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Streptomyces hygroscopicus产谷氨酰胺转胺酶摇瓶发酵条件的优化

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食品与发酵工业 2004年第2期30卷 27-32页

作者：柏映国燕国梁堵国成陈坚江南大学生物工程学院环境生物技术研究室无锡214036

介绍了吸水链霉菌 (Streptomyceshygroscopicus)WSH0 3 -1 3的筛选过程 ,重点考察了在摇瓶条件下 ,不同碳、氮源对吸水链霉菌生长和产酶的影响 ,利用正交实验 ,确定了复合碳、氮源的浓度 ,并对种龄、接种量、初始 pH值、培养温度和培养... 详细信息

介绍了吸水链霉菌 (Streptomyceshygroscopicus)WSH0 3 -1 3的筛选过程 ,重点考察了在摇瓶条件下 ,不同碳、氮源对吸水链霉菌生长和产酶的影响 ,利用正交实验 ,确定了复合碳、氮源的浓度 ,并对种龄、接种量、初始 pH值、培养温度和培养时间等条件进行了研究。通过对发酵过程的优化 ,酶活达到 4 46u/mL ,比初始条件下提高了 3 0 9倍。

关键词：菌种筛选微生物谷氨酰胺转胺酶优化分批发酵 Streptomyces hygroscopicus

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高产谷氨酸脱羧酶的菌株筛选及鉴定

饲料工业 2021年第19期42卷 49-55页

作者：孙磊周成张琇孟昆柏映国涂涛中国农业科学院北京畜牧兽医研究所动物营养学国家重点实验室北京100193 北方民族大学生物科学与工程学院宁夏特殊生境微生物资源开发与利用重点实验室宁夏银川750021 中国农业科学院饲料研究所北京100081

γ-氨基丁酸作为一种新型饲料添加剂,助推畜牧养殖业绿色健康发展。谷氨酸脱羧酶利用磷酸吡哆醛为辅因子将L-谷氨酸脱羧生成γ-氨基丁酸的转化方法得到了广泛关注。本研究利用平板活性筛选结合摇瓶发酵复筛的方法,从宁夏沙漠土样中筛选... 详细信息

γ-氨基丁酸作为一种新型饲料添加剂,助推畜牧养殖业绿色健康发展。谷氨酸脱羧酶利用磷酸吡哆醛为辅因子将L-谷氨酸脱羧生成γ-氨基丁酸的转化方法得到了广泛关注。本研究利用平板活性筛选结合摇瓶发酵复筛的方法,从宁夏沙漠土样中筛选获得了3株具有较高谷氨酸脱羧酶活性的菌株。通过对菌落形态、16S rDNA序列比对和系统发育树分析,3株菌初步鉴定为芽孢杆菌属(Bacillus sp.),命名为Bacillus sp.Z1、Bacillus sp.Z11和Bacillus sp.Z20,保藏于中国农业微生物菌种保存中心。通过全基因组测序分析,发现三株菌分别含有一个谷氨酸脱羧酶编码基因。三条基因序列长度均为1470 bp,序列相似性为94.5%~97.3%,编码489个氨基酸和1个终止密码子,理论分子量55 ku。

关键词：芽孢杆菌谷氨酸脱羧酶 γ-氨基丁酸筛选鉴定

一种高温酸性α-淀粉酶基因的高效表达和表达产物分析

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高技术通讯 2005年第11期15卷 63-68页

作者：袁铁铮姚斌罗会颖王亚茹柏映国伍宁丰范云六中国农业科学院饲料研究所北京100081 中国农业科学院生物技术研究所北京100081

一种高温酸性α-淀粉酶基因经密码子优化后在巴斯德毕赤酵母中得到了高效表达,表达的重组α-淀粉酶rBD5063具有α-淀粉酶的活性,表达量达到60mg/L.对rBD5063进行了纯化并对多组分的表达产物进行了研究.rBD5063作用最适pH值为5.0,在pH3.5... 详细信息

