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半胱氨酸蛋白酶基因的克隆及在家蚕生物反应器中的表达

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半胱氨酸蛋白酶基因的克隆及在家蚕生物反应器中的表达

作者：林旭瑷山东农业大学

学位级别：硕士

杆状病毒被广泛用来在昆虫细胞或虫体内表达有用蛋白，杆状病毒表达载体系统(silkworm baculovirus expression vector system Silkworm。 BEVS)已成为一个表达具有生物活性和特性的重组蛋白的有力工具。为了提高家蚕BEVS表达外源基... 详细信息

杆状病毒被广泛用来在昆虫细胞或虫体内表达有用蛋白，杆状病毒表达载体系统(silkworm baculovirus expression vector system Silkworm。 BEVS)已成为一个表达具有生物活性和特性的重组蛋白的有力工具。为了提高家蚕BEVS表达外源基因的效率和改善杆状病毒生物杀虫剂的杀虫性能，本文应用杆状病毒表达载体系统在多角体强启动子的控制下，实现了杆状病毒来源的半胱氨酸蛋白酶基因的表达。本实验利用DNA重组技术将BmNPV-ZJ8株基因组DNA中的半胱氨酸蛋白酶(cysteine protease，CP)基因克隆到通用载体pBluescript SK上，构建了重组质粒pSK-CP。序列分析认为该蛋白酶基因的ORF为972个核苷酸，编码323个氨基酸。同源性分析表明，BmNPVZJ8-CP在DNA水平上与其它来源的CP具有较高的同源性，该半胱氨酸蛋白酶含有在组织蛋白酶B、H、L、S及木瓜蛋白酶中保守的36个氨基酸残基中的31个。根据己知的杆状病毒半胱氨酸蛋白酶基因序列构建了该基因的进化树，发现BmNPVZJ8-CP与人的木瓜蛋白酶超家族的cp基因在同一进化分支上，与BmNPV-T3株、AcNPV的半胱氨酸蛋白酶基因的核苷酸同源性最高，而与HaNPV、HzsNPV、SeNPV、CpGV的cp基因则处于不同的同源组。测序正确后将cp基因克隆到转移载体pVL1393上(pVL-CP)。通过限制酶性切图谱分析鉴定，表明cp基因己正确插入转移载体，受多角体蛋白基因启动子控制。将cp基因克隆进原核表达载体pET-28a中(pET-CP)，转化大肠杆菌BL21，在大肠杆菌表达系统中进行表达。由于大肠杆菌表达系统是一种原核表达系统，缺乏真核蛋白翻译后加工的场所，且半胱氨酸蛋白酶可能特异性的降解大肠杆菌的蛋白质，因而表达产物对大肠杆菌本身的生长是一种有害物质，所以并没有获得有效的表达。通过对不同时相的大肠杆菌生长情况进行了比较，说明在pET28a-CP／IPTG中含有一种能够抑制菌体生长的物质，间接证明了在pET28a中插入的cp基因是有功能的，其表达产物对大肠杆菌具有生理毒性。利用病毒基因组线性化技术，在细胞培养的基础上，将重组转移载体 pVL-CP与经酶切线性化的亲本病毒(Bm-BacPAK6)在脂质体(1ipofectine) 的介导下共转染家蚕贴壁培养细胞Bm-5，发现含有cp基因的重组病毒与对照的亲本病毒相比，感染效率较低，接种重组病毒的细胞裂解所需时间反而延长。通过蓝白斑筛选、空斑分析、纯化得到只产生白斑的重组病毒。用重组病毒注射家蚕5龄起蚕或嫩蛹，通过PCR分析证明半胱氨酸蛋白酶基因在蚕体和蛹体中得到了表达，根据感染后不同时期半胱氨酸蛋白酶的活力作表达时相曲线，发现重组病毒感染家蚕幼虫96h后cp基因的表达产物开始迅速增加，在120h达最高峰，此后感染蚕体开始液化、死亡;感染蛹体132h后，其半胱氨酸蛋白酶的表达量达最高值。 SDS-PAGE电泳分析发现，在标准蛋白分子量Marker的20～30 kD之间有特异性条带，推测可能是cp基因的表达产物之一，由于蚕体本身的血淋巴中30 kD左右的蛋白丰度极高，存在大量30 kD左右蛋白，分子量均为 30 kD左右，可能掩盖了cp基因的其它表达产物。通过活性测定表明，本实验的表达产物具有生物学活性。酶学性质分析发现杆状病毒半胱氨酸蛋白酶的最适反应温度为45℃、最适PH值为4.0，最大相对活力为1 600 LI／mL。对含有cp基因的重组杆状病毒的杀虫效应作了初步探讨，注射感染家蚕5龄起蚕或嫩蛹，发现重组病毒对宿主的致死能力与亲本病毒对比没有明显区别，只是在虫体液化方面效果显著，因而推测本实验所得到的半胱氨酸蛋白酶有可能应用于蚕体、蛹体蛋白水解及氨基酸纯化等蚕桑副产品综合利用上。

