检索结果-南通市图书馆

马立克病病毒单克隆抗体库构建及gB蛋白特异性单抗的筛选与鉴定

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畜牧兽医学报 2023年

作者：李林燕滕蔓刘金玲郑鹿平柴书军丁轲余祖华罗俊河南省农业科学院动物免疫学重点实验室农业农村部动物免疫学重点实验室河南省动物免疫学重点实验室河南省农业科学院中英禽病国际研究中心河南科技大学功能微生物与畜禽健康实验室

马立克病(MD)是由马立克病病毒(MDV)感染引起的危害最严重的一种家禽免疫抑制病与肿瘤病，制备MDV单克隆抗体可为后续的基因功能、致病机制及诊断技术研究提供关键试剂。本研究利用NE-PERTM细胞核和细胞质提取试剂，分别制备了vvMDV标... 详细信息

马立克病(MD)是由马立克病病毒(MDV)感染引起的危害最严重的一种家禽免疫抑制病与肿瘤病，制备MDV单克隆抗体可为后续的基因功能、致病机制及诊断技术研究提供关键试剂。本研究利用NE-PERTM细胞核和细胞质提取试剂，分别制备了vvMDV标准毒株Md5感染的鸡胚成纤维细胞(CEF)核蛋白和浆蛋白，通过切向流超滤浓缩后制备免疫原，分别免疫6～8周龄雌性BALB/c小鼠，常规细胞融合方法制备单克隆抗体杂交瘤细胞。通过间接免疫荧光试验(IFA)筛选，建立了一个容量为 31株纯化的MDV单克隆抗体杂交瘤细胞库，包括27株稳定分泌MDV-1特异性抗体和4株稳定分泌MDV-1、MDV-2和HVT保守抗体的杂交瘤细胞株。经过293T细胞真核表达gB蛋白并结合IFA染色，其中1株单克隆抗体J-1F3-C6被鉴定为MDV糖蛋白gB的特异性单克隆抗体，其单抗腹水IFA效价为1：25 600，轻链型为Kappa，IgG亚型为IgG2a。进一步IFA染色表明，J-1F3-C6可特异性识别MDV-1、MDV-2和HVT毒株表达的gB蛋白，但在蛋白质免疫印迹(Western blot)分析中J-1F3-C6只与MDV-1和HVT发生特异性反应。综上，本研究建立了一个MDV单克隆抗体杂交瘤细胞库，并从中筛选鉴定了1株gB蛋白特异性的单克隆抗体，为后续研究奠定了重要基础。

关键词：马立克病单克隆抗体糖蛋白gB 间接免疫荧光试验共聚焦分析蛋白质免疫印迹

猪细小病毒7型LAMP-LFD快速检测方法的建立及应用

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畜牧与兽医 2022年第9期54卷 71-77页

作者：柴书军郭军庆刘运超崔燕甘肃农业大学动物医学院甘肃兰州730070 河南省农业科学院动物免疫学重点实验室河南郑州450002

为了建立一种用于猪细小病毒(PPV)7型的特异、灵敏、快速、简便检测方法,采用环介导等温扩增技术(LAMP)与侧向流动层析试纸(LFD)相结合,根据GenBank发布的PPV7保守区NS1蛋白基因序列设计1套带生物素标签的特异性引物和异硫氰酸(FITC)探... 详细信息

为了建立一种用于猪细小病毒(PPV)7型的特异、灵敏、快速、简便检测方法,采用环介导等温扩增技术(LAMP)与侧向流动层析试纸(LFD)相结合,根据GenBank发布的PPV7保守区NS1蛋白基因序列设计1套带生物素标签的特异性引物和异硫氰酸(FITC)探针,以PPV7-pET28a重组质粒为阳性模板建立了PPV7-LAMP-LFD检测方法,对LAMP-LFD的反应温度、反应时间及胶体金标记FITC单克隆抗体(FITC-mAb)比例进行优化,分析该方法的敏感性和特异性。结果:建立的PPV7-LAMP-LFD检测方法最适反应温度为64℃,最佳反应时间为60 min;标记1 mL胶体金需要FITC-mAb量为15.6μg;该检测方法的最低检测限为1 copies/μL,其灵敏度比琼脂糖凝胶电泳和荧光定量PCR高10倍;对伪狂犬病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、乙型脑炎病毒、猪瘟病毒和PPV1~6型病毒检测为阴性,特异性良好;不同批次引物和探针检测结果一致,重复性好;对86份血样的诊断结果与荧光定量PCR进行比对,LAMP-LFD检测方法的阳性率为9.30%(8/86),检测灵敏度为100%(8/8),特异性为100%(78/78),2种方法的符合率为98.83%(85/86)。本研究为PPV7感染的监测与防控提供了技术支撑。

