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环丙沙星单克隆抗体的制备及其免疫学特性鉴定

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中国农学通报 2010年第18期26卷 12-16页

作者：职爱民刘庆堂李青梅杨苏珍柴书军赵东张志杰邓瑞广张改平河南省农业科学院农业部动物免疫学重点开放实验室郑州450002 河南花花牛乳业股份有限公司郑州450002

用EDC法将BSA和OVA分别和环丙沙星(Ciprofloxacin,CIP)偶联作为免疫原和包被原,并经紫外扫描(UVScan)、聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定。用合成的BSA-CIP免疫BALB/c小鼠,经过3次免疫后,用间接ELISA和阻断ELISA选择细胞融合备用鼠,选... 详细信息

用EDC法将BSA和OVA分别和环丙沙星(Ciprofloxacin,CIP)偶联作为免疫原和包被原,并经紫外扫描(UVScan)、聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定。用合成的BSA-CIP免疫BALB/c小鼠,经过3次免疫后,用间接ELISA和阻断ELISA选择细胞融合备用鼠,选择高效价、敏感的小鼠进行抗原超强免疫;取其脾细胞应用杂交瘤技术与骨髓瘤细胞建立分泌CIP单克隆抗体的杂交瘤细胞株;用体内诱生腹水法制备CIPmAb,对CIPmAb的效价、敏感性和特异性等免疫学特性进行鉴定。聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定表明BSA-CIP人工抗原偶联成功;免疫的3只小鼠血清抗体效价均达到10-4;其中2号小鼠血清CIP抑制效价较高且IC50最低,达48.59μg/L,融合后筛选出Z3G12B3和Z2H8C10两株敏感特异的杂交瘤细胞,其两株细胞培养上清液效价为1:512,腹水效价为1:2.56×105,Z3G12B3株对CIP的IC50为2.47μg/L,与二氟沙星、沙拉沙星有小于0.03%的交叉反应性,与其他抑制物无交叉反应性。该试验获得了高效价、敏感、特异的抗CIPmAb,为CIP残留ELISA检测试剂盒和试纸条的建立奠定了坚实的基础。

关键词：环丙沙星半抗原单克隆抗体杂交瘤免疫学特性

以合成肽为抗原检测O型口蹄疫病毒抗体ELISA方法的建立和评价

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畜牧兽医学报 2009年第12期40卷 1826-1830页

作者：杨苏珍杨继飞鲍登克刘庆堂罗俊樊剑鸣李学伍邓瑞广张改平河南省农业科学院动物免疫学重点实验室郑州450002 河南农业大学牧医工程学院郑州450002

作者以固相法合成特异性FMDV主要保护性抗原VP1上的表位肽,将其与载体蛋白BSA偶联,作为包被抗原,制备检测抗O型口蹄疫病毒(FMDV)抗体的ELISA试剂盒,并对该试剂盒进行方法考核。结果表明该方法的敏感性为95.12%,特异性为100%。检测199份... 详细信息

作者以固相法合成特异性FMDV主要保护性抗原VP1上的表位肽,将其与载体蛋白BSA偶联,作为包被抗原,制备检测抗O型口蹄疫病毒(FMDV)抗体的ELISA试剂盒,并对该试剂盒进行方法考核。结果表明该方法的敏感性为95.12%,特异性为100%。检测199份血清标本,与UBI FMD VP1试剂盒的符合率达到98.49%,与液相阻断ELISA试剂盒的符合率达到96.98%。该多肽ELISA试剂盒特异、敏感、稳定、操作简便,可用来监控口蹄疫抗体水平。

关键词： FMDV 抗体 ELISA 合成肽

猪口蹄疫O型合成肽疫苗抗原多肽的串联表达及活性鉴定

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河南农业科学 2011年第10期40卷 126-130页

作者：卢清侠郭军庆郝慧芳杨苏珍邢广旭杨继飞王世红张改平河南省农业科学院农业部动物免疫学重点实验室/河南省动物免疫学重点实验室河南郑州450002

为获得含合成肽疫苗抗原多肽的重组表达蛋白,根据猪口蹄疫O型合成肽疫苗中抗原多肽的氨基酸序列,使用大肠杆菌偏好性密码子人工合成该抗原多肽的双拷贝基因序列,并克隆至表达载体pET32a中,构建原核表达质粒pET32a-P2。将重组质粒转化BL2... 详细信息

