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部分全麻药对突触发生期中枢神经系统发育的影响及机制

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医学研究生学报 2012年第4期25卷 430-433页

作者：燕琳桂伶俐张传汉华中科技大学附属同济医院麻醉科武汉医学硕士研究生430030

近年的研究表明,在未成熟哺乳动物突触发生期,短暂性拮抗N-甲基-D-天(门)冬氨酸(N-methyl-D-asparate,NMDA)受体或过度激动γ-氨基丁酸A(gamma-amino butyric acid,GABAA)受体可诱发大脑神经细胞的大量凋亡、脊髓凋亡性退变。这些药物... 详细信息

近年的研究表明,在未成熟哺乳动物突触发生期,短暂性拮抗N-甲基-D-天(门)冬氨酸(N-methyl-D-asparate,NMDA)受体或过度激动γ-氨基丁酸A(gamma-amino butyric acid,GABAA)受体可诱发大脑神经细胞的大量凋亡、脊髓凋亡性退变。这些药物主要有全身麻醉药、抗惊厥药及乙醇等。人类突触发生高峰期为妊娠后3个月到出生后3年。妊娠晚期、新生儿及婴幼儿刚好处在这个时间窗,因此该类药物对脑发育的影响成为人们研究的热点,其机制的阐明可能对新生儿、婴幼儿以及孕产妇临床合理用药及新药的开发有指导意义。文中就部分全麻药对突触发生期中枢神经系统发育的影响及机制作一综述。

关键词：全身麻醉药 NMDA受体拮抗剂 GABAA受体激动剂突触发生期凋亡

人NF-κB亚基p65、p50基因重组逆转录病毒表达载体及包装细胞株的建立和鉴定

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华中科技大学学报（医学版） 2008年第1期37卷 97-100,108页

作者：桂伶俐刘志恒张传汉祝畅高峰华中科技大学同济医学院附属同济医院麻醉学教研室武汉430030

目的构建分别携带人核因子-κB(NF-κB)亚基p65、p50基因的逆转录病毒载体,并建立稳定产毒的包装细胞株。方法以RcCMV-p65、RcCMV-p50质粒为模板,PCR扩增p65、p50基因编码区全长序列,分别克隆至逆转录病毒空载体pMSCVneo、pMSCVhyg,酶... 详细信息

目的构建分别携带人核因子-κB(NF-κB)亚基p65、p50基因的逆转录病毒载体,并建立稳定产毒的包装细胞株。方法以RcCMV-p65、RcCMV-p50质粒为模板,PCR扩增p65、p50基因编码区全长序列,分别克隆至逆转录病毒空载体pMSCVneo、pMSCVhyg,酶切、测序鉴定。将重组载体及空载体分别转染包装细胞系PT67,以G418或潮霉素筛选产毒细胞株。收集病毒悬液,测定病毒滴度,并瞬时感染NIH3T3细胞及人神经干细胞,72h后分别采用RT-PCR和免疫细胞化学观察p65、p50的表达。结果重组逆转录病毒载体pMSCVneo-p65、pMSCVhyg-p50的酶切、测序鉴定正确。将筛选所得的高效产毒细胞株分别命名为PT67/pMSCVneo-p65、PT67/pMSCVneo、PT67/pMSCVhyg-p50及PT67/pMSCVhyg,测定病毒滴度分别为4×105、6×105、2×105及1×105cfu/ml。pMSCVneo-p65、pMSCVhyg-p50病毒悬液瞬时感染NIH3T3细胞72h后,细胞p65、p50亚基mRNA的表达明显升高;瞬时感染人神经干细胞(hNSC)72h后,部分细胞胞核呈p65和p50阳性染色。结论成功构建了分别携带人p65、p50基因的逆转录病毒载体,建立了稳定、高效、正确生产逆转录病毒的细胞株。为探讨转NF-κB基因神经干细胞在缺血性卒中的运用前景奠定了实验基础。

关键词：干细胞移植脑缺血核因子κB 逆转录病毒科

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人胚神经干细胞的长期贴壁培养和鉴定

中国康复医学杂志 2006年第4期21卷 322-324页

作者：祝畅张传汉刘志恒桂伶俐高峰华中科技大学同济医学院附属同济医院麻醉学教研室武汉市解放大道1095号430030 广东省深圳市第二人民医院麻醉科

目的:探讨人胚神经干细胞的长期贴壁培养条件及传代方法。方法:在多种培养条件下,分别从9周和16周人胚脑中分离培养神经干细胞,应用免疫细胞化学的方法对所分离细胞的巢蛋白表达、自我更新能力和多向分化潜能进行鉴定。结果:采用高密度... 详细信息