关键词：猪猪细小病毒环介导等温扩增检测试纸

猪细小病毒LAMP-LFD检测方法的建立及初步应用

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黑龙江畜牧兽医 2022年第7期 13-18,24,126页

作者：柴书军郭军庆乔松林崔燕河南省农业科学院动物免疫学重点实验室郑州450002 甘肃农业大学动物医学院兰州730070

为了建立一种用于猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)的特异、灵敏、快速检测方法,试验根据GenBank发布的PPV基因序列保守区片段设计了一套带生物素标签的特异性引物和FITC探针,以pET28a-NS1重组质粒为阳性模板将环介导等温扩增(loop-m... 详细信息

为了建立一种用于猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)的特异、灵敏、快速检测方法,试验根据GenBank发布的PPV基因序列保守区片段设计了一套带生物素标签的特异性引物和FITC探针,以pET28a-NS1重组质粒为阳性模板将环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术与侧向流动层析试纸(lateral flow dipstick,LFD)相结合,建立了PPV-LAMP-LFD检测方法,对LAMP-LFD的反应温度、反应时间及胶体金标记FITC-mAb比例进行优化,分析该方法的敏感性和特异性,并检测其早期临床应用效果。结果表明:建立的PPV-LAMP-LFD检测方法最适反应温度为64℃,最佳反应时间为50 min;标记1 mL胶体金需要14μg FITC-mAb;该检测方法的最低检测限为1×10 copies/μL,比琼脂糖凝胶电泳和荧光定量PCR灵敏度高19倍;对猪伪狂犬病毒(PRV)、蓝耳病病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)、猪乙型脑炎病毒(JEV)和猪瘟病毒(CSFV)检测结果均呈阴性;早期临床应用显示可在猪感染PPV后4 h的血液中检出病毒。说明建立的PPV-LAMP-LFD检测方法具有灵敏、特异、快速、简便等优点。

关键词：猪猪细小病毒环介导等温扩增技术探针检测试纸

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猪细小病毒抗原快速检测技术研究

猪细小病毒抗原快速检测技术研究

作者：柴书军河南农业大学

学位级别：硕士

猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)是一种DNA病毒,隶属于细小病毒科细小病毒属,是猪场比较常见疾病,以引起猪的繁殖障碍为特征。同时该病可以猪群中长期隐性感染,并且感染率可以高达90%以上,对猪群造成严重危害。临床上常用的血清学... 详细信息

猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)是一种DNA病毒,隶属于细小病毒科细小病毒属,是猪场比较常见疾病,以引起猪的繁殖障碍为特征。同时该病可以猪群中长期隐性感染,并且感染率可以高达90%以上,对猪群造成严重危害。临床上常用的血清学诊断方法因受猪细小病毒病长期带毒和低剂量持续感染的限制,而使得检测难度加大。同时实验室诊断方法也受到设备、环境和时间的制约,无法得以推广。本论文就针对以上弊端进行研制特异强、操作简便的胶体金试纸快速检测试纸。在试验进行中由于商品化抗猪IgG和兔IgG酶标抗体,均出现效价低,组化效果差。于是通过提取及凝胶柱纯化猪IgG和兔IgG免疫山羊,经过4次以上免疫,而后颈静脉采血而得到AGP效价1:160-320的二抗血清。提取血清IgG利用SATP-SMCC法标记HPR,得到ELISA效价1:64000的酶标二抗用于实验检测。通过PK-15传代细胞系在DMEM培养基中对猪细小病毒AV30-7909毒株的扩繁,经过5次传代、扩繁增殖,出现明显细胞病变。收集病毒通过浓缩、超速离心纯化,免疫实验兔,得到效价1:51200的多抗血清。利用纯化的PPV细胞毒免疫BALB/c小鼠,经过三次免疫获得理想免疫效果。应用细胞融合技术筛选出特异性杂交瘤细胞株(7F4B7)。通过体内诱导制备PPVmAb,提取、纯化单抗IgG,而后通过胶体金标记研制出PPV抗原胶体金试纸,可以测定出1:640稀释的组织毒。试纸检测猪瘟、流行性乙型脑炎病毒和蓝耳病没有交叉反应。该产品具有快速、特异、简便等特点,适合临床和生产中推广应用。