为获得含合成肽疫苗抗原多肽的重组表达蛋白,根据猪口蹄疫O型合成肽疫苗中抗原多肽的氨基酸序列,使用大肠杆菌偏好性密码子人工合成该抗原多肽的双拷贝基因序列,并克隆至表达载体pET32a中,构建原核表达质粒pET32a-P2。将重组质粒转化BL21(DE3),经IPTG诱导表达,收集诱导的菌液进行SDS-PAGE电泳和Western-blot分析。结果显示,在分子量27 kD处有1条明显的蛋白表达条带,且能被O型FMDV阳性血清识别。对表达产物进行可溶性分析,结果显示,表达蛋白几乎全部以可溶形式存在。表达蛋白经Ni-NTA树脂亲和纯化,SDS-PAGE显示纯化的目的蛋白在27 kD处有单一目的条带,具有较高的纯度。ELISA检测结果显示,纯化的重组蛋白具有较高的活性。结果表明,该抗原多肽的双拷贝串联重复序列在大肠杆菌中得到了可溶性高效表达,为开发诊断试剂和基因工程疫苗奠定了基础。

关键词：猪口蹄疫合成肽疫苗抗原多肽串联表达蛋白纯化活性鉴定

牛、羊、猪人工感染口蹄疫病毒3ABC抗体的变化

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甘肃农业大学学报 2006年第5期41卷 22-26页

作者：杨苏珍卢曾军曹轶梅李冬刘在新贾宁甘肃农业大学动物医学院甘肃兰州730070 中国农业科学院兰州兽医研究所国家家畜疫病病原生物学重点实验室农业部畜禽病毒学重点实验室国家口蹄疫参考实验室甘肃兰州730046

利用口蹄疫病毒(FMDV)3ABC抗体间接ELISA方法(3ABC-I-ELISA),检测了接种病毒牛、羊、猪和同居牛、羊、猪FMDV非结构蛋白3ABC抗体的变化.实验表明,4头牛在舌面接种感染FMDV 48 h后全数发病,第3天即出现可疑的3ABC抗体,第5天检测到阳性的3... 详细信息

利用口蹄疫病毒(FMDV)3ABC抗体间接ELISA方法(3ABC-I-ELISA),检测了接种病毒牛、羊、猪和同居牛、羊、猪FMDV非结构蛋白3ABC抗体的变化.实验表明,4头牛在舌面接种感染FMDV 48 h后全数发病,第3天即出现可疑的3ABC抗体,第5天检测到阳性的3ABC抗体,至第8天3ABC抗体全部为阳性;10头同居牛(分别与接种感染猪和羊同居)在同居第7天时未检出3ABC抗体,在同居第15天时,3ABC抗体阳性率仅为30%;肌肉接种病毒羊3ABC抗体产生时间与接种病毒牛一致.同居羊在同居后第8天开始产生3ABC抗体,至第15天时所有表现出临床症状的羊3ABC抗体全部为阳性.猪无论是肌肉注射感染还是同居感染,其3ABC抗体与临床症状均具有很好的对应关系;发病猪最早可于接种病毒后第7天检测到可疑的3ABC抗体,至第15天均为阳性.牛、羊和猪均存在隐性感染的情况,即未出现临床症状,但3ABC抗体为阳性.

关键词：口蹄疫病毒非结构蛋白 3ABC抗体人工感染牛羊猪

BHK-21细胞稳定测定猪乙型脑炎病毒半数细胞感染量效价(TCID_(50))的条件优化及应用

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中国动物传染病学报 2010年第6期18卷 15-21页

作者：滕蔓罗俊樊剑鸣邢广旭赵东杨苏珍张改平河南省农业科学院农业部动物免疫学重点开放实验室河南省动物免疫学重点实验室郑州450002 郑州大学公共卫生学院郑州450001

为建立BHK-21细胞测定乙型脑炎病毒(Japenese encephalitis virus,JEV)病毒效价的方法,对96孔细胞板中不同初始接种量BHK-21细胞在多种维持液中的生长状态进行探讨,发现当BHK-21细胞以1250～2500个/孔接种96孔板培养24 h后,更换含3%新... 详细信息