目的:探讨人胚神经干细胞的长期贴壁培养条件及传代方法。方法:在多种培养条件下,分别从9周和16周人胚脑中分离培养神经干细胞,应用免疫细胞化学的方法对所分离细胞的巢蛋白表达、自我更新能力和多向分化潜能进行鉴定。结果:采用高密度悬浮培养法能有效地从两种胚龄的人胚脑或室管膜下区中分离出神经干细胞,而采用贴壁培养法的人胚神经干细胞能保持干细胞的特性稳定增殖4个月。结论:从大小胚龄的人胚中均可成功分离培养人胚神经干细胞,贴壁培养的人胚神经干细胞能稳定增殖,是进一步进行人胚神经干细胞转基因研究的良好模型。

关键词：人胚胎神经干细胞细胞培养

IκBα突变型基因转染对永生化神经前体细胞生物学特性的影响

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中华麻醉学杂志 2007年第10期27卷 932-934页

作者：祝畅刘志恒张传汉桂伶俐姚文龙华中科技大学同济医学院附属同济医院麻醉学教研室武汉市430030

目的评价IκBα突变型基因转染对永生化神经前体细胞株（INPCs）增殖、分化及部分炎性细胞因子分泌的影响。方法在已经建立的转染pcDNA 3.1及转染pcDNA3.1/IκBαM的INPCs的基础上,用MTT法绘制两种细胞株的生长曲线,用流式细胞仪检测其... 详细信息

目的评价IκBα突变型基因转染对永生化神经前体细胞株（INPCs）增殖、分化及部分炎性细胞因子分泌的影响。方法在已经建立的转染pcDNA 3.1及转染pcDNA3.1/IκBαM的INPCs的基础上,用MTT法绘制两种细胞株的生长曲线,用流式细胞仪检测其增殖指数,以5%小牛血清诱导分化后,采用Western blot法测定两种细胞株的分化情况,同时用realtime RT-PCR测定肿瘤坏死因子-α（TNF-α）mRNA、白细胞介素-1β（IL-1β）mRNA和白细胞介素-6（IL-6）mRNA的表达。结果与转染pcDNA 3.1 INPCs比较,转染pcDNA 3.1/IκBαM INPCs的增殖指数、IL-1βmRNA和IL-6 mRNA表达降低（P〈0.05）,TNF-αmRNA表达差异无统计学意义（P〉0.05）。经血清诱导分化后,两种细胞株均大量表达胶原纤维酸性蛋白。结论IκBα突变型基因转染可减慢INPCs的增殖,并减少部分炎性细胞因子的表达,但对INPCs的分化无影响。

关键词： NF-κB 干细胞转染细胞增殖细胞分化细胞因子类

慢性吗啡耐受大鼠脊髓神经元兴奋性氨基酸转运体3表达的变化

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中华麻醉学杂志 2010年第1期30卷 60-63页

作者：桂伶俐万里张传汉华中科技大学同济医学院附属同济医院麻醉学教研室武汉市430030

目的观察慢性吗啡耐受大鼠脊髓神经元兴奋性氨基酸转运体3（EAAT3）表达的变化。方法成年雄性SD大鼠45只，随机分为5组（n=9），除假手术组（S组）外，生理盐水组（NS组）、吗啡组（M组）、氯胺酮组（K组）和吗啡＋氯胺酮组（M＋K组）... 详细信息

目的观察慢性吗啡耐受大鼠脊髓神经元兴奋性氨基酸转运体3（EAAT3）表达的变化。方法成年雄性SD大鼠45只，随机分为5组（n=9），除假手术组（S组）外，生理盐水组（NS组）、吗啡组（M组）、氯胺酮组（K组）和吗啡＋氯胺酮组（M＋K组）均进行鞘内置管，鞘内置管后3d进行鞘内给药，NS组鞘内注射生理盐水40阻，M组给予吗啡20烬，K组给予氯胺酮30μg，M＋K组给予吗啡20μg＋氯胺酮30μg，2次/d，连续7d。分别在给药前、给药1、3、5、7d及停药后1d时测定50％缩爪阈值（PWT）与辐射热缩爪潜伏期（PwL），最后一次测定痛阈后处死大鼠，分别采用免疫印迹分析和免疫组化法检测脊髓EAAT3的表达水平。结果与S组比较，M组给药1、3d时PWT升高，给药7d及停药后1d时PWT降低，给药1、3、5d时PWL延长，停药后1d时PWL缩短；M＋K组给药1、3、5、7d及停药后1d时PWT升高，PWL延长，M组和M＋K组脊髓EAAT3表达下调（P〈0．05）；与M组比较，M＋K组给药3、5、7d及停药后1d时PWT升高，给药5、7d时及停药后1d时PWL延长，脊髓EAAT3表达上调（P〈0．05）。EAAT3主要分布于脊髓背角Ⅰ-Ⅱ层的感觉神经元。结论脊髓背角神经元EAAT3表达下调参与了大鼠慢性吗啡耐受的形成，吗啡下调EAAT3表达的部分机制与激活N-甲基-D天冬氨酸受体有关。

