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高耐硒灵芝的筛选、硒蛋白的提取及破壁专用酶的研究

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高耐硒灵芝的筛选、硒蛋白的提取及破壁专用酶的研究

作者：杨梦莲江南大学

学位级别：硕士

硒是人体不可或缺的微量元素,是人体多种含硒蛋白的重要组成成分。无机硒对人体毒性较大且难以吸收,以灵芝(Ganoderma lucidum)作为富硒的中间载体,通过生物转化可以将无机硒转变为对人体有益,毒性较小的有机硒。硒蛋白是真菌有机硒的... 详细信息

硒是人体不可或缺的微量元素,是人体多种含硒蛋白的重要组成成分。无机硒对人体毒性较大且难以吸收,以灵芝(Ganoderma lucidum)作为富硒的中间载体,通过生物转化可以将无机硒转变为对人体有益,毒性较小的有机硒。硒蛋白是真菌有机硒的主要存在形式,除了作为硒的补充剂,硒蛋白以及含硒肽分子还具有抗肿瘤、免疫调节等特殊的生理功能。在食品产业中如何有效利用富硒蛋白资源受到研究者的重视。大型真菌的蛋白提取工艺多数以超声辅助碱法为主,超声辅助碱法具有提取效率高、工艺操作简便等优点,但超声时间过长或碱液浓度过高会对蛋白结构产生破坏,最终蛋白提取得率难以提升。酶法提取工艺反应条件温和,但存在成本过高等缺点。因此开发高效率的硒蛋白提取工艺,对硒蛋白的开发利用及深加工具有重要的现实意义。本文通过筛选及诱变育种获得了一株高耐硒灵芝。以获得硒蛋白为目标,将异源表达获得的β-1,3-葡聚糖酶和果胶酶对灵芝细胞进行水解,通过酶水解辅助短时超声破壁及碱裂解的方法,提高了灵芝硒蛋白提取得率。主要研究内容如下:(1)从我国高硒自然环境中筛选获得一株耐硒灵芝的菌丝体ST308,通过Co-γ射线诱变育种获得高耐硒灵芝突变菌株ML2613。发酵结果显示,ST308和ML2613在发酵培养基中生长速度大致相同。在高硒液体发酵培养基中出发菌ST308的生长受到明显的抑制,而ML2613的生长速度显著高于出发菌,在第5天ML2613菌体干重为17.3g·L。(2)ML2613在15 L发酵罐中NaSe O·5HO添加浓度为180 mg·L。发酵72 h时,菌体干重为16.4 g·L,富硒灵芝菌丝体硒含量为821.4 mg·L。使用超声辅助碱法提取灵芝粗蛋白,蛋白提取得率为37.2%,蛋白等电点p H为3.0。用饱和硫酸铵进一步纯化,冻干得到灵芝蛋白,蛋白总硒含量为623.0 mg·kg。通过HPLC-ICP-MS联用分析技术分析灵芝硒蛋白中硒代氨基酸形态,对三种硒代氨基酸进行定量分析。硒代胱氨酸、甲基硒代半胱氨酸和硒代甲硫氨酸含量分别为452.7 mg·kg、6.5 mg·kg和147.2mg·kg,进一步推算出硒蛋白中硒代氨基酸的硒含量为276.2 mg·kg,占硒蛋白总硒的44.3%。(3)异源表达了来源于纤维微菌CICIM6906的β-1,3-葡聚糖酶基因。以E.coli BL21(DE3)为宿主菌构建重组菌BL21/6906,表达β-1,3-葡聚糖酶,获得重组酶BGL6906。以茯苓多糖为底物时,重组酶BGL6906纯酶比酶活为567.8 U·mg,最适p H为5.5,最适温度为50℃。重组菌在15 L发酵罐中发酵72 h时,胞外酶活达到67.0 U·m L。用BGL6906和市售果胶酶交替水解灵芝菌丝体,菌丝体形态发生明显变化,并有少量原生质体的出现。以此建立了灵芝细胞裂解工艺:对两次酶解两次过滤后的菌丝体使用超声辅助碱法提取灵芝蛋白,在超声5 min时蛋白提取得率达到76%。(4)市售果胶酶中的蛋白酶对BGL6906具有很强的降解作用,因此需要获得低蛋白酶活性的果胶酶,为此研究了果胶酶在巴斯德毕赤酵母不同宿主中的表达及其与BGL6906联合水解灵芝菌丝体的方法。以毕赤酵母GS115为宿主菌,构建重组菌GS115/pg605、GS115/pmj5a,分别表达聚半乳糖醛酸酶和果胶酯酶,重组酶酶活分别为:114.0 U·m L和5.6 U·m L。将GS115/pg605和GS115/pmj5a进行摇瓶发酵并浓缩,将浓缩后的酶液以酶活5:1的比例制成混合酶液,命名为果胶酶PGMJ5A。以蛋白酶缺陷的毕赤酵母SMD1168为宿主菌分别构建重组菌SMD1168/pg605和SMD1168/pmj5a。SMD1168/pg605在15 L发酵罐中发酵156 h时酶活达到最高,为194.5 U·m L;SMD1168pmj5a在156 h时酶活达到最高,为16.2 U·m L。收集发酵液浓缩,浓缩后的酶液以酶活5:1的比例制成混合酶液,命名为果胶酶SPGMJ5A。使用BGL6906和PGMJ5A协同水解灵芝菌丝体,菌丝体形态未发生明显改变。研究发现GS115表达的PGMJ5A仍然具有较高的蛋白酶活性,导致BGL6906被降解而无法水解灵芝细胞壁。用BGL6906和SPGMJ5A对灵芝菌丝体细胞壁进行酶解,虽然未出现大量的原生质体,但菌丝体形态出现明显改变,其细胞壁强度呈现一定的弱化现象。后续使用超声辅助碱法提取灵芝蛋白,在超声10 min时蛋白提取得率达54%,而对照组在相同的时间内蛋白提取率只有27%。

