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山羊地方性鼻内肿瘤病毒(ENTV-2)HRM检测方法的建立与应用

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农业生物技术学报 2022年第12期30卷 2456-2463页

作者：张靖鹏江锦秀林裕胜游伟刘道泉毛坤明江斌胡奇林福建省农业科学院畜牧兽医研究所福州市动物疫病预防控制中心福清市畜牧兽医中心

对于山羊(Capra hircus)地方性鼻内肿瘤病毒(Enzootic nasal tumor virus 2, ENTV-2)引起的羊地方性鼻内肿瘤(enzootic nasal tumor, ENT)，目前已建立了RT-PCR结合限制性内切酶鉴定ENTV的方法以及RT-PCR和qPCR等检测方法，但是内源性... 详细信息

对于山羊(Capra hircus)地方性鼻内肿瘤病毒(Enzootic nasal tumor virus 2, ENTV-2)引起的羊地方性鼻内肿瘤(enzootic nasal tumor, ENT)，目前已建立了RT-PCR结合限制性内切酶鉴定ENTV的方法以及RT-PCR和qPCR等检测方法，但是内源性逆转录病毒(endogenous retrovirus, ERVs)的存在可干扰结果的准确性。本研究通过生物信息学方法将ENTV-2与ERVs和绵羊肺腺瘤病毒(Jaagsiekte sheep retrovirus,JSRV)进行比对，寻找ENTV-2囊膜蛋白(envelope protein, env)基因的保守序列并设计1对特异性引物，通过优化反应条件而建立高分辨率熔解曲线(high resolution melting curve, HRM)检测方法。优化结果显示，最佳反应体系为：上下游引物各0.4μmol/L，模板1μL,styo9 (2.5μmol/L) 1μL,2×Premix Taq 10μL，补充ddH2O至终体积20μL；反应条件为：94℃2 min;94℃15 s,59℃15 s,72℃15 s,40个循环；之后进行熔解曲线分析。构建env基因重组阳性质粒作为标准品，对HRM方法的特异性、敏感性和重复性进行检测。结果显示，所建立的HRM方法的特异性强，与ENTV-2高度同源的ERVs无交叉反应；敏感性高，对env基因重组阳性质粒的最低检测限为82.7拷贝/μL；重复性好，批内和批间重复性试验的变异系数均<1%。对92份临床样品的阳性检出率为18.7%，与Taq Man检测方法的符合率为100%。本研究可为山羊地方性鼻内肿瘤病毒病的早期、快速检测提供技术支持。

关键词：山羊地方性鼻内肿瘤病毒(ENTV-2) 高分辨率熔解曲线(HRM) 检测方法

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福建山羊地方性鼻内肿瘤的分子流行病学调查

福建农业学报 2017年第8期32卷 837-841页

作者：江锦秀林裕胜江斌毛坤明游伟张靖鹏胡奇林福建省农业科学院畜牧兽医研究所福建福州350013 福建省福清市畜牧兽医技术服务中心福建福州350300

为明确2014-2017年福建省多地区羊发生的一种以流稀薄鼻液为主要症状疾病的病原,对该病进行流行病学调查、肿瘤组织切片观察,特异性PCR诊断以及核酸序列分析,结果显示该病在流行病学、临床症状、病理变化、组织病理变化上与国内外已报... 详细信息

为明确2014-2017年福建省多地区羊发生的一种以流稀薄鼻液为主要症状疾病的病原,对该病进行流行病学调查、肿瘤组织切片观察,特异性PCR诊断以及核酸序列分析,结果显示该病在流行病学、临床症状、病理变化、组织病理变化上与国内外已报道的病例表现基本一致,RT-PCR鉴定结果为ENTV-2,其中7个分离株与ENTV-2CHN2(分离于中国)处于同一进化树分支,1个分离株与ENTV-SC(分离于中国)、ENTVShaanxi(分离于中国)处于同一进化树分支。说明近几年福建省流行的羊肿瘤病的病原为ENTV-2,为福建省加强该病的防治奠定基础。

