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光皮桦ACC氧化酶基因BlACO的克隆和表达分析

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植物生理学通讯 2010年第9期46卷 909-916页

作者：周厚君黄华宏林二培程龙军彭沙沙童再康浙江农林大学林业与生物技术学院浙江临安311300

ACC(1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid)氧化酶(ACO)是植物乙烯合成过程中的关键限速酶,对乙烯的合成具有重要的调控作用。以光皮桦茎叶组织提取的RNA为模板,据已报道的ACO同源序列设计简并引物,通过RT-PCR扩增获得部分基因片段,结... 详细信息

ACC(1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid)氧化酶(ACO)是植物乙烯合成过程中的关键限速酶,对乙烯的合成具有重要的调控作用。以光皮桦茎叶组织提取的RNA为模板,据已报道的ACO同源序列设计简并引物,通过RT-PCR扩增获得部分基因片段,结合5',3'RACE方法从光皮桦中扩增出1个ACO的全长cDNA序列。该基因cDNA全长1262bp,具有一个957bp的完整开放阅读框架,编码含318个氨基酸的蛋白。与其他植物中的ACO基因进行同源性比对的结果显示,BlACO蛋白与欧洲白桦的同源性最高,达到97%。该基因在光皮桦的雄花和雌花中表达量较高,而在茎中的表达量较低。

关键词：光皮桦 ACO 基因克隆表达

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光皮桦实时荧光定量PCR内参基因的筛选

林业科学 2016年第8期52卷 29-37页

作者：刘文哲牛明月李秀云林二培黄华宏童再康浙江农林大学亚热带森林培育国家重点实验室培育基地临安311300

[目的]利用定量PCR和表达分析软件研究候选内参基因在光皮桦不同组织中的表达稳定性,并通过目的基因的表达分析验证其可靠性,以获得可用于光皮桦定量PCR的稳定内参基因。[方法]选取16个常用的看家基因作为候选内参基因,设计引物,通过普... 详细信息

[目的]利用定量PCR和表达分析软件研究候选内参基因在光皮桦不同组织中的表达稳定性,并通过目的基因的表达分析验证其可靠性,以获得可用于光皮桦定量PCR的稳定内参基因。[方法]选取16个常用的看家基因作为候选内参基因,设计引物,通过普通PCR、溶解曲线及琼脂糖凝胶电泳验证引物的特异性;通过实时荧光定量PCR及软件ge Norm、Norm Finder和Best Keeper分析候选内参基因在光皮桦16个不同组织中的表达稳定性,根据分析结果筛选出最佳的内参基因和组合,并进一步通过2个目的基因CSLD和KOR对内参基因的稳定性进行验证。[结果]PCR和电泳结果显示,候选内参基因PCR目的片段条带清晰单一,熔解曲线也呈现明显的单一峰,表明这些引物的特异性良好。利用特异引物,对这些候选基因在16个不同组织的表达进行分析,发现除了18S,其他基因的Ct值均集中在25~30之间,表明内参基因在不同组织中表达较稳定,它们之间的表达水平差异不明显。Norm Finder和Best Keeper分析结果均表明基因EF1α的稳定性最好,ge Norm计算得出最稳定的是TATA,而UBi-lp在所有候选内参基因中表达最不稳定。进一步选取3个稳定表达候选基因（EF1α,TATA和UBi4）及稳定性较差的UBi-lp作为内参基因,对2个目的基因CSLD和KOR在不同组织中的相对表达进行分析,结果表明这2个目的基因相对于3个稳定的内参基因显示出一致的相对表达量,而不稳定的内参基因UBi-lp并没有对表达数据进行有效的标准化,结果存在明显偏差。[结论]通过实时荧光定量PCR及综合3种软件分析的结果,在光皮桦不同的组织中,EF1α,TATA和UBi4内参基因的表达稳定性高,对这3个基因进行验证并明确其作为荧光实时定量PCR内参的可靠性。因此,EF1α,TATA和UBi4可作为研究基因在光皮桦不同组织器官中表达的稳定内参。

关键词：光皮桦内参基因实时荧光定量PCR

杉木应压木形成中的显微特征及主要代谢成分变化

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核农学报 2022年第11期36卷 2307-2315页

作者：杜明秋钟珊丽林二培黄华宏浙江农林大学亚热带森林培育国家重点实验室浙江杭州311300

为了解析主要代谢成分与杉木(Cunninghamia lanceolata)应压木形成的关系,以3年生直立杉木苗为研究对象,与垂直方向倾斜45°放置30、60和90 d后观察其生长性状并测定木质纤维素含量,使用气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)对木质部代谢成分进... 详细信息