关键词：灵芝富硒蛋白提取 β-1,3-葡聚糖酶果胶酶细胞破碎

南大西洋中段被动陆缘盆地下白垩统盐构造成因模式

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地质学报 2022年第4期96卷 1182-1196页

作者：王迎李江海章雨杨梦莲柳晨徐海轩造山带与地壳演化教育部重点实验室北京大学地球与空间科学学院北京100871 北京大学石油与天然气研究中心北京100871 图宾根大学地球科学系图宾根72076

随着巴西和西非海上巨型油气田的不断发现,盐相关勘探技术进步和数据资料快速积累,深入开展南大西洋被动陆缘盆地下白垩统盐岩成因环境及盐构造变形机理的研究,对于基础地质理论发展及海洋油气勘探开发具有重要的现实意义。南大西洋两... 详细信息

随着巴西和西非海上巨型油气田的不断发现,盐相关勘探技术进步和数据资料快速积累,深入开展南大西洋被动陆缘盆地下白垩统盐岩成因环境及盐构造变形机理的研究,对于基础地质理论发展及海洋油气勘探开发具有重要的现实意义。南大西洋两岸被动陆缘盆地下白垩统阿普特阶盐岩构造具有明显的分带性特征,显示了从伸展构造到挤压构造连续过渡特点。巴西一侧,出现连续分布厚层盐岩,盐上和盐下地层协调变形。盐岩构造变形开始于洋壳出现的阿尔比期,漂移期新海底负地形空间的增长,触发了沉积载荷作用下的盐岩构造变形。随着被动陆缘沉积沉降,两侧陆地抬升(地幔作用),以及板块边界上构造应力的远程传递作用(南美),到新近纪持续发生重力作用下的构造变形。物理模拟实验以及在力学上实现正演再现的离散元数值模拟,表明南大西洋盐构造变形为重力构造作用成因,斜坡上的重力作用形成被动陆缘盆地的伸展—过渡—挤压的盐构造分带。局部高地抬升(被动陆缘断块抬升)扰动盐岩流动,盐岩颗粒具有较大的向上速度分量,形成盐株、盐底辟构造。而前缘构造阻挡(大洋地壳、SDRs形成、过渡型伸展地壳、出露的超镁铁质地幔等抬升造成)、盐上地层压力(载荷)则是坡下盐岩运动速率降低,出现聚集增厚现象的主要原因。南大西洋两岸的盐构造经历多期构造变形改造,主要涉及两期(阿尔比期和新生代)盐构造变形流动及其向大洋盆地的前展式扩张。沿着盐层滑动过程中重力滑动及重力扩展的混合作用模式,可以解释本区主体的盐构造样式。

关键词：盐构造重力构造白垩纪被动陆缘离散元数值模拟物理模拟

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浅析情感教育在幼儿园绘本教学中的有效渗透

读写算 2022年第20期 52-54页

作者：杨梦莲苏州市相城区太平中心幼儿园

幼儿时期是情感教育开展的最好时期，教师要结合幼儿认知规律和特点，科学应用“绘本”教学手段激发学生的感官思维，让学生逐步形成知识探索与拓展创新能力，有效增强幼儿绘本阅读水平和能力，使绘本成为幼儿拓展认知、丰富体验、增长... 详细信息