关键词：山羊地方性鼻内肿瘤分子流行病学

丝状支原体山羊亚种FJ-GT株的分离和鉴定

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中国农学通报 2016年第29期32卷 11-16页

作者：江锦秀林裕胜游伟江斌胡奇林福建省农业科学院畜牧兽医研究所福州350013

为明确福建省某羊场发生的疑似山羊传染性胸膜肺炎病例的病原,对肺组织的病原进行分离培养和纯化,通过生化试验和特异性PCR方法进行鉴定,用16S r RNA通用引物对分离株进行克隆测序。将分离菌株命名为FJ-GT。结果显示菌落呈典型的油煎蛋... 详细信息

为明确福建省某羊场发生的疑似山羊传染性胸膜肺炎病例的病原,对肺组织的病原进行分离培养和纯化,通过生化试验和特异性PCR方法进行鉴定,用16S r RNA通用引物对分离株进行克隆测序。将分离菌株命名为FJ-GT。结果显示菌落呈典型的油煎蛋状,中心有棕褐色突起;分离株能发酵葡萄糖,不能水解精氨酸,不分解尿素,血细胞吸附试验呈阴性,胆固醇需要试验、美兰还原反应和氯化四氮唑还原反应均呈阳性,溶血试验为β溶血;PCR结果扩增出丝状支原体山羊亚种(Mycoplasma mycoides ***,Mmc)特异大小为394 bp的目的片段;菌株16S r RNA序列与丝状支原体山羊亚种标准株PG3的序列比较,同源性为99.5%。鉴定结果表明本次分离到的支原体为丝状支原体山羊亚种。本研究首次从病原学角度证明了福建省存在由丝状支原体山羊亚种引起的羊支原体性肺炎,对福建省羊支原体性肺炎的诊断和有效防控具有重要的指导意义。

关键词：丝状支原体山羊亚种分离鉴定羊支原体性肺炎福建

山羊地方性鼻内肿瘤病毒(ENTV-2)SYBR-Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用

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福建农业学报 2021年第7期36卷 779-784页

作者：张靖鹏江锦秀林裕胜游伟刘道泉毛坤明江斌胡奇林福建省农业科学院畜牧兽医研究所福建福州350013 福州市动物疫病预防控制中心福建福州350002 福建省福清市畜牧兽医技术服务中心福建福清350300

【目的】建立一种快速、敏感的ENTV-2检测方法,用于ENT的早期诊断与流行病学调查。【方法】通过生物信息学的方法将ENTV-2与ENTV-1、ERVs、JSRV进行比对,寻找ENTV-2的保守序列并设计1对特异性引物,建立SYBR-GreenⅠ实时荧光定量PCR检测... 详细信息

【目的】建立一种快速、敏感的ENTV-2检测方法,用于ENT的早期诊断与流行病学调查。【方法】通过生物信息学的方法将ENTV-2与ENTV-1、ERVs、JSRV进行比对,寻找ENTV-2的保守序列并设计1对特异性引物,建立SYBR-GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法,对所建立的PCR反应条件进行优化,将PCR扩增产物连接T载体构建的阳性质粒作为标准品,对SYBR-Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的特异性、敏感性和重复性进行验证。【结果】建立的检测ENTV-2 qPCR方法标准曲线呈现良好的线性关系(R^(2)=0.992);该方法的特异性良好,对ENTV-2可以产生特异性扩增曲线,与ENTV-2高度同源的ERVs没有交叉反应,也无法扩增羊口疮病毒(ORFV)、绵羊肺炎支原体(Mo)、丝状支原体山羊亚种(Mmc)等常见病原;敏感性良好,最低检测限度为7.5×10^(2) copies·μL^(-1),敏感性可达常规PCR检测方法的100倍;批内、批间的变异系数CV<1%,重复性良好;对81份临床样品的阳性检出率为17.3%。【结论】建立的SYBR-Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法特异性良好,敏感性较高,重复性良好,为山羊地方性鼻内肿瘤的早期、快速检测提供了技术支持。