为了解析主要代谢成分与杉木(Cunninghamia lanceolata)应压木形成的关系,以3年生直立杉木苗为研究对象,与垂直方向倾斜45°放置30、60和90 d后观察其生长性状并测定木质纤维素含量,使用气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)对木质部代谢成分进行鉴定和解析。解剖发现应压木木质部管胞发生变形;化学成分测定发现总木质素和半纤维素含量增加,纤维素含量降低;GC-MS检测出应压木、对应木和直立木中共有成分20种,其中有机酸7种、单糖3种、二糖2种、醇类3种、氨基酸2种、酚类和糖苷类各1种;主成分分析结合显著性检验发现,3个时期应压木和直立木中有11种共有差异代谢物,其中乙醇酸、甘氨酸、核糖酸和棕榈酸在应压木中的含量显著低于对应木和直立木,苹果酸、松醇、肌醇、半乳糖和蔗糖在应压木中的含量显著高于对应木和直立木。本试验结果从代谢角度解释了杉木应压木形成中的生物学变化,可为揭示木材形成的分子机制提供新途径,并为高品质木材的定向培育和木材功能性改良提供理论依据。

关键词：应压木杉木有机酸类糖类气相色谱-质谱法(GC-MS)

杉木苯丙氨酸解氨酶基因ClPAL的克隆与表达分析

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林业科学 2013年第12期49卷 64-72页

作者：徐莉莉童再康林二培黄华宏浙江农林大学亚热带森林培育国家重点实验室培育基地临安311300

利用RACE方法从杉木中分离得到3个编码苯丙氨酸解氨酶(PAL)的全长cDNA序列,分别为2 455,2 418,2 689 bp,编码的氨基酸个数分别为709,710,709。氨基酸序列分析显示,推导的氨基酸序列包含PAL-HAL和PAL 2个功能域以及酶活性中心序列(GTITAS... 详细信息

利用RACE方法从杉木中分离得到3个编码苯丙氨酸解氨酶(PAL)的全长cDNA序列,分别为2 455,2 418,2 689 bp,编码的氨基酸个数分别为709,710,709。氨基酸序列分析显示,推导的氨基酸序列包含PAL-HAL和PAL 2个功能域以及酶活性中心序列(GTITASGDLVPLSYIA)。荧光定量PCR分析表明,虽然3个ClPAL基因在调查的器官和组织中皆有表达,但仍表现出一定的组织特异性。ClPAL1在木质化茎中的表达量明显高于针叶、雌球花、根和非木质化茎中的表达量,ClPAL3主要在木质化茎中表达;二者均在木质部中优势表达,且在中间材中的表达量高出边材20倍以上。ClPAL2主要在富含韧皮部针叶和皮层中高丰度表达。IAA、GA3和BR能促进木质部细胞的分化,与木质素的生物合成有直接或间接的联系。经此3种激素处理后,ClPAL1和ClPAL3的表达模式相似,均受到不同程度的诱导,其中IAA和BR的诱导效应相对明显;ClPAL2基因的表达则受到相对弱的抑制。这些结果说明ClPAL1和ClPAL3可能主要参与了杉木木材中木质素的合成过程。在应压木诱导形成中,ClPAL1在应压区木质部的表达量表现为先下降后上升,处理10天后达对照的1.4倍,在对应区木质部中则呈现下调表达;ClPAL2在应压区木质部中表现为上调表达,而在对应区木质部中,仅处理10天后的表达量明显高于对照;ClPAL3的表达量变化不是很明显。另外,ClPAL2基因在中间材中的表达丰度也明显高于边材,是否参与杉木心材特殊色泽的形成值得深入研究。

关键词：杉木 PAL基因基因克隆基因表达木材形成

杉木NAC转录因子基因ClNAC1的克隆、表达及单核苷酸多态性分析

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林业科学 2018年第9期54卷 49-59页

作者：魏明科俞金健黄晓龙刘琼瑶黄华宏林二培童再康浙江农林大学亚热带森林培育国家重点实验室杭州311300

【目的】克隆与杉木次生壁形成相关的Cl NAC1基因,在组织表达特异性分析基础上开展该基因的单核苷酸多态性(SNP)及其连锁不平衡(LD)分析,以期为深入解析该基因功能和开展LD作图提供重要依据。【方法】基于杉木根、茎、叶等混合样本转录... 详细信息