一种高温酸性α-淀粉酶基因经密码子优化后在巴斯德毕赤酵母中得到了高效表达,表达的重组α-淀粉酶rBD5063具有α-淀粉酶的活性,表达量达到60mg/L.对rBD5063进行了纯化并对多组分的表达产物进行了研究.rBD5063作用最适pH值为5.0,在pH3.5～10.0范围内酶活性保留50%以上,最适温度在105～110℃之间,在90℃下酶活性半衰期约30min.低浓度Ca2+对激活rBD5063活性和维持稳定性是必需的,高浓度对活性会产生轻微抑制作用,Mg2+、SDS和Trition X-100都能够部分抑制rBD5063活性,Cu2+和EDTA严重抑制rBD5063活性.表达产物水解可溶性淀粉主要产物是单糖和低聚寡糖.表达产物包括分子量分别是62、56、44kD的3种活性组分,在通常情况下主要以大分子量活性多聚体的形式存在.重组α-淀粉酶rBD5063不存在N-连接的糖基化,但是存在O-连接的糖基化现象,O-连接对rBD5063的热稳定性和最适温度没有显著影响.

关键词：高温酸性α-淀粉酶巴斯德毕赤酵母基因表达多组分表达产物

来源于柠檬酸杆菌的高比活植酸酶基因在毕赤酵母中的高效表达

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微生物学报 2006年第6期46卷 945-950页

作者：黄火清罗会颖柏映国王亚茹姚斌孟昆袁铁铮杨培龙中国农业科学院饲料研究所北京100081

柠檬酸杆菌(Citrobacterbraakii)来源的植酸酶是目前报道的比活最高的植酸酶。按照毕赤酵母(Pichiapastoris)对密码子的选择偏向性,对来源于柠檬酸杆菌的高比活植酸酶基因AppA进行了密码子优化改造。改造后的基因AppA(m)按正确的阅读框... 详细信息

柠檬酸杆菌(Citrobacterbraakii)来源的植酸酶是目前报道的比活最高的植酸酶。按照毕赤酵母(Pichiapastoris)对密码子的选择偏向性,对来源于柠檬酸杆菌的高比活植酸酶基因AppA进行了密码子优化改造。改造后的基因AppA(m)按正确的阅读框架融合到毕赤酵母表达载体pPIC9的α-因子信号肽编码序列3′端,通过电击转化得到重组转化子。通过PCR验证,AppA(m)已整合在酵母染色体上。SDS-PAGE分析和表达产物的研究表明,植酸酶得到了高效分泌表达,在5L发酵罐中植酸酶蛋白表达量达到3·2mg/mL发酵液,发酵效价达到每毫升发酵液1·4×107IU以上,高于目前报道的各种植酸酶基因工程菌株的发酵效价。

关键词：高比活植酸酶基因改造毕赤酵母高效表达

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谷氨酸脱羧酶结构及催化机制的研究概述

微生物学通报 2020年第7期47卷 2236-2244页

作者：孙磊王苑柏映国罗会颖姚斌涂涛中国农业科学院饲料研究所农业农村部饲料生物技术重点实验室北京100081

谷氨酸脱羧酶(glutamate decarboxylase,GAD)是一种磷酸吡哆醛(pyridoxal-5′-phosphate,PLP)依赖性酶,广泛存在于自然界的动植物和微生物中,在酸性环境下发生结构变化,不可逆地催化L-谷氨酸或谷氨酸盐α-脱羧生成γ-氨基丁酸(γ-aminob... 详细信息

谷氨酸脱羧酶(glutamate decarboxylase,GAD)是一种磷酸吡哆醛(pyridoxal-5′-phosphate,PLP)依赖性酶,广泛存在于自然界的动植物和微生物中,在酸性环境下发生结构变化,不可逆地催化L-谷氨酸或谷氨酸盐α-脱羧生成γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)。γ-氨基丁酸在人体中作为一种抑制性神经递质,具有重要的生理功能,可以被广泛应用于食品和制药工业中。本文就谷氨酸脱羧酶结构及催化机制的研究进展进行概述。

关键词：谷氨酸脱羧酶 γ-氨基丁酸催化机制晶体结构

复合酶制剂对肉羊生长性能、屠宰性能、肉品质以及消化代谢的影响

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动物营养学报 2022年第7期34卷 4530-4539页

