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光皮桦BlBLH1基因的克隆、表达及互作蛋白筛选

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林业科学 2022年第3期58卷 59-68页

作者：庄和必俞子承林二培黄华宏浙江农林大学亚热带森林培育国家重点实验室杭州311300

【目的】BLH基因家族是广泛存在于植物中的转录因子,其与KNOX等转录因子的互作被认为在植物的次生壁发育中起重要调控作用。本研究拟克隆光皮桦BlBLH1基因,分析其表达模式,并筛选能与其互作的蛋白。【方法】利用Blast等软件在光皮桦基... 详细信息

【目的】BLH基因家族是广泛存在于植物中的转录因子,其与KNOX等转录因子的互作被认为在植物的次生壁发育中起重要调控作用。本研究拟克隆光皮桦BlBLH1基因,分析其表达模式,并筛选能与其互作的蛋白。【方法】利用Blast等软件在光皮桦基因组序列中鉴定获得BlBLH1序列,克隆验证后对其进行多序列比对、系统进化等生物信息学分析;利用实时荧光定量PCR分析BlBLH1在光皮桦不同组织、器官和应拉木形成中的表达模式;通过酵母双杂交技术筛选BlBLH1互作的蛋白,并采用双分子荧光互补实验(BiFC)进一步验证其与部分蛋白在拟南芥细胞内的互作。【结果】BlBLH1基因序列全长为2128 bp,开放阅读框(ORF)为1830 bp,编码609个氨基酸,具有SKY、BEL和HD 3个保守结构域。系统进化分析显示,BlBLH1与拟南芥BLH1有最近的同源关系。表达分析显示BlBLH1在雄花序中的表达量最高;在木质化茎段中的表达量次之;在应拉木诱导过程中,BlBLH1在应拉木中的表达量均显著高于对照。通过酵母双杂交筛选获得结构蛋白、酶、转录因子等47个与BlBLH1互作较强的蛋白;BiFC验证结果表明,BlBLH1与BlKNOX4、BlKNOX9在拟南芥原生质体内存在互作关系。而且,三者在茎段和应拉木的表达趋势基本一致。【结论】可从光皮桦中分离获得BlBLH1基因,生物信息学、表达和蛋白互作分析的结果表明BlBLH1参与光皮桦木材形成过程,且存在与KNOX蛋白的互作关系。

关键词： BlBLH1 次生壁酵母双杂交双分子荧光互补

光皮桦果胶甲酯酶家族的鉴定与生物信息学分析

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分子植物育种 2023年第21期21卷 6961-6971页

作者：周凯汤定钦林二培浙江农林大学林业与生物技术学院杭州311300

果胶甲酯酶(pectin methylesterase, PME)是调节果胶甲酯化程度的酶,通过作用于细胞壁在植物的各个生长阶段和生理过程中发挥重要作用。目前在模式植物拟南芥中对PME研究较多,而在木本植物中研究较少。光皮桦(Betula luminifera)是中国... 详细信息

果胶甲酯酶(pectin methylesterase, PME)是调节果胶甲酯化程度的酶,通过作用于细胞壁在植物的各个生长阶段和生理过程中发挥重要作用。目前在模式植物拟南芥中对PME研究较多,而在木本植物中研究较少。光皮桦(Betula luminifera)是中国重要用材树种,研究光皮桦PME基因家族可助于了解光皮桦木材形成机制及逆境响应机制。为研究光皮桦PME基因家族的功能,利用生物信息学方法对光皮桦基因组中PME基因家族成员进行鉴定,并对其基因组信息、蛋白生理生化特征、系统进化树、保守基序和基因表达等方面进行了研究。结果表明,在光皮桦中共鉴定88个PME蛋白序列,包括37个Type-1 PME和51个Type-2PME;预测光皮桦PME蛋白大部分为稳定的碱性亲水蛋白;光皮桦PME基因家族与毛果杨和拟南芥在聚类结果一致;光皮桦PME序列中有10个比较保守的基序,其中motif 10是Type-1 PME特有的;大多数PME基因在各组织中都有表达,尤其在雄花序中突出表达,不同Group表达情况有一定的规律性。本研究为进一步研究PME基因家族在光皮桦中的功能奠定了基础。

关键词：光皮桦(Betula luminifera) 果胶甲酯酶基因鉴定生物信息学分析

杉木应压木形成中的显微特征及主要代谢成分变化

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核农学报 2022年第11期36卷 2307-2315页

作者：杜明秋钟珊丽林二培黄华宏浙江农林大学亚热带森林培育国家重点实验室浙江杭州311300

为了解析主要代谢成分与杉木(Cunninghamia lanceolata)应压木形成的关系,以3年生直立杉木苗为研究对象,与垂直方向倾斜45°放置30、60和90 d后观察其生长性状并测定木质纤维素含量,使用气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)对木质部代谢成分进... 详细信息

