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Identification and analysis of mutations of the Wilson disease gene in Chinese population

Chinese Medical Journal 2000年第1期113卷 40-43页

作者：吴志英王柠慕容慎行林珉婷 China 350005

OBJECTIVE: To investigate the characteristics of mutations in exon 3-20 of Wilson disease (WD) gene and their consequences in Chinese population. METHODS: Sixty unrelated normal Chinese and forty-four unrelated WD patients were studied. Genomic DNA was prepared from peripheral blood leukocytes by a salt-out method. Polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism (PCR-SSCP) and subsequently direct sequencing were used to identify the mutations and polymorphisms of WD gene. RESULTS: Ten different mutations have been found, accounting for 52% of the mutant genes. Five of them are identified as novel missense mutations. Mutations Arg778Leu, Thr935Met and Ala874Val were represented respectively in 28.4%, 6.8% and 3.4% of WD chromosomes. The remaining mutations were found rare and limited to one or two patients. A total of 11 patients were homozygous for a single mutation, and 17 patients were in a compound heterozygous state with or without a known mutation. CONCLUSION: In Chinese, WD seems to result from two or three relatively common mutations and a large number of rare mutations. Arg778Leu and Thr935Met might be hotspots of mutation in Chinese population. The results indicated that the feature of mutations of WD gene is different between Chinese and the Western. Instead of exon 14 and exon 18, we had to select exon 8 and exon 12 first to detect mutations of WD gene in Chinese. It is of great importance to establish a direct diagnostic method for WD. This study improves our knowledge on functional domains of the WD gene, and helps elucidate the wide spectrum of manifestations of the disease as well.

关键词： Mutation Adenosinetriphosphatase Adolescent Adult Cation Transport Proteins Child Female Hepatolenticular Degeneration Humans Male Research Support, Non-U.S. Gov't

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肝豆状核变性基因12号外显子突变特征的研究

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中华医学杂志 1999年第6期79卷 422-424页

作者：吴志英王柠慕容慎行林珉婷福建医科大学附属第一医院神经内科

目的研究中国人肝豆状核变性（ＷＤ）基因１２号外显子的突变特征，为建立直接基因诊断的方法提供理论依据。方法应用聚合酶链反应单链构象多态（ＰＣＲＳＳＣＰ）技术，对４４例无亲缘关系的确诊患者和６０名正常对照组进行ＷＤ基... 详细信息

目的研究中国人肝豆状核变性（ＷＤ）基因１２号外显子的突变特征，为建立直接基因诊断的方法提供理论依据。方法应用聚合酶链反应单链构象多态（ＰＣＲＳＳＣＰ）技术，对４４例无亲缘关系的确诊患者和６０名正常对照组进行ＷＤ基因第１２号外显子的突变检测，并用ＤＮＡ测序证实其突变性质和位置。结果８例患者在１２号外显子检测到２种错义突变，占１８％（８／４４），其中６例为Ｔｈｒ９３５Ｍｅｔ突变，２例为Ｇｌｙ９４３Ａｓｐ突变。结论中国人ＷＤ基因第１２号外显子的突变特征与西方人不同。这对于建立准确快速的直接基因诊断方法具有重要价值。

关键词：肝豆状核变性常染色体异常基因突变

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Wilson病基因全长外显子的突变检测和分析

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中华神经科杂志 2001年第3期34卷 152-155,W003页

作者：吴志英王柠林珉婷方玲慕容慎行福建医科大学附属第一医院神经内科福州350005

目的　研究报道Wilson病 (WD)基因 7种新突变和 5种新多态 ,结合前期在部分外显子发现并报道的突变和多态现象 ,进一步分析WD基因全长外显子的突变特征 ,以期对中国人WD基因的突变状况有一个完整的认识。方法　研究对象包括 6 0名无亲... 详细信息