关键词：猪细小病毒单克隆抗体胶体金试纸检测

口蹄疫病毒感染与免疫鉴别诊断及免疫评价二联试纸的优化

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中国畜牧兽医 2022年第10期49卷 3953-3962页

作者：杨苏珍孙亚宁刘运超柴书军张改平河南省农业科学院动物免疫学重点实验室郑州450002 河南农业大学牧医工程学院郑州450002 江苏高校动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心扬州225009

【目的】建立口蹄疫病毒(FMDV)感染与免疫鉴别诊断及免疫评价二联试纸稳定的生产工艺,促进其产业化生产及临床应用。【方法】本研究以胶体金免疫探针结合猪IgG,FMDV结构蛋白(SP)及非结构蛋白(NSP)的表位多肽偶联载体蛋白制备人工抗原,... 详细信息

【目的】建立口蹄疫病毒(FMDV)感染与免疫鉴别诊断及免疫评价二联试纸稳定的生产工艺,促进其产业化生产及临床应用。【方法】本研究以胶体金免疫探针结合猪IgG,FMDV结构蛋白(SP)及非结构蛋白(NSP)的表位多肽偶联载体蛋白制备人工抗原,设置两条检测线精准拦截抗体的检测模式,以试纸条特异性及敏感性为评价指标,对胶体金免疫探针用蛋白、试纸拦截用多肽抗原、检测线位置及喷膜缓冲液、金标蛋白保存液、样品垫缓冲液以及样品稀释液等参数进行优化。采用优化后的试纸检测266份田间猪血清样品,并与口蹄疫O型抗体液相阻断ELISA检测试剂盒(LPB ELISA)和3ABC阻断ELISA抗体检测试剂盒(3ABC ELISA)检测结果进行对比,计算该试纸与商品ELISA试剂盒的符合率。【结果】经优化后,口蹄疫感染与免疫鉴别诊断及免疫评价二联试纸生产工艺参数如下:以胶体金标记金黄色葡萄球菌A蛋白(SPA)为免疫探针;选择混合多肽的形式设置拦截线,以非结构蛋白多肽(BSA-NSPs)喷涂T1线,结构蛋白多肽(BSA-SPs)喷涂T2线,以0.1 mol/L Tris-HCl为喷膜缓冲液;以ddHO含15 mg/mL BSA、13.25 mg/mL NaHPO·12HO、15.9 mg/mL NaHPO·2HO、10%Trition X-100和0.3 mg/mL NaN为金标蛋白保存液;以0.02 mol/L NaBO·10HO含10 mg/mL酪蛋白、5%Trition X-100、0.3 mg/mL NaN为样品垫缓冲液;以生理盐水含1.0%Tween-20为样品稀释溶液。制备的FMDV感染与免疫鉴别诊断及免疫评价二联试纸与3ABC阻断ELISA抗体检测试剂盒的符合率为96.20%,与口蹄疫O型抗体液相阻断ELISA检测试剂盒的符合率为94.36%。【结论】通过对试纸生产工艺的优化,建立了稳定的生产工艺,制备的二联试纸检测线显色清晰可见,肉眼识别度高,试纸的检测特异性和敏感性良好。本研究为该试纸的批量生产和产业化应用奠定了基础,为基层口蹄疫的检测提供了稳定、特异、敏感、准确的检测方法。