为了解析主要代谢成分与杉木(Cunninghamia lanceolata)应压木形成的关系,以3年生直立杉木苗为研究对象,与垂直方向倾斜45°放置30、60和90 d后观察其生长性状并测定木质纤维素含量,使用气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)对木质部代谢成分进行鉴定和解析。解剖发现应压木木质部管胞发生变形;化学成分测定发现总木质素和半纤维素含量增加,纤维素含量降低;GC-MS检测出应压木、对应木和直立木中共有成分20种,其中有机酸7种、单糖3种、二糖2种、醇类3种、氨基酸2种、酚类和糖苷类各1种;主成分分析结合显著性检验发现,3个时期应压木和直立木中有11种共有差异代谢物,其中乙醇酸、甘氨酸、核糖酸和棕榈酸在应压木中的含量显著低于对应木和直立木,苹果酸、松醇、肌醇、半乳糖和蔗糖在应压木中的含量显著高于对应木和直立木。本试验结果从代谢角度解释了杉木应压木形成中的生物学变化,可为揭示木材形成的分子机制提供新途径,并为高品质木材的定向培育和木材功能性改良提供理论依据。

关键词：应压木杉木有机酸类糖类气相色谱-质谱法(GC-MS)

杉木根边缘细胞生物学特性及其对铝胁迫的响应

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林业科学 2022年第7期58卷 73-81页

作者：李舟阳陆文玲钱旺黄奕孜林二培黄华宏童再康浙江农林大学亚热带森林培育国家重点实验室杭州311300

【目的】分析杉木根边缘细胞的生物学特性及其对铝胁迫的响应,为进一步研究杉木对铝胁迫的响应机制和耐铝种质筛选提供参考。【方法】利用悬空气培法研究不同根长杉木幼苗根边缘细胞的数量、活性等生物学特性,并通过铝离子处理分析杉木... 详细信息

【目的】分析杉木根边缘细胞的生物学特性及其对铝胁迫的响应,为进一步研究杉木对铝胁迫的响应机制和耐铝种质筛选提供参考。【方法】利用悬空气培法研究不同根长杉木幼苗根边缘细胞的数量、活性等生物学特性,并通过铝离子处理分析杉木根边缘细胞对铝胁迫的响应。【结果】杉木种子刚萌发时,根尖处就开始产生边缘细胞,且边缘细胞数量随着根的伸长而逐渐增多,在根长1.5 cm时达到最大值,平均7497个。边缘细胞活性在根长小于0.5 cm时可达95%,随着根的伸长会逐渐降低,但基本稳定在80%左右。在根边缘细胞发育过程中,根冠果胶甲酯酶(PME)活性随着根的伸长呈现出先高后低的趋势,进一步的表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)处理表明PME活性与边缘细胞游离至根际环境有关。铝胁迫处理结果表明,铝离子会显著抑制杉木幼苗根的伸长,且这种抑制作用在擦除根边缘细胞后会更加明显;低浓度的铝离子(100-200μmol•L^(-1))会促使边缘细胞分泌更多黏液,黏液层阻止铝离子吸附在根尖部位,从而对根尖起到一定保护作用。【结论】杉木幼苗根尖会产生大量具有活性的边缘细胞,其游离至根际环境的过程可能主要受到PME酶的调控;这些根边缘细胞会对铝离子胁迫作出响应,分泌更多黏液,从而起到减轻铝毒害或保护根尖免受铝毒害的作用。

关键词：杉木根边缘细胞果胶甲酯酶铝胁迫

植物体细胞胚胎发生及其分子调控机制研究进展

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浙江农林大学学报 2022年第1期39卷 223-232页

作者：王诗忆黄奕孜李舟阳黄华宏林二培浙江农林大学省部共建亚热带森林培育国家重点实验室浙江杭州311300

植物的每个细胞都包含着该物种的全部遗传信息,具备发育成完整植株的遗传能力,这被称为植物细胞的全能性。体细胞胚胎(体胚)发生是指在没有受精的情况下,由体细胞或营养细胞发育成胚胎,是诱导植物细胞全能性的一种形式。体胚发生在种质... 详细信息