为建立BHK-21细胞测定乙型脑炎病毒(Japenese encephalitis virus,JEV)病毒效价的方法,对96孔细胞板中不同初始接种量BHK-21细胞在多种维持液中的生长状态进行探讨,发现当BHK-21细胞以1250～2500个/孔接种96孔板培养24 h后,更换含3%新生牛血清的DMEM后在37℃、5%CO2条件下可至少良好维持72～96 h。在此条件下并基于Reed-Muench法测定病毒效价的原理,本文建立了准确测定JEV TCID50的方法,利用该方法对JEV野毒分离株及商品疫苗进行测定,均获得稳定、准确的病毒效价。本实验为JEV的体外培养、病毒定量、疫苗评价等提供了一种准确、稳定、易判定的参考方法。

关键词：乙型脑炎病毒 BHK-21细胞效价测定 TCID50

口蹄疫抗体免疫层析试纸的临床应用及性能评价

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河南农业科学 2012年第10期41卷 148-152页

作者：杨苏珍杨继飞李清州卢清侠万博鲍登克刘运超柴书军张改平河南省农业科学院农业部动物免疫学重点开放实验室/河南省动物免疫学重点实验室河南郑州450002 河南省农业科学院农业经济与信息研究中心河南郑州450002

为评价前期研制的猪口蹄疫O型抗体检测试纸的临床应用效果,检测了162头份口蹄疫病毒(FMDV)多肽疫苗免疫猪血清和87头份灭活疫苗免疫猪血清,并与UBI FMDV抗体检测ELISA和美国BioXL FMDV抗体检测ELISA做平行对比试验。结果显示,试纸与2种E... 详细信息

为评价前期研制的猪口蹄疫O型抗体检测试纸的临床应用效果,检测了162头份口蹄疫病毒(FMDV)多肽疫苗免疫猪血清和87头份灭活疫苗免疫猪血清,并与UBI FMDV抗体检测ELISA和美国BioXL FMDV抗体检测ELISA做平行对比试验。结果显示,试纸与2种ELISA方法的符合率分别为95.06%和96.55%。说明该试纸可以用于猪FMDV O型抗体的临床检测,为评价口蹄疫疫苗免疫效果提供了快速、简便的方法。

关键词：口蹄疫病毒免疫层析试纸 ELISA

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抗庆大霉素单克隆抗体的制备及其初步应用

中国农业科学 2010年第12期43卷 2584-2589页

作者：职爱民李青梅刘庆堂刘宣兵杨继飞杨苏珍柴书军杨艳艳邓瑞广张改平河南省农业科学院/农业部动物免疫学重点开放实验室

【目的】制备抗庆大霉素(gentamicin,GM)的高亲和力特异性单克隆抗体,并鉴定其免疫学特性,为进一步研究GM快速检测试剂盒和试纸条打下基础。【方法】用EDC法将BSA和OVA分别和GM偶联作为免疫原或包被原,并经聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE... 详细信息

【目的】制备抗庆大霉素(gentamicin,GM)的高亲和力特异性单克隆抗体,并鉴定其免疫学特性,为进一步研究GM快速检测试剂盒和试纸条打下基础。【方法】用EDC法将BSA和OVA分别和GM偶联作为免疫原或包被原,并经聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定。用合成的BSA-GM免疫Balb/c小鼠,经过4次免疫后,用间接ELISA和阻断ELISA选择细胞融合备用鼠,选择高效价、敏感的小鼠进行抗原超强免疫;取其脾细胞应用杂交瘤技术与骨髓瘤细胞建立分泌GM单克隆抗体(monoclonal antibody,mAb)的杂交瘤细胞株;用体内诱生腹水法制备GM mAb,对GM mAb的效价、敏感性和特异性等免疫学特性进行鉴定,;应用阻断ELISA试验原理组装GM-Kit,并对鲜奶中添加的GM标准样品进行测定。【结果】SDS-PAGE电泳鉴定表明BSA-GM人工抗原偶联成功;免疫的3只小鼠血清抗体效价均达到10-3;其中2号小鼠血清GM抑制效价较高且IC50最低,达17.28 ***-1,融合后筛选出5E2-D7、1A3-A9、5E2-A12和2A6-B5共6株敏感特异的杂交瘤细胞,其细胞培养上清液效价分别为1﹕1600、1﹕800、1﹕800和1﹕800,腹水效价分别为1﹕2.05×107、1﹕5.12×106、1﹕2.56×106和1﹕2.56×106,5E2-D7株对GM的IC50为0.30 ***-1,与链霉素、卡那霉素等其他氨基糖苷类抗生素无交叉反应性;检测鲜牛奶样的平均添加回收率分别为96.0%,平均变异系数均低于15%。【结论】本试验获得了高效价、敏感、特异的抗GM mAb,为GM残留检测奠定了坚实的基础。

