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再生基因4(REG4)真核表达载体的构建及其蛋白在HEK293T细胞中的表达、纯化

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现代检验医学杂志 2023年第4期38卷 35-39页

作者：徐杨杜惠芬李克生柴丹丹石晓玲连晓雯张学良甘肃省医学科学研究院医学生物技术研究中心兰州730050 甘肃省肿瘤医院消化肿瘤内科兰州730050

目的构建再生基因4(regenerating gene 4,REG4)的真核表达载体,转染人胚肾细胞293T(human embryonic kidney 293T cells,HEK 293T),获得重组人再生胰岛衍生蛋白IV(regenerating islet-derived protein IV,Reg IV)。方法根据NCBI数据库REG4基因序列进行基因优化、合成,将其克隆至pCDNA3.4载体并进行双酶切和测序鉴定,通过转染试剂聚乙烯亚胺(polyethylenimine,PEI)将pCDNA3.4-REG4质粒瞬时转染至HEK 293T细胞(实验组),同时以pEGFP-C1质粒作为转染对照组,未转染重组质粒的HEK 293T细胞作为空白对照组。荧光显微镜观察转染对照组转染效率,分别收集实验组及空白对照组细胞和细胞培养液上清,十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)与免疫印迹试验(Western-Blot,WB)检测Reg IV蛋白表达水平。通过镍柱及丙烯葡聚糖凝胶S-400(Sephacryl S-400)柱进行蛋白纯化,SDS-PAGE及WB对纯化后重组蛋白进行鉴定。结果经测序和双酶切鉴定,重组质粒pCDNA3.4-REG4构建成功。转染对照组(pEGFP-C1质粒)荧光显微镜观察结果显示转染效率约50%,表明转染成功。WB结果显示仅在实验组(pCDNA3.4-REG4质粒)的细胞中检测到RegIV蛋白。镍柱纯化时目的蛋白无法与镍柱填料有效结合,SephacrylS-400凝胶柱层析纯化获得了此重组蛋白。结论成功构建了REG4基因真核表达载体并在HEK 293T细胞中成功表达,为深入研究Reg IV蛋白的作用机理及开发潜在的抗癌靶向药物奠定了基础。

关键词：再生基因4 再生胰岛衍生蛋白Ⅳ 真核表达人胚肾细胞293T 瞬时转染蛋白纯化

血清和尿液β2-MG检测对肿瘤化疗患者早期肾损伤的诊断意义

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甘肃医药 2018年第1期37卷 15-17页

作者：杜惠芬徐杨李克生江秀娟柴丹丹张瑞君连晓雯甘肃省医学科学研究院甘肃兰州730050 甘肃省肿瘤医院甘肃兰州730050

目的:评价β2-MG检测在肿瘤化疗患者早期肾损伤诊断的临床意义。方法:用β2-MG金标检测试剂盒对125份肿瘤化疗患者血清样本、113份肿瘤化疗患者尿液样本,67份非化疗肿瘤患者血清样本和63份非化疗肿瘤患者尿液样本进行检测,同时采用胶乳... 详细信息

目的:评价β2-MG检测在肿瘤化疗患者早期肾损伤诊断的临床意义。方法:用β2-MG金标检测试剂盒对125份肿瘤化疗患者血清样本、113份肿瘤化疗患者尿液样本,67份非化疗肿瘤患者血清样本和63份非化疗肿瘤患者尿液样本进行检测,同时采用胶乳增加免疫比浊法检测血清Cys C,用酶法检测血清样本Scr和BUN,超正常值参考范围按阳性结果统计。结果:化疗组和非化疗组患者血清β2-MG阳性率比较差异无统计学意义(P>0.05),两组患者血清Cys C、BUN和Scr阳性率比较差异无统计学意义(P>0.05);化疗组和非化疗组患者尿β2-MG阳性率比较差异有统计学意义(P0.05)。结论:尿液β2-MG检测对化疗肿瘤患者早期肾损伤有一定诊断价值,且较血清Cys C、BUN和Scr检测敏感。