目的　研究报道Wilson病 (WD)基因 7种新突变和 5种新多态 ,结合前期在部分外显子发现并报道的突变和多态现象 ,进一步分析WD基因全长外显子的突变特征 ,以期对中国人WD基因的突变状况有一个完整的认识。方法　研究对象包括 6 0名无亲缘关系的正常对照和 84例分别来自6 5个家系的WD患者。抽取上述研究对象的外周静脉血 ,用盐析法或过柱法抽提基因组DNA。用聚合酶链反应方法分别扩增全部的 2 1个外显子顺序 ,以单链构象多态分析及DNA测序方法 ,检测上述研究对象的基因突变和多态。结果　共检测到 18种突变和 17种多态 ,包括 7种新突变和 5种新多态。其中Arg778Leu和Thr935Met为基因突变热点 ,突变频率分别高达 37 7%和 10 0 % ,其余突变的频率均低于 4 0 %。此次研究还发现曾作为突变形式加以报道的Ile1148Thr应考虑为一种多态现象。结论　我国WD基因突变是以少数几个热点突变和广泛存在的罕见突变为特征。

关键词：肝豆状核变性 DNA序列分析基因突变热点外显子

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Wilson病基因突变类型与临床表型的关系

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中华医学杂志 2003年第4期83卷 309-311页

作者：吴志英王柠林珉婷方玲慕容慎行福建医科大学附属第一医院神经内科福州350005 福建省神经病学研究所

目的探讨Wilson病(WD)基因突变类型与临床表型的关系。方法应用聚合酶链反应-单链构象多态分析(PCR-SSCP)和DNA测序方法,对84例WD患者进行WD基因全长21个外显子的突变检测,结合统计学方法,着重分析并探讨中国人WD基因突变热点Arg778Le... 详细信息

目的探讨Wilson病(WD)基因突变类型与临床表型的关系。方法应用聚合酶链反应-单链构象多态分析(PCR-SSCP)和DNA测序方法,对84例WD患者进行WD基因全长21个外显子的突变检测,结合统计学方法,着重分析并探讨中国人WD基因突变热点Arg778Leu基因型与临床表型的关系。结果 18例患者检出Arg778Leu纯合突变。29例患者在一条染色体上检出Arg778Leu杂合错义突变,其中,在另一条染色体上,3例检出移码突变;15例突变未明;余11例检出其他错义突变。就理论而言,与错义突变相比,移码突变可导致更严重的功能缺陷及表型,不能与错义突变混合进行统计学分析,另15例患者因有一条染色体突变未明亦被排除在外。因此,相对Arg778Leu纯合错义突变进行统计学分析时,只能选择11例发生复合错义突变的患者做为Arg778Leu杂合突变病例组。经统计学分析,携带Arg778Leu纯合突变的患者和携带Arg778Leu杂合突变的患者,其起病年龄、血清铜蓝蛋白水平及临床类型均差异有显著意义,P值小于0.05或0.001。结论 Arg778Leu突变不是一种温和的突变,它可导致患者症状出现较早并较严重。

关键词： Wilson病基因突变临床表型

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单链构象多态技术检测脊髓性肌萎缩症基因缺失

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中华神经科杂志 1998年第5期31卷 289-291页

作者：吴志英王柠慕容慎行林珉婷福建医科大学附属第一医院神经内科

目的探讨中国人脊髓性肌萎缩症（ＳＭＡ）基因诊断的可行性。方法应用聚合酶链反应单链构象多态（ＰＣＲＳＳＣＰ）技术研究来自１６个家系的２０例ＳＭＡ患者及２０名正常对照的运动神经元生存（ＳＭＮ）基因的第７、８号外显子的... 详细信息

目的探讨中国人脊髓性肌萎缩症（ＳＭＡ）基因诊断的可行性。方法应用聚合酶链反应单链构象多态（ＰＣＲＳＳＣＰ）技术研究来自１６个家系的２０例ＳＭＡ患者及２０名正常对照的运动神经元生存（ＳＭＮ）基因的第７、８号外显子的缺失情况。结果２０例患者均缺失端粒ＳＭＮ（ＳＭＮＴ）基因的第７号外显子，１９例患者缺失第８号外显子，而正常对照均无外显子缺失。

关键词：脊髓性肌萎缩症运动神经元基因缺失 PCR-SSCP

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应用脉冲场电泳技术研究面肩肱型肌营养不良症的基因突变特征及进行基因诊断

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中华神经科杂志 2004年第6期37卷 521-525页