关键词：家蚕半胱氨酸蛋白酶杆状病毒表达载体系统克隆表达酶学性质

亚铁血红素在细菌生存及感染过程中的作用研究进展

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中华微生物学和免疫学杂志 2018年第3期38卷 226-231页

作者：义玉思严杰林旭瑷浙江大学医学院病原生物学系 310058

亚铁血红素（Heme或Heam）是一种铁卟啉复合物，是铁在体内最主要的存在方式，也是病原菌生存所需的主要铁离子来源，在细菌感染过程中可导致宿主氧化损伤、细胞死亡、器官功能衰竭、扩大炎症反应等。本文从Heme的结构、来源以及在微生... 详细信息

亚铁血红素（Heme或Heam）是一种铁卟啉复合物，是铁在体内最主要的存在方式，也是病原菌生存所需的主要铁离子来源，在细菌感染过程中可导致宿主氧化损伤、细胞死亡、器官功能衰竭、扩大炎症反应等。本文从Heme的结构、来源以及在微生物存活和感染过程中发挥的作用等方面进行综述，以更好地了解细菌的生长和致病过程。

关键词：亚铁血红素细菌生长致病

环介导的等温扩增与实时荧光PCR检测问号钩端螺旋体的比较

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中华微生物学和免疫学杂志 2011年第8期31卷 751-754页

作者：方葆丁士标严杰林旭瑷浙江省开化县中医院检验科衢州324300 浙江省杭州市红十字会医院检验科浙江大学医学院病原生物学系杭州310058

目的通过比较环介导的等温扩增技术（loop—mediatedisothermalamplification，LAMP）与实时荧光PCR（***）技术在检测问号钩端螺旋体的特异性及灵敏度方面的差异，寻找一种快速、灵敏且特异性强的问号钩端螺旋体检测方法。方法根据问... 详细信息

目的通过比较环介导的等温扩增技术（loop—mediatedisothermalamplification，LAMP）与实时荧光PCR（***）技术在检测问号钩端螺旋体的特异性及灵敏度方面的差异，寻找一种快速、灵敏且特异性强的问号钩端螺旋体检测方法。方法根据问号钩端螺旋体liplAl基因序列设计LAMP及实时荧光PCR扩增所用的特异性引物，对我国15群15株问号钩端螺旋体参考菌株进行检测，比较二者在检测的特异性和灵敏度方面的差异。结果LAMP反应大约可在30min内完成，整个分析过程不超过1h。Real-timePCR的整个过程大约需要60min。二者具有相同的检测灵敏度和特异性，最低检出限度均为100个拷贝，整个检测过程没有出现假阳性。结论在检测速度、灵敏度和特异性方面，LAMP技术与real—timePCR技术相当，但LAMP检测技术是在恒温条件下进行，不需要特别昂贵的仪器设备，检测方法简单，在基层实验室及现场检测方面具有明显的优势，是可应用于问号钩端螺旋体检测的一种有效技术。

关键词：问号钩端螺旋体环介导的等温扩增 Real-time PCR lipL41基因

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细菌HD-GYP结构域蛋白研究进展

中华微生物学和免疫学杂志 2017年第3期37卷 230-234页

作者：孔亮亮严杰林旭瑷浙江大学医学院病原生物学系杭州310058

环二鸟苷酸（cyclic diguanylate，c-di-GMP）是广泛存在于细菌中的第二信使分子，参与调节细菌的运动、黏附、毒力及生物膜形成等多种生理活动。c-di-GMP在胞内的代谢主要由含有GGDEF结构域的二鸟苷环化酶（diguanylate cyclase，DGC... 详细信息

环二鸟苷酸（cyclic diguanylate，c-di-GMP）是广泛存在于细菌中的第二信使分子，参与调节细菌的运动、黏附、毒力及生物膜形成等多种生理活动。c-di-GMP在胞内的代谢主要由含有GGDEF结构域的二鸟苷环化酶（diguanylate cyclase，DGC）和含有EAL或HD-GYP结构域的磷酸二酯酶（phosphodiesterase，PDE）调控。其中HD-GYP结构域蛋白是最近几年新发现的参与调控c-di-GMP的磷酸二酯酶，本文从HD-GYP结构域蛋白的结构、作用特点和生物学功能等方面进行综述。

关键词：环二鸟苷酸磷酸二酯酶 HD-GYP结构域

问号钩端螺旋体属特异性外膜蛋白LipL41抗原表位预测及免疫学鉴定

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浙江大学学报（医学版） 2008年第6期37卷 585-591,621页