关键词：吗啡药物耐受性脊髓兴奋性氨基酸转运体3

转IκBα突变型基因永生化神经前体细胞株的构建

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中华麻醉学杂志 2006年第8期26卷 756-759页

作者：刘志恒祝畅桂伶俐姚文龙张传汉华中科技大学同济医学院附属同济医院麻醉学教研室

目的掏建转IΚBα突变型基因水生化神经前体细胞抹(INPCs)。方法限制性内切酶双酶切含IΚBα突变型基因的质粒pBluescript/CNP/IΚBαM,得到目的基因片断IΚBα突变型基因,克隆入真核表达载体pcDNA3．1中,酶切反应及DNA测序鉴定莆组载体... 详细信息

目的掏建转IΚBα突变型基因水生化神经前体细胞抹(INPCs)。方法限制性内切酶双酶切含IΚBα突变型基因的质粒pBluescript/CNP/IΚBαM,得到目的基因片断IΚBα突变型基因,克隆入真核表达载体pcDNA3．1中,酶切反应及DNA测序鉴定莆组载体pcDNA3．1/IΚBαM。利用脂质体介导的基因转染技术分别将载体pcDNA3．1及pcDNA3．1/IΚBαM转染INPCs．经G418(150μg/ml)筛选,挑选阳性克隆并扩大培养．2周后用RT-PCR和Western blot检测阳性细胞株中IΚBα的表达,用受NF-ΚB特异性启动表达的荧光素酶报告基因检测阳性细胞株中NF-κB的活性。结果经限制性酶切分析及DNA测序证实重组载体pcDNA3．1/IκBαM中含有IκBα突变型基因．转pcDNA3．1/IκBαM永生化神经前体细胞中IκBα的总mRNA表达增高,Western blot可检测到突变型IκBα蛋白的表达,且细胞中NF-κB活性下降。结论成功构建了,转IκBα突变型基因INPCs。

关键词： I—κB 神经元基因表达

大鼠永生化神经前体细胞CDH1小干扰RNA真核载体的构建

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中华麻醉学杂志 2008年第10期28卷 919-921页

作者：姚文龙张传汉柳璐祝畅邱瑾桂伶俐田玉科华中科技大学同济医学院附属同济医院麻醉科武汉市430030

目的构建大鼠永生化神经前体细胞（INPC）CDH1小干扰RNA（siRNA）真核载体。方法根据大鼠CDH1基因的编码序列设计3个小发夹RNA（shRNA）干扰序列及1个阴性对照序列，根据pENTR／H1／TO中间载体说明书设计并合成相应的DNA单链，退火后分... 详细信息

目的构建大鼠永生化神经前体细胞（INPC）CDH1小干扰RNA（siRNA）真核载体。方法根据大鼠CDH1基因的编码序列设计3个小发夹RNA（shRNA）干扰序列及1个阴性对照序列，根据pENTR／H1／TO中间载体说明书设计并合成相应的DNA单链，退火后分别连接到pENTR／H1／TO线性载体上，形成完整载体，提取CDH1 siRNA真核载体后（分别为CDH1 siRNA1、CDH1 siRNA2、CDH1 siRNA3和CDH1 siRNA对照），进行DNA测序鉴定。采用Lipofectamine 2000法，分别将成功构建的CDH1 siRNA真核载体转染大鼠INPC，于转染24h和48h时计算INPC转染效率=INPC成功转染数／细胞总数，于转染48h时提取细胞总RNA，采用实时定量PCR法检测INPC CDH1 mRNA的表达。结果经DNA测序鉴定构建的3个CDH1 siRNA真核载体和1个阴性对照载体所插入的RNA干扰序列均正确，无碱基突变或缺失；INPC转染24h与48h时转染效率分别为（54±5）％和（36±4）％；CDH1 sinNA2转染INPC 48h时INPC CDH1 mRNA表达水平较CDH1 siRNA3降低，且两者均低于CDH1 siRNA1（P〈0．05）。结论本研究成功构建大鼠INPC CDH1 siRNA真核载体。