作者：王志强吴志英王柠林珉婷慕容慎行福建医科大学附属第一医院神经内科福州350005 福建省神经病学研究所

目的　应用脉冲场电泳 (PFGE)技术研究面肩肱型肌营养不良症 (FSHD)基因结构突变特征 ,并进行基因诊断。方法　研究对象包括 :110名健康对照 ,17例FSHD患者和 2 3名家系成员。低熔点胶包埋法抽提基因组DNA ,EcoRI、EcoRI/BlnI、XapI原... 详细信息

目的　应用脉冲场电泳 (PFGE)技术研究面肩肱型肌营养不良症 (FSHD)基因结构突变特征 ,并进行基因诊断。方法　研究对象包括 :110名健康对照 ,17例FSHD患者和 2 3名家系成员。低熔点胶包埋法抽提基因组DNA ,EcoRI、EcoRI/BlnI、XapI原位酶切 ,用脉冲电场凝胶电泳 (PFGE)分离 ,p13E 11探针Southern杂交 ,曲线拟合法计算分析片段的长度。结果　 17例患者均存在 1条小于 35kb的 4 q35EcoRI致病片段 ;2 3名无症状家系成员中 ,发现 2例患者的母亲分别携带 2 5kb和 2 8kb的 4q35EcoRI短片段 ,因年龄较大 ,考虑为女性无症状顿挫型患者。另 2例患者的女性同胞分别携带 2 1 5kb和 31kb的 4 q35EcoRI短片段 ,因年龄较小 ,考虑为症状前患者。家族型和散发型患者均存在 4q→ 10 q型易位 ,各有 2例 ,其中 1例家族型患者为杂合易位 ;此外 ,在散发型患者中 ,发现 2例男性患者存在体细胞嵌合现象。结论　我国FSHD患者存在易位、杂合、体细胞嵌合等复杂现象。应用PFGE技术对FSHD患者进行基因诊断具有准确性和可靠性。

关键词：脉冲场电泳技术面肩肱型肌营养不良症基因突变特征基因诊断

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应用限制性酶谱分析法快速检出Wilson病基因突变热点

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中华神经科杂志 1999年第5期32卷 281-283页

作者：王柠吴志英林珉婷慕容慎行福建医科大学附属第一医院神经内科福州350005

目的建立Wilson病（WD）基因突变热点的快速检出方法，并探讨其在WD临床可疑患者诊断中的价值。方法PCR扩增我国WD基因的突变热区──第8号和12号外显子，分别以限制性内切酶MspI和TaiI消化扩增产物，2％琼脂糖凝胶电泳分离，得出相应... 详细信息

目的建立Wilson病（WD）基因突变热点的快速检出方法，并探讨其在WD临床可疑患者诊断中的价值。方法PCR扩增我国WD基因的突变热区──第8号和12号外显子，分别以限制性内切酶MspI和TaiI消化扩增产物，2％琼脂糖凝胶电泳分离，得出相应限制性酶切图谱并进行分析。56例非同源家系的WD患者及60例正常对照进行了该项检测。其中44例同时进行这两个外显子的测序检测。结果37．5％（21／56）的WD患者在第8号外显子检测到Arg778Leu／Gln点突变，其中12例为纯合点突变，9例为杂合点突变，染色体突变频率为29．5％（33／112）。16．1％（9／56）的患者在第12号外显子检测到Thr935Met点突变，均为杂合点突变，染色体突变频率为8．0％（9／112）。结果与测序相符。结论采用限制性酶谱分析法可准确检出WD基因最常见的两个突变点，有助于对临床可疑患者进行诊断。并具有简便快速、结果清晰可靠、不需用同位素等优点，易于推广应用。

关键词：肝豆状核变性基因突变限制酶图谱法

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经DNA测序证实的肝豆状核变性基因突变热区的研究

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中华神经科杂志 1998年第1期31卷 20-23页

作者：王柠吴志英慕容慎行林珉婷方玲福建医科大学附属第一医院神经内科

目的研究我国肝豆状核变性（ＷＤ）基因突变的特征。方法应用聚合酶链反应－单链构像多态（ＰＣＲ－ＳＳＣＰ）技术，结合ＤＮＡ测序技术，筛查４０个ＷＤ家系的５６例患者及无亲缘关系的６０名正常人的ＷＤ基因第５、８、１４号外显子... 详细信息

