针对MB49的免疫保护作用;SA-GM-CSF原位锚定治疗比单纯细胞因子灌注法疗效更好。

关键词：膀胱肿瘤生物素链亲和素免疫治疗粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子

IL-21膜表面修饰MB49细胞疫苗治疗小鼠转移性膀胱癌的实验研究

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南方医科大学学报 2012年第6期32卷 807-811页

作者：彭俊铭石小军陈定南梁中锟蓝开健高基民谭万龙南方医科大学南方医院泌尿外科广东广州510515 温州医学院生命科学学院//浙江医学遗传学省级重点实验室浙江温州325035

目的制备白细胞介素21(IL-21)膜表面修饰的小鼠膀胱癌MB49细胞疫苗,评价其在小鼠膀胱癌皮下转移模型中诱导特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL s)的效应和治疗作用。方法将SA-IL-21锚定在经30%酒精灭活后的MB49细胞膜表面而制成IL-21膜表面修... 详细信息

目的制备白细胞介素21(IL-21)膜表面修饰的小鼠膀胱癌MB49细胞疫苗,评价其在小鼠膀胱癌皮下转移模型中诱导特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL s)的效应和治疗作用。方法将SA-IL-21锚定在经30%酒精灭活后的MB49细胞膜表面而制成IL-21膜表面修饰疫苗。建立C57BL/6小鼠皮下MB49膀胱癌模型,将荷瘤小鼠随机分为5组:IL-21膜表面修饰疫苗组、单纯游离IL-21组、GFP膜表面修饰疫苗组、单独灭活MB49肿瘤疫苗组、PBS组。利用上述制备的疫苗进行治疗,通过检测各组小鼠肿瘤体积变化及CTL来评价疫苗的抗肿瘤功能。结果成功制备了IL-21膜表面修饰MB49疫苗。IL-21/MB49疫苗可显著抑制肿瘤生长并产生长期特异性免疫反应(P<0.05)。在同一效靶比下IL-21/MB49疫苗组的CTL杀伤活性显著高于其他组(P<0.05)。结论采用蛋白膜锚定技术可将IL-21高效锚定于MB49细胞膜表面制备成IL-21膜表面修饰膀胱癌肿瘤疫苗,该疫苗既可保持IL-21生物学活性又可明显增强CTL杀伤BCa肿瘤活性。

关键词：转移性膀胱癌肿瘤疫苗免疫治疗白介素21 膜表面修饰

胸苷激酶／更昔洛韦系统联合肿瘤坏死因子-α治疗鼠膀胱癌

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中华实验外科杂志 2012年第6期29卷 1006-1008页

作者：石向华谭万龙李民杜跃军梁中锟南方医科大学珠江医院器官移植科广州510282 南方医科大学南方医院泌尿外科

目的观察腺病毒介导胸苷激酗更昔洛韦（TK／GCV）系统联合肿瘤坏死因子-a（TNF-a）对鼠膀胱癌的杀伤作用。方法构建MB49小鼠皮下模型，随机分为对照组、TK／GCV组、TNF-a组、联合治疗组。按治疗计划分组进行病毒及药物注射，实验结束测... 详细信息

目的观察腺病毒介导胸苷激酗更昔洛韦（TK／GCV）系统联合肿瘤坏死因子-a（TNF-a）对鼠膀胱癌的杀伤作用。方法构建MB49小鼠皮下模型，随机分为对照组、TK／GCV组、TNF-a组、联合治疗组。按治疗计划分组进行病毒及药物注射，实验结束测量肿瘤体积大小，进行组织病理学检查。结果体外实验验证低浓度TNF-a联合GCV较单纯GCV对细胞的杀伤率明显增强，差异有统计学意义（P〈0．01）。流式细胞仪检测，联合治疗组较单独用药组凋亡率明显提高，差异有统计学意义（P〈0．01）。动物实验结柬后肿瘤体积对比：TK／GCV组为（93．43±2．10）mm3、TNF-a组为（53．95±2．61）mm3、对照组为（171．52±4．33）mm3、联合治疗组为（18．23±1．11）mm3，联合治疗组肿瘤体积较其他各组明显缩小，差异有统计学意义（P〈0．01）。苏木素-伊红（HE）染色见各治疗组均出现细胞坏死凋亡，其中联合治疗组仅于周边见少量肿瘤细胞存活。结论GCV对转染腺病毒MB49细胞及TNF-a对MB49细胞均有良好的抑制生长作用，且呈浓度依赖性；TK／GCV、TNF-a均能有效诱导凋亡，且两者具有协同作用；TK／GCV系统联合小剂量TNF—a能增强自杀基因系统对小鼠膀胱癌的治疗作用。

关键词：胸苷激酶/更昔洛韦肿瘤坏死因子-a 膀胱癌脱噬作用