关键词：细胞周期末期促进复合物 RNA,小干扰干细胞

不同核因子κB二聚体对永生化神经前体细胞存活的影响

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中华医学杂志 2008年第13期88卷 871-875页

作者：桂伶俐张传汉刘志恒陈钊军祝畅华中科技大学同济医学院附属同济医院麻醉学教研室武汉 430030 深圳市第二人民医院麻醉科广东公安边防总队医院麻醉科

目的探讨不同核因子κB（NF-κB）二聚体在缺氧缺糖条件下对永生化神经前体细胞（INPC）生存的影响。方法将含巨细胞病毒启动子的对照载体（RC／CMV）及NF-κB亚基p50、p65的真核表达载体RcCMV-p50、RcCMV-p65分别及共转染INPC。蛋白质... 详细信息

目的探讨不同核因子κB（NF-κB）二聚体在缺氧缺糖条件下对永生化神经前体细胞（INPC）生存的影响。方法将含巨细胞病毒启动子的对照载体（RC／CMV）及NF-κB亚基p50、p65的真核表达载体RcCMV-p50、RcCMV-p65分别及共转染INPC。蛋白质印迹法分析不同细胞株p50及p65的表达。凝胶电泳迁移实验（EMSA）检测胞核内NF-κB的DNA结合活性。蛋白质印迹法分析胞质蛋白IκBα的表达。缺氧缺糖13h后，噻唑蓝（M丌）法测定细胞存活率。结果转基因后，共得到5株不同细胞，分别命名为INPC、INPC／CMV、INPC／p50、INPC／p65和INPC／p50p65。蛋白质印迹分析显示，p50和p65基因均能在转染相应质粒的细胞株中高效表达。EMSA表明，INPC／p50、INPC／p65和INPC／p50p65细胞胞核中分别形成p50同源二聚体、p65同源二聚体、p50p65异源二聚体和p50同源二聚体。INPC／p65和INPC／p50p65细胞株中，IκBα在胞质中表达明显升高，并且缺氧缺糖处理13h后，细胞存活率显著低于其他细胞株（Games-Howell检验，均P〈0．05）。结论p50、p65的高表达可直接导致胞核内不同NF-κB二聚体DNA结合活性的升高。在神经前体细胞中，具有转录活性的NF-κB二聚体减少了缺氧缺糖刺激后细胞的存活，但无转录活性的NF-κB二聚体并未发挥保护性作用。

关键词： NF-κB 细胞存活基因表达转染神经前体细胞

曲古抑菌素A诱导Hela细胞凋亡过程中端粒酶逆转录酶表达的变化

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中国肿瘤临床 2007年第8期34卷 421-425页

作者：吴鹏奚玲陈刚桂伶俐王蓓蓓罗丹枫卢运萍周剑锋马丁华中科技大学同济医学院附属同济医院妇产科武汉市430030 华中科技大学同济医学院附属同济医院麻醉科武汉市430030 华中科技大学同济医学院附属同济医院血液科武汉市430030

目的:观察Trichostatin A(TSA)对子宫颈癌细胞株Hela细胞的体外作用,探讨TSA对子宫颈癌细胞的作用机制,以及细胞凋亡与端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)之间的关系。方法:倒置相差显微镜观察细胞形态变化... 详细信息

目的:观察Trichostatin A(TSA)对子宫颈癌细胞株Hela细胞的体外作用,探讨TSA对子宫颈癌细胞的作用机制,以及细胞凋亡与端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)之间的关系。方法:倒置相差显微镜观察细胞形态变化;磺酰罗丹明B(sulforhodamine B;SRB)法检测药物动力学特征;流式细胞仪检测药物作用前后Hela细胞凋亡情况;RT-PCR检测hTERT和p21Waf1基因变化;免疫荧光检测TSA作用前后hTERT表达变化。结果:在0.5～2.0μmol/LTSA作用下,Hela细胞生长明显受抑制。倒置相差显微镜检测Hela细胞经TSA处理后形态发生明显变化。2.0μmol/LTSA作用于Hela细胞,48h以前表现细胞周期的变化,48h后则出现明显的凋亡。hTERT经1.0μmol/LTSA诱导后表达下调,呈时效关系。免疫荧光检测hTERT蛋白经1μmol/LTSA处理后表达下降;结论:一定浓度的TSA可以诱导子宫颈癌细胞株Hela凋亡,其作用机制可能与下调hTERT表达有关。

关键词：曲古抑菌素A 宫颈癌凋亡端粒酶逆转录酶