目的研究我国肝豆状核变性（ＷＤ）基因突变的特征。方法应用聚合酶链反应－单链构像多态（ＰＣＲ－ＳＳＣＰ）技术，结合ＤＮＡ测序技术，筛查４０个ＷＤ家系的５６例患者及无亲缘关系的６０名正常人的ＷＤ基因第５、８、１４号外显子（ｅｘｏｎ５，ｅｘｏｎ８，ｅｘｏｎ１４）的突变及多态。结果２１例患者（来自１５个ＷＤ家系）在ｅｘｏｎ８检出２种错义突变，占３７．５％（１５／４０），其中２例（来自同一家系）发生Ａｒｇ７７８Ｇｌｎ纯合子突变（２．５％），８例（分别来自８个ＷＤ家系）发生Ａｒｇ７７８Ｌｅｕ纯合子突变（２０．０％），余１１例（来自６个ＷＤ家系）发生Ａｒｇ７７８Ｌｅｕ杂合子突变（１５．０％，６／４０）。此外，在第８号外显子区域发现了两种多态；在ｅｘｏｎ５和ｅｘｏｎ１４侧翼的内含子区域各发现了１种新多态。这是我国首次经ＤＮＡ测序证实的ＷＤ基因突变热区。结论ｅｘｏｎ８为我国ＷＤ病人基因突变的热区之一，这对于建立准确快速的ＷＤ直接基因诊断方法具有重要意义，该测序方法对明确基因变异的具体部位和内容的具有一定的重要性。

关键词：肝豆状核变性基因突变 DNA测序

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肝豆状核变性病基因第1、2和21号外显子突变的检测分析

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中华医学杂志 2001年第2期81卷 105-106页

作者：吴志英王柠林珉婷方玲慕容慎行福建医科大学附属第一医院神经内科福州350005

在前期研究中，我们对44例无亲缘关系的肝豆状核变性病（wilson′s disease，WD)患者进行了WD基因3～20号外显子的突变检测，探讨其突变特征［1］，同时证实了8号和12号外显子可能为我国的WD基因突变热区［2,3］。

关键词：肝豆状核变性基因突变 DNA序列分析

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利用CRISPR/Cas9 AAV系统构建纹状体Slc20a2基因敲除小鼠模型

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遗传 2020年第10期42卷 1017-1027页

作者：林珉婷赖璐璐赵淼林必玮姚香平福建医科大学附属第一医院神经内科福州300005 福建医科大学神经科学研究院福州300004 福建省分子神经病学重点实验室福州300005

原发性家族性脑钙化症(primary familial brain calcification,PFBC)是慢性进展性的神经系统遗传病,临床症状主要包括运动障碍、认知障碍及精神障碍等,其致病机制尚未完全明确。研究表明SLC20A2是该病最主要的致病基因。由于Slc20a2基... 详细信息

原发性家族性脑钙化症(primary familial brain calcification,PFBC)是慢性进展性的神经系统遗传病,临床症状主要包括运动障碍、认知障碍及精神障碍等,其致病机制尚未完全明确。研究表明SLC20A2是该病最主要的致病基因。由于Slc20a2基因全身性敲除小鼠模型会导致胎儿生长受限,为更好地研究PFBC发病机制,本研究应用CRISPR/Cas9技术构建了纹状体Slc20a2基因条件性敲除小鼠模型。首先,针对Slc20a2基因编码区,设计3条靶向exon3的sgRNA(single guide RNA),通过构建质粒、转染细胞、Surveyor assay等实验验证sgRNA的活性。其次,选取活性较高的sgRNA重组包装AAV-Cre病毒,应用立体定位将AAV病毒定点注射于小鼠纹状体。体外实验结果表明设计的3条sgRNA均能够有效地介导Cas9切割靶DNA。细胞免疫荧光实验结果证实AAV-Cre病毒具有Cre重组酶活性。最后,通过小鼠脑部组织免疫组化、TA-克隆、高通量测序及Western blot方法检测Slc20a2基因敲除效率,发现实验组小鼠纹状体组织Slc20a2表达明显降低。本研究成功设计了3条能够敲除Slc20a2的功能sgRNA,并应用CRISPR/Cas9技术成功构建了纹状体Slc20a2基因条件性敲除小鼠,为研究PFBC的发病机制提供了有效的动物模型。

关键词： CRISPR/Cas9 Slc20a2 sgRNA 基因敲除小鼠模型

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