关键词：茁2-微球蛋白早期肾损伤诊断

WT1、PAX2及ER在不典型增生内膜及Ⅰ型子宫内膜癌中表达的相关性

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甘肃医药 2021年第9期40卷 807-809页

作者：古扎努尔·尼牙孜李波柴丹丹李艳红郭蓉秦天裕甘肃省肿瘤医院甘肃兰州730050 甘肃省医学科学研究院甘肃兰州730050

目的:分析WT1、PAX2及ER在不典型增生内膜及Ⅰ型子宫内膜癌中的表达关系。方法:采用免疫组化法检测41例Ⅰ型子宫内膜癌、20例Ⅱ型子宫内膜癌、35例子宫内膜增生、19例子宫内膜不典型增生及17例正常子宫内膜中WT1、PAX2和ER的表达情况。... 详细信息

目的:分析WT1、PAX2及ER在不典型增生内膜及Ⅰ型子宫内膜癌中的表达关系。方法:采用免疫组化法检测41例Ⅰ型子宫内膜癌、20例Ⅱ型子宫内膜癌、35例子宫内膜增生、19例子宫内膜不典型增生及17例正常子宫内膜中WT1、PAX2和ER的表达情况。结果:①WT1在Ⅰ型子宫内膜癌的表达明显高于正常增殖期子宫内膜、增生性病变子宫内膜及Ⅱ型子宫内膜癌(P<0.05)。②WT1与PAX2在不典型增生内膜及Ⅰ型子宫内膜癌中的表达正相关(P<0.05)。③ER阳性的不典型增生及Ⅰ型子宫内膜癌患者的WT1及PAX2表达明显高于ER阴性患者(P<0.05),且二者的表达正相关(P<0.05)。结论:WT1及PAX2在Ⅰ型子宫内膜癌的发病机制中扮演着重要的角色,并且可能作为同一信号通路中的两个重要细胞因子被激活而发挥致癌作用。

关键词： WT1 PAX2 ER 不典型增生 Ⅰ型子宫内膜癌

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人胱抑素C金标快速检测试剂条的研制

中国卫生检验杂志 2016年第24期26卷 3517-3519页

作者：杜惠芬李克生李光迪江秀娟徐杨柴丹丹甘肃省医学科学研究院医学生物技术研究中心甘肃兰州730050 兰州大学第二医院检验医学中心甘肃兰州730050 甘肃省肿瘤医院检验输血科甘肃兰州730050

目的研制一种胱抑素C(Cys-C)金标快速检测试剂条。方法确定早期肾损伤的血清Cys-C cut-off值,以0.9μg/ml为试剂条最低检测值。用柠檬酸三钠还原法制备胶体金,用胶体标记Cys-C单克隆抗体并固化于玻璃纤维素垫,用Cys-C单克隆抗体和羊抗鼠... 详细信息

目的研制一种胱抑素C(Cys-C)金标快速检测试剂条。方法确定早期肾损伤的血清Cys-C cut-off值,以0.9μg/ml为试剂条最低检测值。用柠檬酸三钠还原法制备胶体金,用胶体标记Cys-C单克隆抗体并固化于玻璃纤维素垫,用Cys-C单克隆抗体和羊抗鼠Ig G抗体包被硝酸纤维素膜,制备Cys-C免疫层析金标检测试剂条。用试剂条检测175份糖尿病患者血清样本、418份肾病患者血清样本和102份健康人血清样本,对试剂条的特异性、敏感性、符合性及稳定性进行测试。结果试剂盒的特异度达到93.33%,糖尿病患者血清Cys-C阳性率为77.71%,肾病患者血清Cys-C阳性率为85.88%,两类患者血清Cys-C阳性率均显著高于健康人群,差异有统计学意义(P<0.01)。重复性和稳定性试验结果显示试剂检测结果的重复性好,37℃条件下12 d质量稳定。结论 Cys-C金标检测试剂条是一种特异性强、敏感性高、快速、简便,适宜普及推广的肾功能检测试剂。

关键词：胱抑素C 金标检测试剂条研制

人胱蛋白酶抑制剂C的原核表达及其免疫反应性研究

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现代检验医学杂志 2014年第1期29卷 32-34,37页