作者：姜久昆林旭瑷严杰薛峰浙江大学医学院病原生物学系浙江杭州310058 浙江大学附属第一医院传染病诊治国家重点实验室基础医学微生物学研究室浙江杭州310003

目的:预测及筛选问号钩端螺旋体(简称钩体)属特异性外膜蛋白LipL41有效T和B细胞(T/B)联合表位,了解不同基因型LipL41s差异T/B联合表位的免疫反应性差别。方法:采用生物信息学方法预测LipL41/1和LipL41/2分子中T/B联合表位。采用PCR扩增... 详细信息

目的:预测及筛选问号钩端螺旋体(简称钩体)属特异性外膜蛋白LipL41有效T和B细胞(T/B)联合表位,了解不同基因型LipL41s差异T/B联合表位的免疫反应性差别。方法:采用生物信息学方法预测LipL41/1和LipL41/2分子中T/B联合表位。采用PCR扩增候选T/B联合表位片段,采用噬菌体展示及SDS-PAGE等技术获得含不同T/B联合表位的重组P。分别以rLipL41/1和rLipL41/2抗血清、黄疸出血群赖型赖株全菌抗血清和钩体患者血清为一抗,采用Western Blot检测各抗血清与各重组P免疫杂交反应性。结果:根据预测结果选择了LipL41s中8个共有或差异T/B联合表位。经PCR扩增获得了上述T/B联合表位片段。各T/B联合表位片段均准确插入噬菌体P蛋白N端并有效表达。各抗血清均能识别上述8个T/B联合表位,但其WesternBlot杂交信号强度存在差异,其中共有T/B联合表位LipL41/1-30和LipL41/1-233与不同抗血清的信号较强且稳定。结论:所选择的8个T/B联合表位均为LipL41的有效抗原表位。共有T/B联合表位LipL41/1-30和LipL41/1-233可作为钩体MAP疫苗的首选抗原表位。差异T/B联合表位LipL41s-89和LipL41s-299与不同抗血清有免疫交叉现象。

关键词：钩端螺旋体,问号/免疫学细菌外膜蛋白质类/生物合成细菌外膜蛋白质类/分离外膜脂蛋白/属特异性抗原 LipL41/1/LipL41/2 抗原表位/预测噬菌体展示免疫学鉴定

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医学微生物学实验课程改革的实践与体会

中国病原生物学杂志 2014年第9期9卷 I0002-I0004页

作者：林旭瑷严杰浙江大学医学院病原生物学系浙江杭州310058

为了提高医学微生物学实验教学质量,激发学生学习兴趣,掌握基本实验操作技能并同时提高应用能力及培养科研思维,对本校2011级5年制临床医学专业学生的医学微生物学实验教学进行了一定的改革和探索。采用病例讨论式教学,综合性实验设计... 详细信息

为了提高医学微生物学实验教学质量,激发学生学习兴趣,掌握基本实验操作技能并同时提高应用能力及培养科研思维,对本校2011级5年制临床医学专业学生的医学微生物学实验教学进行了一定的改革和探索。采用病例讨论式教学,综合性实验设计等方法,将病原生物学、免疫学实验教学内容整合,教学效果评价为期末考试结合调查问卷的方式。通过改革使学生成为教学过程的主体,充分激发了学生的学习热情,不仅培养了学生的动手能力,更提高了他们交流和合作、综合分析和解决问题的能力。

关键词：病例讨论医学微生物学实验教学改革能力培养

钩端螺旋体溶血素Sph2表达模式及诱导巨噬细胞和肝细胞凋亡活性

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中华微生物学和免疫学杂志 2010年第6期30卷 523-527页

作者：丁士标林旭瑷王欢严杰浙江大学医学院病原生物学系杭州310058

目的了解问号钩端螺旋体（简称钩体）感染细胞前后sph2基因表达水平变化,确定鞘磷脂酶类溶血素Sph2及诱导细胞凋亡的活性.方法采用PCR从黄疸出血群赖型赖株钩体基因组DNA中扩增全长sph2基因片段,T-A克隆后测序.构建sph2基因原核表达系... 详细信息