关键词：口蹄疫病毒(FMDV) 抗体试纸优化

鸡异质核糖核蛋白AB单克隆抗体的制备及鉴定

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河南农业科学 2022年第2期51卷 127-132页

作者：罗俊党露郑鹿平刘金玲柴书军赵东杨艳艳滕蔓河南省农业科学院动物免疫学重点实验室/农业农村部动物免疫学重点实验室/河南省动物免疫学重点实验室河南郑州450002 河南省农业科学院中英禽病国际研究中心河南郑州450002 广州医科大学附属第三医院广东广州510095

为研制鸡异质核糖核蛋白AB(hnRNPAB)单克隆抗体,为其生物学功能研究提供关键试剂,构建重组质粒pET-30a-hnRNPAB,转化感受态细胞E.coli BL21,经IPTG诱导表达,并通过树脂Ni对可溶性表达的鸡hnRNPAB蛋白进行亲和层析纯化之后免疫Balb/c小鼠... 详细信息

为研制鸡异质核糖核蛋白AB(hnRNPAB)单克隆抗体,为其生物学功能研究提供关键试剂,构建重组质粒pET-30a-hnRNPAB,转化感受态细胞E.coli BL21,经IPTG诱导表达,并通过树脂Ni对可溶性表达的鸡hnRNPAB蛋白进行亲和层析纯化之后免疫Balb/c小鼠,利用细胞融合技术制备抗鸡hnRNPAB的单克隆抗体细胞株,最终通过间接酶联免疫吸附试验(iELISA)筛选获得1株单克隆抗体杂交瘤细胞株5H2-H1。间接免疫荧光试验(IFA)和蛋白质免疫印迹(Western blot)分析表明,5H5-H1单克隆抗体可特异性识别鸡胚成纤维细胞(CEF)表达的hnRNPAB蛋白。同时IFA和间接免疫细胞化学试验(ICA)结果还显示,除了特异性识别鸡hnRNPAB蛋白之外,5H5-H1单克隆抗体还可以与源自人、鼠、猴、牛和猪在内的5种常见哺乳动物细胞系表达的hnRNPAB发生特异性反应。

关键词：鸡异质核糖核蛋白单克隆抗体间接免疫荧光试验 Western blot分析间接免疫细胞化学试验

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猪流行性腹泻病毒S1蛋白的免疫原性评估

河南农业科学 2022年第11期51卷 127-134页

作者：陈维聪刘运超周川杰杨苏珍魏蔷柴书军张改平西北农林科技大学动物医学院陕西杨凌712100 河南省农业科学院动物免疫学重点实验室河南郑州450002 扬州大学江苏高校动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心江苏扬州225009

为了评估猪流行性腹泻病毒(PEDV)S1蛋白的免疫原性,利用果蝇胚胎S2细胞表达重组S1蛋白,将纯化的S1蛋白免疫4周龄昆明小鼠,收集免疫血清及脾淋巴细胞,通过ELISA、病毒中和试验和流式细胞术等方法分析表达的重组S1蛋白的免疫原性。结果显... 详细信息

为了评估猪流行性腹泻病毒(PEDV)S1蛋白的免疫原性,利用果蝇胚胎S2细胞表达重组S1蛋白,将纯化的S1蛋白免疫4周龄昆明小鼠,收集免疫血清及脾淋巴细胞,通过ELISA、病毒中和试验和流式细胞术等方法分析表达的重组S1蛋白的免疫原性。结果显示,与对照组(PBS)相比,重组PEDV S1蛋白免疫组小鼠血清中特异性IgG抗体水平显著提升;二免后14 d,果蝇细胞重组PEDV S1蛋白免疫组小鼠的中和抗体效价达到1∶320;免疫后小鼠脾脏淋巴细胞具有更强的增殖能力;外周血CD3^(+)T细胞百分比显著增加,CD4^(+)/CD8^(+)T细胞比值高于对照组;小鼠血清中IL-4、IFN-γ水平显著上升。综上,成功表达了重组PEDV S1蛋白,其可以诱导小鼠产生高效价的中和抗体,促进细胞免疫应答。