作者：成思源马涛杨东王文义柏映国马友记刁其玉甘肃农业大学动物科学技术学院兰州730070 中国农业科学院饲料研究所农业农村部饲料生物技术重点实验室北京100081 巴彦淖尔市农牧业科学研究所巴彦淖尔015000 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所动物营养学国家重点实验室北京100193

本试验旨在研究饲粮中添加不同剂量复合酶制剂对肉羊生长性能、屠宰性能、肉品质和消化代谢的影响。选取体重在(21.0±0.2)kg的寒杂羊公羔72只,随机分为4组,每组3个重复,每个重复6只。4组羔羊分别饲喂在基础饲粮中添加0(对照组)、0.5(M1... 详细信息

本试验旨在研究饲粮中添加不同剂量复合酶制剂对肉羊生长性能、屠宰性能、肉品质和消化代谢的影响。选取体重在(21.0±0.2)kg的寒杂羊公羔72只,随机分为4组,每组3个重复,每个重复6只。4组羔羊分别饲喂在基础饲粮中添加0(对照组)、0.5(M1组)、1.0(M2组)和2.0 kg/t(M3组)复合酶制剂(蛋白酶∶脂肪酶∶淀粉酶=1∶1∶1)的试验饲粮。预试期10 d,正试期90 d。每天记录1次采食量,每隔30 d进行1次称重;正试期第70~80天采用全收粪尿法进行消化代谢试验;正试期结束后,每组选取8只羊进行屠宰,测定其屠宰性能、肉品质指标。结果显示:1)各组全期平均日增重、干物质采食量和料重比差异不显著(P>0.05)。2)M3组胴体重显著高于M1组、M2组和对照组(P0.05)。3)各组背最长肌肉色、滴水损失以及pH0 h、ΔpH无显著差异(P>0.05);M2组和M3组羊只背最长肌的pH24 h显著高于对照组(P0.05)。综上所述,本试验条件下,在肉羊生长育肥饲粮中添加2.0 kg/t的复合酶制剂(蛋白酶∶脂肪酶∶淀粉酶=1∶1∶1)可改善肉羊的屠宰性能、肉品质以及养分表观消化率。

关键词：肉羊复合酶制剂生长性能屠宰性能肉品质养分表观消化率

毕赤酵母表达的嗜热蓝状菌β-葡萄糖苷酶N-糖基化修饰的作用与功能

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微生物学报 2019年第1期59卷 37-47页

作者：李新新柏映国华晨马锐石鹏君罗会颖姚斌中国农业科学院饲料研究所北京100081

【目的】研究N-糖基化对来源于嗜热蓝状菌β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase,Bgl3A)的酶学性质影响。【方法】采用定点突变技术构建了3个去N-糖基化的突变体T44A、S228A、S299A,并分别在毕赤酵母GS115中表达纯化。【结果】与野生型Bgl3A相比... 详细信息

【目的】研究N-糖基化对来源于嗜热蓝状菌β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase,Bgl3A)的酶学性质影响。【方法】采用定点突变技术构建了3个去N-糖基化的突变体T44A、S228A、S299A,并分别在毕赤酵母GS115中表达纯化。【结果】与野生型Bgl3A相比,突变体S228A分泌蛋白产量极低,仅能微量检测到p NPG活性;突变体T44A和S299A的最适pH和最适温度没有改变,分别为4.0和75°C,但二者的T_m值和70°C下的热稳定性都明显优于野生型。以p NPG为底物时,突变体S299A和T44A的催化效率分别降低了14.5%和70.0%;以纤维二糖为底物时,T44A的催化效率基本不变,而S299A的催化效率提高了1.1倍。【结论】Bgl3A不同位点的N-糖基化修饰对酶的分泌和酶学性质的影响具有明显差异。其中,N226位的N-糖基化在维持酶的表达和功能方面至关重要,而去除N297位点的N-糖基化可以提高酶的热稳定性及对纤维二糖的催化效率。

关键词：嗜热蓝状菌 β-葡萄糖苷酶 N-糖基化热稳定性催化效率

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产肌醇毕赤酵母细胞工厂的优化

微生物学通报 2023年第9期50卷 3731-3746页

作者：朱宏宇王晓璐刘亚君涂涛柏映国张杰中国农业科学院北京畜牧兽医研究所动物营养学国家重点实验室北京100193 中国科学院青岛生物能源与过程研究所山东青岛266101