【目的】克隆与杉木次生壁形成相关的Cl NAC1基因,在组织表达特异性分析基础上开展该基因的单核苷酸多态性(SNP)及其连锁不平衡(LD)分析,以期为深入解析该基因功能和开展LD作图提供重要依据。【方法】基于杉木根、茎、叶等混合样本转录组测序获得的相关数据,分离杉木Cl NAC1的c DNA序列,进行同源比对和进化树构建分析。利用实时荧光定量PCR技术(q PCR)检测Cl NAC1的表达模式。通过MEGA 6.0和Dna SP 5.0分析Cl NAC1在40个杉木无性系的SNP变异,以及LD衰减程度。【结果】分离到Cl NAC1基因c DNA序列1 286 bp,开放阅读框(ORF)长度为1 092 bp,编码蛋白质在N端含有1个由128个氨基酸残基组成的NAC结构域。相应基因组序列长2 546 bp,有3个外显子和3个内含子,且第1个内含子位于5'非翻译区(UTR)。系统进化树分析表明,Cl NAC1蛋白位于B分支,与拟南芥的NST1/2/3、毛果杨的Ptr WND2A/B等聚在一起,属于次生生长相关的NAC转录因子类别。Cl NAC1在雄球花中的表达量最大,在当年生成熟叶中最小;该基因在当年生半木质化茎中的表达量是未木质化茎的2.8倍,且在去年生茎木质部中的表达量比皮层大3倍左右。利用来自6个地理种源的40个无性系发现Cl NAC1内存在104个常见SNP位点,平均发生频率为1/24 bp,多样性水平达到0.012 53。编码区域有32个SNP位点,其中25个属于同义突变,7个属于错义突变。SNP多样性指数πtot、πsil、πs、πn在6个群体间的差异不显著,且不同群体的非同义突变多样性πn皆小于同义突变多样性πs。LD分析显示,当r2>0.1时,在6个群体中LD衰退序列长度在1 025~2 460 bp间变化,在基因内部LD水平已衰退至不显著。【结论】杉木Cl NAC1基因可能参与次生壁的发育。Cl NAC1在不同无性系间存在丰富的SNP变异,且在进化中主要受纯化选择作用。不同杉木群体中Cl NAC1基因SNP位点间的LD皆在较短序列长度内迅速消失,表明基于候选基因的LD作图策略在杉木关联作图研究中是可行的。

关键词：杉木 NAC转录因子基因表达 SNP 连锁不平衡

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杉木Cl4CL基因的克隆及表达分析

分子植物育种 2020年第6期18卷 1832-1837页

作者：张改革黎建辉林二培卢泳全浙江农林大学林业与生物技术学院亚热带森林培育国家重点实验室杭州311300

4-香豆酸辅酶A连接酶(4CL)催化肉桂酸、对-香豆酸等生成相应的辅酶A脂,是调控木质素单体合成的关键酶。本研究在杉木中克隆了4CL基因,长度为1 596 bp,包含完整开放阅读框,编码531个氨基酸,命名为Cl4CL基因。Cl4CL酶包含20种氨基酸,其中... 详细信息

4-香豆酸辅酶A连接酶(4CL)催化肉桂酸、对-香豆酸等生成相应的辅酶A脂,是调控木质素单体合成的关键酶。本研究在杉木中克隆了4CL基因,长度为1 596 bp,包含完整开放阅读框,编码531个氨基酸,命名为Cl4CL基因。Cl4CL酶包含20种氨基酸,其中酸性氨基酸含量微高,并含有信号肽,属于分泌蛋白。Cl4CL包含两种高度保守的肽基序,分别为肽基序BoxⅠ(SGTTSRPKGV)和肽基序BoxⅡ(GEVCIRG),其中肽基序BoxⅠ属于AMP结合功能域,肽基序BoxⅡ含有催化反应基团。通过对Cl4CL基因的表达分析发现低氮胁迫下Cl4CL呈现下调表达。

关键词：杉木(Cunninghamia lanceolata) Cl4CL 下调表达

杉木根边缘细胞生物学特性及其对铝胁迫的响应

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林业科学 2022年第7期58卷 73-81页

作者：李舟阳陆文玲钱旺黄奕孜林二培黄华宏童再康浙江农林大学亚热带森林培育国家重点实验室杭州311300

【目的】分析杉木根边缘细胞的生物学特性及其对铝胁迫的响应,为进一步研究杉木对铝胁迫的响应机制和耐铝种质筛选提供参考。【方法】利用悬空气培法研究不同根长杉木幼苗根边缘细胞的数量、活性等生物学特性,并通过铝离子处理分析杉木... 详细信息