作者：杜惠芬付宝权李克生连晓雯王春芽徐杨柴丹丹甘肃省医学科学研究院兰州730050 中国农业科学院兰州兽医研究所兰州730046

目的获得具有免疫反应性的人胱蛋白酶抑制剂C（Cysc）重组蛋白。方法从Hela细胞提取总RNA，采用RTPCR扩增获得人CysC基因片段，与质粒pET30a连接构建重组表达载体，转化大肠埃希菌***21（DE3）并加入IPTG诱导表达，表达产物经凝胶层析... 详细信息

目的获得具有免疫反应性的人胱蛋白酶抑制剂C（Cysc）重组蛋白。方法从Hela细胞提取总RNA，采用RTPCR扩增获得人CysC基因片段，与质粒pET30a连接构建重组表达载体，转化大肠埃希菌***21（DE3）并加入IPTG诱导表达，表达产物经凝胶层析复性和亲和层析纯化后，用间接ELISA检测纯化后的CysC重组蛋白对重组CysC免疫小鼠血清的免疫反应性。结果成功构建了重组表达载体pET30a—CysC，诱导表达出约19ku的重组蛋白，经复性纯化后获得纯度达90％以上的目的蛋白，与重组CysC免疫小鼠血清具有良好的免疫反应性。结论在原核系统成功表达了人CysC重组蛋白，而且具有良好的免疫反应性。

关键词：人胱蛋白酶抑制剂C 原核表达复性免疫反应性

再生基因4(RegⅣ)的原核表达、蛋白结构复性及纯化

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甘肃医药 2020年第7期39卷 577-579,588页

作者：徐杨张学良杜惠芬柴丹丹连晓雯张瑞君李克生甘肃省医学科学研究院甘肃兰州730050 甘肃省肿瘤医院甘肃兰州750050

目的:构建再生基因4(Reg Ⅳ)的原核表达载体,获得重组人Reg Ⅳ蛋白。方法:将已构建好的pEGFP-C1-Reg Ⅳ质粒进行酶切纯化获得目的基因,并构建到pET-30a原核表达载体上,经测序鉴定后将序列正确的重组质粒转化*** BL21(DE3),IPTG诱导表达,... 详细信息

目的:构建再生基因4(Reg Ⅳ)的原核表达载体,获得重组人Reg Ⅳ蛋白。方法:将已构建好的pEGFP-C1-Reg Ⅳ质粒进行酶切纯化获得目的基因,并构建到pET-30a原核表达载体上,经测序鉴定后将序列正确的重组质粒转化*** BL21(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE凝胶电泳鉴定,并用凝胶层析对表达产物进行复性纯化。结果:构建了pET-30a-Reg Ⅳ原核表达重组质粒,IPTG诱导表达出约22KD的重组蛋白,表达产物经复性纯化后获得纯度较高的目的蛋白。结论:成功构建了Reg Ⅳ原核表达载体,并成功表达了重组人Reg Ⅳ蛋白。

关键词：再生基因4 原核表达纯化

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环保动画如何运用到创新实践教学体系中

经营管理者 2016年第9期 365-365页

作者：柴丹丹沈宇峰辽宁科技大学

文章主要内容是探讨环保动画是如何运用到实践创新体系教学中,随着社会的发展,科技的进步,城市化进程不断的加快,人类对能源的需求也在急速的增加,人类不合理的开发、利用自然资源和兴建工程项目而引起的生态环境的退化以及由此衍生的... 详细信息

文章主要内容是探讨环保动画是如何运用到实践创新体系教学中,随着社会的发展,科技的进步,城市化进程不断的加快,人类对能源的需求也在急速的增加,人类不合理的开发、利用自然资源和兴建工程项目而引起的生态环境的退化以及由此衍生的有关环境效应,从而对人们的生活产生了严重的影响,作为一名当代大学生,我希望用动画的语言来唤起人们对环保的重视以及对环境的爱护。现在社会对大学生的要求越来越高,我们必须在创新型实践教学当中学习,把自己培养成应用型人才。

关键词：环保动画创新型实践教学

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同方期刊数据库

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新媒体的哲学内涵及理论根源

新闻战线 2015年第11X期 141-142页

作者：柴丹山西工商学院

随着新媒体的发展,我们应清晰地认识到新媒体所创造的媒介化社会环境,在悄然无息地影响着受众的定位和价值取向。它的存在给受众的生活、工作和交往方式都带来了巨大的变革,在促进社会发展的同时,也带来了更为先进和科学的生活理念。可... 详细信息