关键词：山羊地方性鼻内肿瘤病毒 SYBR-GreenⅠ 荧光定量PCR

2012-2013年福建省猪流行性腹泻流行病学调查

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福建畜牧兽医 2013年第6期35卷 16-18页

作者：林裕胜王隆柏吴学敏周伦江邵良平福建农林大学动物科学学院福州350002 福建省农业科学院畜牧兽医研究所福州350013

为探求2012-2013年福建省猪流行性腹泻病毒引起猪腹泻所占比例及流行情况,采用PCR方法对采自福建省62个规模猪场的128份发生腹泻病料进行猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、轮状病毒(PROV)、猪瘟病毒(CSFV)、蓝耳病病... 详细信息

为探求2012-2013年福建省猪流行性腹泻病毒引起猪腹泻所占比例及流行情况,采用PCR方法对采自福建省62个规模猪场的128份发生腹泻病料进行猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、轮状病毒(PROV)、猪瘟病毒(CSFV)、蓝耳病病毒(PRRSV)和伪狂犬病病毒(PRV)等病原调查,结果显示:检测出PEDV的阳性率为67.97%(87/128),其中PEDV与TGEV混合感染为19.53%(25/128),PEDV与PROV混合感染为3.91%(5/128),PEDV与PRV混合感染为14.84%(19/128),PEDV与PRRSV混合感染为6.25%(8/128),未检测出与CSFV混合感染。通过对流行PEDV的ORF3和M基因序列分析表明:流行PEDV毒株的2个基因片段均有出现新变异,其中1株与近年来韩国、泰国等流行毒株亲缘关系较远。

关键词：猪流行性腹泻流行病学调查

4份临床样品中羊口疮病毒F1L、B2L和GIF基因的进化分析

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福建农业学报 2022年第6期37卷 748-753页

作者：林裕胜刘维巍张龙江锦秀张靖鹏刘庆华胡奇林福建省农业科学院畜牧兽医研究所福建福州350013 福建农林大学动物科学学院福建福州350002

【目的】研究2021年福建省部分羊场羊口疮病毒(Orf virus,ORFV)分子流行病学情况。【方法】对2021年采集的4份病料经PCR鉴定ORFV阳性的临床样品分别克隆其F1L、B2L和GIF基因,将获得的克隆质粒送往测序公司进行测序,将测序拼接后的序列... 详细信息

【目的】研究2021年福建省部分羊场羊口疮病毒(Orf virus,ORFV)分子流行病学情况。【方法】对2021年采集的4份病料经PCR鉴定ORFV阳性的临床样品分别克隆其F1L、B2L和GIF基因,将获得的克隆质粒送往测序公司进行测序,将测序拼接后的序列上传至GenBank数据库中,利用生物信息学软件进行对比分析。【结果】4份临床样品中ORFV的F1L、B2L和GIF基因核苷酸序列相似性分别为98.0%~98.8%、98.4%~99.5%和97.2%~99.6%;与国内流行毒株核苷酸序列相似性分别为97.4%~99.4%、97.4%~99.9%和95.7%~99.0%;与国外流行毒株核苷酸序列相似性分别为97.5%~98.6%、97.9%~98.9%和95.6%~98.0%;与德国D1701弱毒株核苷酸序列相似性分别为96.5%~96.8%、98.0%~98.7%和96.0%~96.4%,与NZ2参考株核苷酸序列相似性分别为97.7%~98.1%、97.5%~98.1%和95.9%~96.1%。遗传进化树结果显示4份临床样品中ORFV与吉林(NA17、SY17和CL18株)、福建SJ1株和印度MP株亲缘关系较近;与美国OV-IA82株、德国D1701弱毒株、新西兰NZ2参考株和中国疫苗株亲缘关系较远;表明当前流行毒株可能是本省毒株、国内吉林GZ18株和国外印度MP株的重组毒株。【结论】获得4份临床样品中ORFV B2L、F1L和GIF基因序列并上传至GenBank数据库中,丰富了ORFV相关基因序列的数据库,同时阐明福建省部分羊场当前ORFV的流行特征,为福建省今后有效防控Orf提供理论依据。