【目的】分析杉木根边缘细胞的生物学特性及其对铝胁迫的响应,为进一步研究杉木对铝胁迫的响应机制和耐铝种质筛选提供参考。【方法】利用悬空气培法研究不同根长杉木幼苗根边缘细胞的数量、活性等生物学特性,并通过铝离子处理分析杉木根边缘细胞对铝胁迫的响应。【结果】杉木种子刚萌发时,根尖处就开始产生边缘细胞,且边缘细胞数量随着根的伸长而逐渐增多,在根长1.5 cm时达到最大值,平均7497个。边缘细胞活性在根长小于0.5 cm时可达95%,随着根的伸长会逐渐降低,但基本稳定在80%左右。在根边缘细胞发育过程中,根冠果胶甲酯酶(PME)活性随着根的伸长呈现出先高后低的趋势,进一步的表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)处理表明PME活性与边缘细胞游离至根际环境有关。铝胁迫处理结果表明,铝离子会显著抑制杉木幼苗根的伸长,且这种抑制作用在擦除根边缘细胞后会更加明显;低浓度的铝离子(100-200μmol•L^(-1))会促使边缘细胞分泌更多黏液,黏液层阻止铝离子吸附在根尖部位,从而对根尖起到一定保护作用。【结论】杉木幼苗根尖会产生大量具有活性的边缘细胞,其游离至根际环境的过程可能主要受到PME酶的调控;这些根边缘细胞会对铝离子胁迫作出响应,分泌更多黏液,从而起到减轻铝毒害或保护根尖免受铝毒害的作用。

关键词：杉木根边缘细胞果胶甲酯酶铝胁迫

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早竹TB1同源基因的克隆和表达分析

林业科学 2007年第8期43卷 41-47页

作者：金群英林二培彭华正桑庆亮华锡奇浙江省林业科学研究院生物技术研究所杭州310023 浙江大学生命科学学院植物生理生化国家重点实验室杭州310058

竹笋的形成和生长发育过程涉及侧枝形态发生,探讨侧枝发育有关基因在竹笋发育过程中的作用,对于阐明竹笋发育基因调控机制有重要意义。利用禾本科TB1同源基因在序列上的保守性,在基因上游的非编码区设计简并引物,通过RT-PCR技术,从早竹... 详细信息

竹笋的形成和生长发育过程涉及侧枝形态发生,探讨侧枝发育有关基因在竹笋发育过程中的作用,对于阐明竹笋发育基因调控机制有重要意义。利用禾本科TB1同源基因在序列上的保守性,在基因上游的非编码区设计简并引物,通过RT-PCR技术,从早竹笋中克隆到一个1296bp的cDNA序列,该序列包含1个编码349个氨基酸的阅读框,在氨基酸水平上与玉米TB1相似性达64.7%,定名为PpTB1。序列分析比对表明,PpTB1基因的编码产物含有保守的SP区、TCP区和R区,属于基因家族的1个成员。进化分析进一步表明,竹子TB1相似基因是玉米TB1基因的同源基因,且竹子TB1同源基因的分歧时间介于水稻和现有其他TB1同源基因之间。RT-PCR分析表明,该基因在笋、叶片和花中均有表达。原位杂交分析表明,PpTB1在笋的侧芽中表达较多。研究表明,PpTB1很可能与禾本科其他植物的TB1同源基因相似,在竹笋发育过程中,参与侧枝的形成。另外,TB1同源基因也可能在竹子分类和进化研究上有重要价值。

关键词：早竹竹笋发育 TB1同源基因

杉木纤维素合成酶基因CesA的克隆及表达分析

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浙江农林大学学报 2015年第1期32卷 40-46页

作者：庞景童再康黄华宏林二培刘琼瑶浙江农林大学亚热带森林培育国家重点实验室培育基地浙江临安311300

通过逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）结合c DNA末端快速扩增（RACE）技术,从杉木Cunninghamia lanceolata中克隆到2个全长为3 235 bp和3 876 bp的纤维素合成酶基因c DNA序列,被分别命名为Cl Ces A1和Cl Ces A2,Gen Bank登录号分别为JQ84... 详细信息

通过逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）结合c DNA末端快速扩增（RACE）技术,从杉木Cunninghamia lanceolata中克隆到2个全长为3 235 bp和3 876 bp的纤维素合成酶基因c DNA序列,被分别命名为Cl Ces A1和Cl Ces A2,Gen Bank登录号分别为JQ844574和JQ844575。相应编码蛋白分别包含992和1 092个氨基酸残基,推测分子量为111 845.3 D和123 105.7 D,等电点为6.04和6.65。氨基酸序列分析发现,它们具有植物纤维素合成酶基因相应的结构特征——锌指结构,2个易变区CSRI和CSRII,2个保守区CRI和CRII,纤维素合成酶底物结合结构域＂D,D,D,QVLRW＂,以及8个跨膜区。荧光定量PCR分析表明：Cl Ces A1和Cl Ces A2基因在茎中表达丰度均为最高,且成熟木质部中表达量均高于皮层中的相应数值;2个基因在根和针叶中的表达量相对较低。以具特殊材质性状的矮生杉木和正常杉木木质部为材料的进一步表达分析发现：Cl Ces A1和Cl Ces A2在正常杉木木质部中的表达量大约是矮生杉木表达量的2~12倍。2个杉木Ces A基因可能在杉木木材形成过程中具有重要作用。

关键词：林木育种学杉木 CesA基因基因克隆序列分析表达分析