【背景】肌醇是一种B族维生素,广泛应用于食品、医药、饲料等领域。微生物发酵法是最具前景的肌醇生产方法,但使用大肠杆菌生产的肌醇在食品及医药领域中的使用受到限制。毕赤酵母作为生物安全菌株是工业上生产异源蛋白的良好宿主,其本... 详细信息

【背景】肌醇是一种B族维生素,广泛应用于食品、医药、饲料等领域。微生物发酵法是最具前景的肌醇生产方法,但使用大肠杆菌生产的肌醇在食品及医药领域中的使用受到限制。毕赤酵母作为生物安全菌株是工业上生产异源蛋白的良好宿主,其本身含有天然的肌醇合成途径,具有被改造成为高效生产肌醇细胞工厂的潜力。【目的】通过代谢工程改造毕赤酵母工程菌株,降低副产物的生成并提高肌醇的产量。【方法】以实验室前期构建的产肌醇毕赤酵母工程菌株为出发菌株,确定副产物阿拉伯糖醇、核糖醇和甘露糖合成相关基因。通过关键基因敲除、发酵液中葡萄糖浓度控制降低副产物的产量。通过过表达甘油转运蛋白、甘油激酶和甘油-3-磷酸脱氢酶基因实现产肌醇毕赤酵母对甘油和葡萄糖的共利用,得到重组菌Z10。经过发酵条件优化,进一步提高Z10的肌醇产量。【结果】在最优条件下,重组菌Z10的肌醇产量达到36.7 g/L,是目前酵母类细胞工厂生产肌醇的最高值,副产物总产量与出发菌株相比降低了63.1%。【结论】在毕赤酵母中建立了降低阿拉伯糖醇、核糖醇和甘露糖合成的有效策略,并通过甘油、葡萄糖共利用及相对应的发酵条件优化提高了肌醇产量,为肌醇及其他高价值生物活性物质在毕赤酵母中的高效生产提供了重要参考。

关键词：肌醇毕赤酵母细胞工厂代谢工程高密度发酵

新型高产β-胡萝卜素巴斯德毕赤酵母表达宿主菌的构建

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中国农业科技导报 2018年第2期20卷 48-55页

作者：张祺珮李雅楠孟昆柏映国黄火清罗会颖中国农业科学院饲料研究所北京100081 广州医科大学生命科学学院广州510006

分泌型巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)作为高效表达宿主菌已被广泛应用,通过高密度培养工艺用于多种酶制剂(如植酸酶、甘露聚糖酶等)的规模生产。然而,在生产过程中产生的大量菌体利用率低,多数被废弃掩埋,或只能作为廉价的菌体蛋白,... 详细信息

分泌型巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)作为高效表达宿主菌已被广泛应用,通过高密度培养工艺用于多种酶制剂(如植酸酶、甘露聚糖酶等)的规模生产。然而,在生产过程中产生的大量菌体利用率低,多数被废弃掩埋,或只能作为廉价的菌体蛋白,造成大量的资源浪费。为提高酵母发酵副产物的利用率,向毕赤酵母宿主菌GS115中导入来源于红发夫酵母(Xanthophyllomyces dendrorhous)β-胡萝卜素合成途径中的关键基因(idi、crt E、crt YB和crt I),获得了胞内高产β-胡萝卜素的工程菌株*** GS115-CARO,实现工业生产中的菌体蛋白的高附加值利用。同时以来源于嗜热篮状菌(Talaromyces leycettanus JCM12802)的甘露聚糖酶基因Man5T作为参照,验证了宿主菌*** GS115和*** GS115-CARO在表达外源蛋白的差异。结果表明:Man5T基因的导入并没有影响,两株宿主菌的甘露聚糖酶表达量(分别为280 U/m L和286 U/m L,P>0.05),但宿主菌*** GS115-CARO胞内β-胡萝卜素产量高达到31.27 mg/g(菌体干重dry cell weight,dcw)。构建的工程菌株不仅可以实现外源酶制剂的高效表达,有效地提升酵母菌体资源的利用价值,同时也在一定程度上了解决了发酵菌体对环境的污染问题。

关键词：毕赤酵母红发夫酵母 β-胡萝卜素甘露聚糖酶