目的了解问号钩端螺旋体（简称钩体）感染细胞前后sph2基因表达水平变化,确定鞘磷脂酶类溶血素Sph2及诱导细胞凋亡的活性.方法采用PCR从黄疸出血群赖型赖株钩体基因组DNA中扩增全长sph2基因片段,T-A克隆后测序.构建sph2基因原核表达系统,采用SDS-PAGE检查重组Sph2（rSph2）的表达情况,Ni-NTA亲和层析法提纯rSph2.采用绵羊血平板溶血试验及血红蛋白分光光度法测定rSph2的溶血活性.采用流式细胞术检测rSph2诱导小鼠单核-巨噬样细胞株J774A.1和肝细胞株IAR20凋亡的活性,实时荧光定量PCR检测赖株钩体感染J774A.1和IAR20细胞前后sph2基因mRNA水平变化.结果与GenBank中sph2基因比较,所克隆的sph2基因序列相似性为100%.所构建的原核表达系统能高效表达***2以浓度依赖方式溶解绵羊红细胞.10 μg/ml rSph2可诱导J774A.1和IAR20细胞凋亡,凋亡率峰值分别为23.96%和32.92%.赖株钩体感染J774A.1和IAR20细胞后0.5～2 h内sph2基因mRNA水平显著升高,2 h后mRNA水平迅速下降.结论钩体sph2基因呈宿主细胞接触式瞬时表达.rSph2有溶解绵羊红细胞及诱导巨噬细胞和肝细胞凋亡的活性,因而Sph2是钩体致病过程中重要的毒力因子.

关键词：问号钩端螺旋体 sph2基因/重组表达/瞬时表达鞘磷脂酶类溶血素溶血活性细胞凋亡

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环二鸟苷酸信号系统研究进展

中华微生物学和免疫学杂志 2014年第6期34卷 476-480页

作者：王昭圆冯兆瑾金蕾严杰林旭瑷浙江大学医学院病原生物学系杭州310058

所有生命体都会通过信号转导感应环境改变，并反映在代谢、生理及行为适应等方面。这些调控网络非常复杂，并依赖于许多不同组分之间的相互作用来协调产生适合的生化反应，其中一个重要的成分即是第二信使分子，第二信使通过细胞表面受... 详细信息

所有生命体都会通过信号转导感应环境改变，并反映在代谢、生理及行为适应等方面。这些调控网络非常复杂，并依赖于许多不同组分之间的相互作用来协调产生适合的生化反应，其中一个重要的成分即是第二信使分子，第二信使通过细胞表面受体感受第一信使信号并传递给细胞内大分子。在细菌中c-di-GMP是参与调控细菌主要生理功能的第二信使分子之一，是由两分子的GTP在鸟苷酸环化酶作用下形成。生物信息学分析发现编码 c-di-GMP的基因广泛分布于原核生物尤其是革兰氏染色阴性的细菌中。

关键词：鸟苷酸环化酶信号系统信使分子细胞表面受体调控网络生理功能革兰氏染色环境改变

问号钩端螺旋体 tlyA 基因原核表达及其表达产物溶血和致炎作用

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中华微生物学和免疫学杂志 2015年第5期35卷 341-347页

作者：王欢林旭瑷周永列邱莲女严杰浙江省人民医院检验中心杭州310014 浙江大学医学院病原生物学系杭州310058

目的：构建问号钩端螺旋体（简称钩体） tlyA基因原核表达系统，确定目的重组表达产物rTlyA溶解红细胞及诱导人THP-1和小鼠J774A．1巨噬细胞分泌致炎细胞因子的作用。方法采用PCR扩增问号钩体黄疸出血群赖型赖株tlyA基因，T-A克隆后测... 详细信息

目的：构建问号钩端螺旋体（简称钩体） tlyA基因原核表达系统，确定目的重组表达产物rTlyA溶解红细胞及诱导人THP-1和小鼠J774A．1巨噬细胞分泌致炎细胞因子的作用。方法采用PCR扩增问号钩体黄疸出血群赖型赖株tlyA基因，T-A克隆后测序。采用原核表达载体pET-42a及表达宿主菌*** BL21DE3构建tlyA基因原核表达系统。采用SDS-PAGE检测rTlyA表达情况， Ni-NTA亲和层析法提纯rTlyA。采用平板法和分光光度法测定rTlyA对绵羊红细胞的溶血活性。采用RT-PCR和Western blot分别检测问号钩体赖株感染THP-1和J774A．1细胞后tlyA基因mRNA水平变化及TlyA外分泌情况。采用ELISA检测rTlyA诱导THP-1和J774A．1细胞分泌致炎细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的作用。结果所克隆的tlyA基因与GenBank中公布的相应基因核苷酸和氨基酸序列相似性分别为99．2％和99．8％。所构建的tlyA基因原核表达系统能有效表达rTlyA。10μg／ml rTlyA能显示较强的溶解绵羊红细胞活性。问号钩体赖株感染THP-1和J774A．1细胞1～8 h后，tlyA-mRNA水平显著升高（P＜0．05）且出现TlyA外分泌。0．1、1和10μg／ml rTlyA均能使THP-1和J774A．1细胞分泌致炎细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的水平显著升高（P＜0．05）。结论问号钩体tlyA基因产物TlyA是溶血素并能诱导巨噬细胞分泌IL-1β、IL-6和TNF-α，可在钩体病炎症反应中发挥重要作用。

关键词：问号钩端螺旋体 tlyA基因溶血素表达/分泌致炎细胞因子

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