植物的每个细胞都包含着该物种的全部遗传信息,具备发育成完整植株的遗传能力,这被称为植物细胞的全能性。体细胞胚胎(体胚)发生是指在没有受精的情况下,由体细胞或营养细胞发育成胚胎,是诱导植物细胞全能性的一种形式。体胚发生在种质资源保存、种苗生产、分子育种和植物基础研究等方面都有着广泛的应用,已成为重要的植物生物技术工具和研究平台。多年来的分子遗传学研究表明:体胚发生受到由众多转录因子、激素信号途径及表观遗传修饰等构成的复杂网络的调控。本研究概述了植物体胚发生的途径,并重点综述了体胚发生关键基因的功能与调控机制、体胚发生的表观遗传修饰以及体胚发生关键基因在基因工程中的应用。随着研究的深入和新技术的出现,体胚发生过程中涉及的代谢组分动态变化、转录调控、激素信号转导与表观遗传调控等复杂生物学过程有望得到更深入地阐释,将更进一步地解析植物体胚发生的分子调控机制。此外,利用体胚发生关键基因的功能与调控机制,开发更高效的体胚诱导和遗传转化方法,有望为更多植物的基因功能研究和遗传改良提供新的思路和技术。参81。

关键词：体胚发生转录因子调控机制表观遗传修饰

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杉木OFP基因家族的表达模式及亚细胞定位

农业生物技术学报 2023年第8期31卷 1610-1622页

作者：应威洋胡现铬黄华宏林二培童再康浙江农林大学亚热带森林培育国家重点实验室

卵形家族蛋白(OVATE family protein, OFP)是植物特有的一类调控植物形态建成和次生壁发育的转录因子，目前在杉木(Cunninghamia lanceolata)中尚未见该基因家族的相关报道。本研究基于全长转录组数据，鉴定杉木OFP基因家族成员，进行... 详细信息

卵形家族蛋白(OVATE family protein, OFP)是植物特有的一类调控植物形态建成和次生壁发育的转录因子，目前在杉木(Cunninghamia lanceolata)中尚未见该基因家族的相关报道。本研究基于全长转录组数据，鉴定杉木OFP基因家族成员，进行序列和进化树构建分析，并检测其在不同组织和器官中的表达模式及编码蛋白的亚细胞定位情况。结果显示，鉴定到6个杉木OFP基因，均包含典型的OVATE结构域且不含内含子，分散于5个亚组中。实时荧光定量PCR显示，6个ClOFPs的表达模式不尽相同，其中ClOFP1在杉木幼叶中的表达量最高，在茎中的表达量呈现随木质化程度提高而下降的趋势；ClOFP2在雌球花中的表达量最高，ClOFP3在根中的表达最高且2个基因在低木质化茎(S1)中的表达量较在其他茎中高；ClOFP4在雌、雄球花和叶片中的表达量普遍较高；ClOFP5在雄球花中的表达量最高，且在茎中的表达量随木质化程度提高而上升；ClOFP6在茎段、雌球花中的表达量相对较高。此外，所有ClOFPs基因在叶片中的表达呈现随叶片成熟程度增加而减弱的趋势。亚细胞定位结果显示，ClOFP1蛋白定位在细胞壁上，ClOFP2/3蛋白定位在细胞膜上，ClOFP4/5/6蛋白定位在细胞核中，表明杉木ClOFPs基因很可能具有不同的调控途径。因此，ClOFPs基因在杉木的球花、叶和茎等器官的发育以及木质素合成方面具不同的调控作用。研究结果为深入研究杉木器官形态建成和木材形成提供理论依据，同时也为杉木分子育种提供潜在的基因资源。

关键词：杉木卵形家族蛋白(OFP)基因家族基因克隆表达模式亚细胞定位

光皮桦AP2/ERF基因家族鉴定与表达分析

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浙江农林大学学报 2022年第6期39卷 1183-1193页

作者：黄奕孜钱旺邱姗王文新黄华宏林二培浙江农林大学省部共建亚热带森林培育国家重点实验室浙江杭州311300

【目的】深入研究AP2/ERF基因家族在光皮桦Betula luminifera生长发育及环境胁迫响应中的生物学功能。【方法】利用光皮桦基因组数据,通过生物信息学方法开展AP2/ERF基因家族鉴定、基因特征、系统进化、基因结构、保守基序、顺式作用元... 详细信息