随着新媒体的发展,我们应清晰地认识到新媒体所创造的媒介化社会环境,在悄然无息地影响着受众的定位和价值取向。它的存在给受众的生活、工作和交往方式都带来了巨大的变革,在促进社会发展的同时,也带来了更为先进和科学的生活理念。可以说,新媒体的存在和发展对促进整个社会的文明发展起到了重要的作用。

关键词：新媒体哲学内涵理论根源

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外商投资企业备案制度研究

外商投资企业备案制度研究

作者：柴丹山西大学

学位级别：硕士

我国经济在不断发展,来我国投资的外商投资企业的户数在逐年增长,这些企业创造了许多就业机会,吸纳了大量的劳动力,同时带来了大量的资金、技术,这些都加速了我国经济的增长。依据这个情况,继续扩大开放,改善投资环境,完善我国外商投资... 详细信息

我国经济在不断发展,来我国投资的外商投资企业的户数在逐年增长,这些企业创造了许多就业机会,吸纳了大量的劳动力,同时带来了大量的资金、技术,这些都加速了我国经济的增长。依据这个情况,继续扩大开放,改善投资环境,完善我国外商投资企业法律制度,为外商投资企业提供较好营商环境,保障其合法权益,就显得很重要。2016年全国人大常委会通过《关于修改等四部法律的决定》(以下简称决定),将不涉及国家规定实施准入特别管理措施的外商投资企业设立及变更事项,由审批改为备案管理。《决定》降低了外资企业市场准入门槛,减少了外资准入行政审批程序,充分体现了我国政府在朝着简政放权、优化服务的方向改革,有利于改善我国的投资环境,为外商投资企业在我国继续扩大发展提供便利。但是,备案管理制度存在着一些问题,例如制度制定不严密,备案标准不统一,这些都给外商投资企业带来了很多的不便。虽然《外商投资企业设立及变更备案管理暂行办法》(以下简称暂行办法)第三章规定了监督管理制度,可是根据第四章的法律责任,第三章的监督管理制度并不能跟得上、管得上外商投资企业。另外,我国现在并没有出台备案管理权限下放的相关制度,而实践中出现一些备案机构将备案管理权限下放至市级商务部门,一些备案机构将备案管理工作权限下放至县(区)商务主管部门,也有一些地区没有下放备案管理权限,各地备案管理权限下放各异的情形,容易给外商投资企业带来很多的不便,需要相关部门及时出台相应的规定来指导。鉴于此,笔者通过对外商投资企业备案制度实施的相关情况进行调研,在掌握了大量一手资料的基础上,使用数据统计、实证分析等方法,归纳出外商投资企业备案制度优点,并分析外商投资企业备案制度存在的问题,积极探求相关的对策,力图为外商投资企业管理制度的完善做出一点贡献。本文分四部分进行阐述:第一部分:概述了外商投资企业备案制度,通过对外商投资企业备案制度基本理论的介绍,从备案的概念入手,对外商投资企业备案制度的概念、性质进行界定,揭示出外商投资企业备案制度对审批制度改革的重要性。第二部分:简述外商投资企业备案制度的实施情况,分析外商投资企业备案制度的优点。本部分通过对我国外商投资企业备案制度实施的总体情况和山西省实施的相关情况进行调研,并且对搜集到的数据进行分析、整理,阐述了自2016年10月1日以来我国总体实施情况和山西省、浙江省海宁市、浙江省嘉善县等地区的外商投资企业设立、变更备案的相关情况,并归纳出这个制度在实施过程中所体现出来的优点。第三部分:分析外商投资企业备案制度存在的问题。本部分从制度制定不严密备案标准不统一、缺乏备案管理权限下放标准、中国的自然人不能成为投资主体及监管跟不上管不住等四方面,阐述并分析在备案制度实施过程中存在的问题。第四部分:提出外商投资企业备案制度的法制对策。笔者根据前文的论述,提出大胆设想,试图通过完善外资企业备案工作实施细则、明确备案权限下放的标准、允许中国的自然人成为外商投资企业的投资主体、完善外资企业监管制度,让监管发挥其应有的作用等四个方面,来完善外资企业备案制度。

关键词：备案制度简政放权监督管理