关键词：庆大霉素单克隆抗体杂交瘤初步应用

脱氧雪腐镰刀菌烯醇单克隆抗体的制备及间接竞争ELISA方法建立

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中国兽医学报 2021年第4期41卷 689-696页

作者：孙亚宁李青梅杨苏珍胡骁飞杨继飞张颖硕陈琳琳邢云瑞邓瑞广张改平河南省农业科学院动物免疫学重点实验室河南郑州450002 河南农业大学牧医工程学院河南郑州450002

为了快速准确地检测脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)污染、控制其危害,本研究制备了高灵敏度的DON单克隆抗体,并建立了间接竞争酶联免疫吸附(ELISA)快速检测方法。采用N,N′-羰基二咪唑(N,N′-Carbonyldiimidazole,CDI)一步法将DON与载体蛋白BS... 详细信息

为了快速准确地检测脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)污染、控制其危害,本研究制备了高灵敏度的DON单克隆抗体,并建立了间接竞争酶联免疫吸附(ELISA)快速检测方法。采用N,N′-羰基二咪唑(N,N′-Carbonyldiimidazole,CDI)一步法将DON与载体蛋白BSA及OVA偶联制备人工抗原。用DON-BSA免疫小鼠,并根据免疫效果在常规免疫方案中增加腹腔免疫进行改进,利用细胞融合技术,获得能稳定分泌DON单克隆抗体的杂交瘤细胞株1株2A3-E11。经鉴定该细胞株分泌的DON抗体为IgG1型,效价达1∶1.024×10^(6),IC_(50)为21.5079μg/L,亲和力可达9.064×10^(8) mol/L;与15-AcDON有233.7%的交叉反应,与其他结构类似物及常见真菌毒素未见明显交叉反应。基于该抗体建立的间接竞争ELISA检测方法检测范围为4.6968~98.4900μg/L,小麦样品中的加标回收率为90.509%~116.016%,变异系数为3.081%~7.928%。研制的间接竞争ELISA检测方法灵敏度高、结果可靠,可进一步应用于小麦等谷物样品中DON污染的检测,为DON的免疫学检测技术研发奠定基础。

关键词：脱氧雪腐镰刀菌烯醇免疫程序单克隆抗体酶联免疫吸附测定

新城疫病毒F基因真核表达载体的构建及瞬时表达

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西北农林科技大学学报（自然科学版） 2007年第10期35卷 6-10页

作者：王青张彦明王选年张改平胡建和杨苏珍赵东邢广旭徐彦召赵光辉段艳华西北农林科技大学动物科技学院陕西杨凌712100 河南科技学院动物科学学院河南新乡453003 河南省农业科学院河南省动物免疫学重点实验室河南郑州450002 河南农业大学牧医工程学院河南郑州450002

应用PCR扩增出新城疫病毒F基因,将其克隆入pGEM-T载体,测序。然后将NDVF基因与高效的真核表达载体pcDNA4/HisMax相连,构建NDVF基因重组真核表达质粒pc4F,采用Superfect转染试剂将pc4F瞬时转染COS-7细胞,应用细胞免疫组化法检测其在细胞... 详细信息

应用PCR扩增出新城疫病毒F基因,将其克隆入pGEM-T载体,测序。然后将NDVF基因与高效的真核表达载体pcDNA4/HisMax相连,构建NDVF基因重组真核表达质粒pc4F,采用Superfect转染试剂将pc4F瞬时转染COS-7细胞,应用细胞免疫组化法检测其在细胞中的表达情况。结果表明,F基因能够在COS-7细胞中成功表达。

关键词：新城疫病毒 F基因真核表达