【目的】深入研究AP2/ERF基因家族在光皮桦Betula luminifera生长发育及环境胁迫响应中的生物学功能。【方法】利用光皮桦基因组数据,通过生物信息学方法开展AP2/ERF基因家族鉴定、基因特征、系统进化、基因结构、保守基序、顺式作用元件、蛋白互作和表达分析。【结果】在光皮桦基因组中共鉴定到77个AP2/ERF基因,其编码的蛋白理化性质存在差异,大多数蛋白(60个)的理论等电点小于7.0。系统进化分析显示:这77个AP2/ERF转录因子属于5个亚家族,其中ERF亚家族最大,包含34个成员。光皮桦AP2/ERF各亚家族间的基因结构存在较大差异,其中AP2亚家族成员均具有6~9个内含子,而DREB亚家族基因则没有内含子;但AP2/ERF各亚家族内的不同成员具有相似的保守基序类型和分布。同时,AP2/ERF基因启动子上都存在大量与激素、调节、胁迫响应及生长发育相关的顺式作用元件。此外,互作网络分析预测不同的光皮桦AP2/ERF亚家族蛋白间存在广泛的互作关系。进一步的表达分析显示:绝大多数光皮桦AP2/ERF基因(71个)的表达存在较强组织特异性,且在高温胁迫下,多数ERF或DREB基因的表达发生显著变化,表明ERF和DREB基因在高温胁迫应答中可能发挥着重要作用。【结论】通过生物信息学分析获得光皮桦77个AP2/ERF基因,分属于5个亚家族。不同亚家族基因具有相似的基因结构、保守基序等特征。基因启动子区含激素、胁迫响应等相关的作用元件。基因表达具有较强的组织特异性,且多数ERF或DREB基因对高温胁迫有明显响应。图6表1参39。

关键词：光皮桦 AP2/ERF家族表达模式高温胁迫

光皮桦木质部cDNA-AFLP技术体系的建立及应用

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北京林业大学学报 2013年第6期35卷 48-54页

作者：江成林二培黄华宏童再康浙江农林大学亚热带森林培育国家重点实验室培育基地

为了挖掘光皮桦材性相关基因,本研究以光皮桦木质部为材料,通过对RNA的提取、cDNA的反转录及纯化的对比分析,以及选扩体系优化等,建立了相应的cDNA-AFLP体系。结果表明:采用CTAB和RNAiso试剂相结合的方法得到的RNA质量较好,cDNA经纯化... 详细信息

为了挖掘光皮桦材性相关基因,本研究以光皮桦木质部为材料,通过对RNA的提取、cDNA的反转录及纯化的对比分析,以及选扩体系优化等,建立了相应的cDNA-AFLP体系。结果表明:采用CTAB和RNAiso试剂相结合的方法得到的RNA质量较好,cDNA经纯化后选扩效果明显变好。选扩体系为:4.0μL预扩产物(稀释40倍)、1.6μL的引物(10.0μmol/L)、0.2μL的dNTP(2.5 mmol/L)、0.4μL的Mg2+(25.0 mmol/L),以及0.2μL的Taq DNA聚合酶(5 U/μL)。进一步以来自不同木质化茎段的cDNA为模板,筛选出31对扩增效果较好的引物组合,同时分离出一些差异表达的基因片段,经测序后探讨了其在木质化发育过程中可能的功能。

关键词：光皮桦 cDNA-AFLP 木质化基因表达

发根农杆菌介导的闽楠遗传转化体系构建与优化

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核农学报 2023年第8期37卷 1516-1522页

作者：吴梦洁洪家都李芳燕周生财林二培程龙军浙江农林大学林业与生物技术学院/亚热带森林培育国家重点实验室浙江杭州311300 丽水职业技术学院浙江丽水323000

闽楠[Phoebe bournei(Hemsl.)Yang]为我国重要的珍贵树种。为建立闽楠遗传转化体系,以闽楠幼苗为材料,利用pCAMBIA1300-GFP质粒转化的发根农杆菌介导植株转化。在比较注射和菌液浸泡两种侵染方式侵染效率的基础上,进一步利用正交[L9(3^(... 详细信息

闽楠[Phoebe bournei(Hemsl.)Yang]为我国重要的珍贵树种。为建立闽楠遗传转化体系,以闽楠幼苗为材料,利用pCAMBIA1300-GFP质粒转化的发根农杆菌介导植株转化。在比较注射和菌液浸泡两种侵染方式侵染效率的基础上,进一步利用正交[L9(3^(3))]试验从菌株种类、菌液侵染浓度和侵染植株苗龄三个方面优化了遗传转化体系。另外,对不同光强影响闽楠毛状根诱导及转化率情况进行了分析。结果表明,注射法的毛状根诱导率和遗传转化率分别为80.0%、66.7%;而菌液浸泡法的诱导率和遗传转化率分别为41.2%、35.3%。正交试验中,影响闽楠毛状根诱导率和遗传转化率的主要因素为菌株种类。最大诱导率和转化效率分别达到了87.5%、70.6%。该体系的最优组合为:K599菌株在菌液浓度OD_(600)=1.2条件下注射侵染三叶期的闽楠幼苗。此外,较弱光强(50μmol·m^(-2)·s^(-1))的培养条件比较强光照(100μmol·m^(-2)·s^(-1))更有利于闽楠幼苗的生长和遗传转化。本研究创建并优化了一套高效、稳定的闽楠遗传转化体系,成功获得了具有转基因毛状根的闽楠植株,为闽楠重要基因挖掘、新种质创建和遗传改良奠定了基础。

关键词：闽楠遗传转化发根农杆菌

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