关键词：羊口疮病毒 F1L基因 B2L基因 GIF基因进化分析

猪流行性腹泻病毒的结构蛋白基因及ORF3基因的遗传变异分析

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猪流行性腹泻病毒的结构蛋白基因及ORF3基因的遗传变异分析

中国畜牧兽医学会2014年学术年会

作者：王隆柏周伦江林裕胜吴学敏刘玉涛福建省农业科学院畜牧兽医研究所

引言猪流行性腹泻(PED)是由猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起的以腹泻、呕吐、脱水和对哺乳仔猪高致死率为主要特征的一种高度接触性肠道传染病,是导致世界各养猪国家仔猪早期死亡的重要疫病之一。近年来,PEDV再次席卷全球,造成了数以百万的...

引言猪流行性腹泻(PED)是由猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起的以腹泻、呕吐、脱水和对哺乳仔猪高致死率为主要特征的一种高度接触性肠道传染病,是导致世界各养猪国家仔猪早期死亡的重要疫病之一。近年来,PEDV再次席卷全球,造成了数以百万的仔猪发病死亡,又一次成为困扰世界性养猪的重要疫病。本研究对从福建不同地区采集发生PED的病料进行结构蛋白基因(S基因、E基因、M

关键词：

来源： cnki会议评论

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cnki会议

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福清市福清山羊绵羊肺炎支原体血清学调查

福建畜牧兽医 2019年第6期41卷 10-11页

作者：郭慧瑜林裕胜毛坤明胡奇林龙岩学院生命科学学院福建龙岩360012 福建省农业科学院畜牧兽医研究所福州350013 福清市畜牧兽医技术服务中心福建福清350300

为了解福清市绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae,Mo)在福清山羊中的流行状况,本研究利用Mo抗体酶联免疫分析试剂盒,对福清市4个规模化养殖场和10家散养户采集的350份血清进行Mo抗体检测。结果显示:本次调查抽样送检的350份山羊... 详细信息

为了解福清市绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae,Mo)在福清山羊中的流行状况,本研究利用Mo抗体酶联免疫分析试剂盒,对福清市4个规模化养殖场和10家散养户采集的350份血清进行Mo抗体检测。结果显示:本次调查抽样送检的350份山羊血清中Mo的阳性率为88.3%(309/350);不同羊场的阳性率范围为76.7%~97.1%。本次调查结果表明,Mo在福清地区的感染率相比其它省偏高,需要加强对Mo科学防控。

关键词：福清山羊绵羊肺炎支原体酶联免疫吸附试验检测血清学调查

牛轮状病毒RT-PCR检测方法的建立及应用

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福建农业学报 2023年第4期38卷 431-435页

作者：刘维巍林裕胜张龙江锦秀张靖鹏刘庆华胡奇林福建农林大学动物科学学院(蜂学学院) 福建福州350002 福建省农业科学院畜牧兽医研究所福建福州350013

【目的】建立牛轮状病毒(Bovine rotavirus,BRV)便捷检测方法,为福建省BRV的流行病学调查检测提供便捷技术支持。【方法】根据GenBank公布的BRV基因组序列,利用Oligo7.0软件设计并合成1对特异性引物,通过优化反应条件,建立了检测BRV的RT... 详细信息

【目的】建立牛轮状病毒(Bovine rotavirus,BRV)便捷检测方法,为福建省BRV的流行病学调查检测提供便捷技术支持。【方法】根据GenBank公布的BRV基因组序列,利用Oligo7.0软件设计并合成1对特异性引物,通过优化反应条件,建立了检测BRV的RT-PCR方法,同时开展了特异性、敏感性和重复性试验,并将建立的方法应用于22份临床样品的检测。【结果】建立的方法仅能够扩增出BRV的特异性片段,对其他畜禽常见病原体无特异性扩增;该方法的灵敏度为6.86×10^(5)copies·μL^(-1)。对22份临床样品进行检测,检测出12份阳性样品,阳性率为54.55%。【结论】本研究建立的BRV RT-PCR检测方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,可应用于临床样本的检测,为福建省BRV的诊断和流行病学调查提供了技术支持。

关键词：牛轮状病毒检测方法 RT-PCR