关键词：猪流行性腹泻病毒 S1蛋白果蝇胚胎S2细胞免疫原性中和性抗体

禽腺病毒血清4型Fiber2 Head蛋白表达及其单克隆抗体筛选

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中国动物传染病学报 2022年

作者：朱荣芳金前跃柴永笑陈晓李伟郭振华卢清侠柴书军邢云瑞季辉吕凤霞邢广旭张改平西北农林科技大学动物医学院江苏高校动物重要疾病与人兽共患病防控协同创新中心河南省农业科学院动物免疫学重点实验室河南农业大学生命科学学院河南牧翔动物药业有限公司河南省农业科学院中英禽病国际研究中心江苏南京农大动物药业有限公司

为制备抗禽腺病毒血清4型(FAdV4) Fiber2 Head蛋白的特异性单克隆抗体(mAb），本研究将纤突蛋白(Fiber2)截短，并利用大肠杆菌系统进行原核表达。将纯化的蛋白免疫BALB/c小鼠，细胞融合后通过间接ELISA及免疫过氧化物酶单层细胞试验(IP...

为制备抗禽腺病毒血清4型(FAdV4) Fiber2 Head蛋白的特异性单克隆抗体(mAb），本研究将纤突蛋白(Fiber2)截短，并利用大肠杆菌系统进行原核表达。将纯化的蛋白免疫BALB/c小鼠，细胞融合后通过间接ELISA及免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)筛选单克隆抗体，并对单克隆抗体进行反应性测定、效价测定以及亚型鉴定。结果显示，Fiber2 Head蛋白在大肠杆菌中成功表达，且具有良好的生物活性，成功获得8株单克隆细胞株分别命名为5A5、1D5、7C9、4E5、3A11、5E11、9D7、6E3，均可分泌特异性识别Fiber2 Head蛋白及FAdV4的单克隆抗体。综上，本研究成功制备了能与Fiber2 Head蛋白和FAdV4病毒特异性反应的单克隆抗体，为FAdV4抗原和抗体检测试剂的研发奠定了基础。

关键词：

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鸡LTBP1蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

河南农业科学 2020年第12期49卷 144-150页

作者：滕蔓迟佳琦柴书军罗俊河南省农业科学院农业部动物免疫学重点实验室/河南省动物免疫学重点实验室河南郑州450002 河南省农业科学院中英禽病国际研究中心河南郑州450002 北京中医药大学东方医院北京100078 河南科技大学动物科技学院/动物疫病与公共卫生重点实验室河南洛阳471003

为了研究鸡潜在转化生长因子结合蛋白(LTBP1)功能,构建原核表达重组质粒pET-30a-LTBP1,转化E.coli BL21感受态细胞并经IPTG诱导进行表达。对以包涵体形式表达的LTBP1蛋白进行变复性和亲和层析纯化,然后免疫Balb/C小鼠,利用细胞融合技术... 详细信息

为了研究鸡潜在转化生长因子结合蛋白(LTBP1)功能,构建原核表达重组质粒pET-30a-LTBP1,转化E.coli BL21感受态细胞并经IPTG诱导进行表达。对以包涵体形式表达的LTBP1蛋白进行变复性和亲和层析纯化,然后免疫Balb/C小鼠,利用细胞融合技术建立单克隆抗体杂交瘤细胞株,制备抗鸡LTBP1的单克隆抗体。通过间接酶联免疫吸附试验(iELISA)筛选,获得了2株杂交瘤细胞株3C11-A9和2B1-G7。以效价较高的3C11-A9制备单克隆抗体腹水,间接免疫荧光试验(IFA)和蛋白免疫印迹(Western blot)试验结果均表明,单克隆抗体3C11-A9可特异性识别鸡源细胞CEF和DF-1表达的LTBP1蛋白,同时IFA结果还显示,3C11-A9单克隆抗体腹水可与包括人、猴、猪和鼠在内的8种常见哺乳动物细胞发生特异性染色。综上,成功制备了抗鸡LTBP1单克隆抗体,且具有多物种广谱识别特性。

关键词：鸡 LTBP1 原核表达单克隆抗体间接免疫荧光试验蛋白免疫印迹试验