幼儿时期是情感教育开展的最好时期，教师要结合幼儿认知规律和特点，科学应用“绘本”教学手段激发学生的感官思维，让学生逐步形成知识探索与拓展创新能力，有效增强幼儿绘本阅读水平和能力，使绘本成为幼儿拓展认知、丰富体验、增长知识、提升能力的重要知识获取途径，进而全面提高幼儿绘本使用频率和效率，让学生在通俗易懂、内容丰富、色彩艳丽的绘本中探索知识奥秘、培养学习情感，进而提高学生对知识点的掌握与应用能力。教师要在绘本强有力的教学辅助下挖掘学生潜意识中的情感，促使小学生可以在绘本内容的感染与熏陶下逐步形成端正的态度、良好的习惯、纯洁的心灵、高超的能力，为幼儿感受爱、学习爱、表达爱提供助力，将幼儿培养成为有思想、有情感、有能力、有意识的优秀儿童，为幼儿深造发展奠定坚实基础。

关键词：情感教育幼儿园绘本教学渗透策略

伯明翰学派会话理论视角下的英语专业课堂学生话语研究

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教育进展 2023年第5期13卷 2847-2854页

作者：杨梦莲费珺陆晴苏州科技大学天平学院语言文化学院江苏苏州

伯明翰学派话语分析理论及其分析模式能够描述真实的课堂结构。该研究基于伯明翰学派的会话理论,探讨大学英语专业课堂上学生的课堂话语结构。研究发现完整的IRF虽然是存在的,但是并不常见。而且课堂互动中教师说的多,学生发言的少,要... 详细信息

伯明翰学派话语分析理论及其分析模式能够描述真实的课堂结构。该研究基于伯明翰学派的会话理论,探讨大学英语专业课堂上学生的课堂话语结构。研究发现完整的IRF虽然是存在的,但是并不常见。而且课堂互动中教师说的多,学生发言的少,要改变这种现状,有效的方法之一就是激发学生学习英语的兴趣,适当的调节课堂内容,创造性的提出学习方法等。

关键词：伯明翰学派学生话语英语专业学生 IRF会话结构交际回合

柴达木盆地风成地貌类型与晚全新世古风况恢复

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北京大学学报（自然科学版） 2018年第5期54卷 1021-1027页

作者：吴桐雯李江海杨梦莲造山带与地壳演化教育部重点实验室北京大学地球与空间科学学院北京100871

利用遥感图像的风成地貌形态和高分辨率古季风指标,恢复柴达木盆地晚全新世以来的古风况,揭示青藏高原抬升时期东亚季风变迁的历史。结果表明,柴达木盆地晚全新世以来盛行西北风,同时有少量西风和北风,主要由亚洲冬季风控制,夏季风和西... 详细信息

利用遥感图像的风成地貌形态和高分辨率古季风指标,恢复柴达木盆地晚全新世以来的古风况,揭示青藏高原抬升时期东亚季风变迁的历史。结果表明,柴达木盆地晚全新世以来盛行西北风,同时有少量西风和北风,主要由亚洲冬季风控制,夏季风和西风环流的影响甚微。盆地东部沙丘和雅丹地貌记录了末次盛冰期西风环流的风向,中西部地区的风成地貌指示晚全新世以来盆地发育西北向的亚洲冬季风。青藏高原的抬升阻挡西风环流进入柴达木盆地,并加强亚洲冬季风,造成盆地内古风向的改变,大气环流模式的转变发生在4000 a BP左右,此时是柴达木盆地气候从暖湿转向冷干的重要节点。

关键词：柴达木盆地晚全新世风成地貌古风况东亚季风

纤维微菌β-1,3-葡聚糖酶的克隆表达及对灵芝细胞壁的水解作用

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食品与发酵工业 2023年第1期49卷 10-18页

作者：杨梦莲单逸蓝沈微朱新文杨海泉陈献忠陈磊夏媛媛江南大学生物工程学院工业生物技术教育部重点实验室江苏无锡214122 山东省东阿县农业农村局山东聊城252200

该文旨在研究一种酶解灵芝(Ganoderma lucidum)菌丝体从而提高其胞内蛋白提取效率的方法。通过PCR方法扩增获得纤维微菌(Cellulosimicrobium sp.)CICIM6906的β-1,3-葡聚糖酶编码基因,该基因命名为bgl6906并与表达载体连接,构建重组质粒... 详细信息

该文旨在研究一种酶解灵芝(Ganoderma lucidum)菌丝体从而提高其胞内蛋白提取效率的方法。通过PCR方法扩增获得纤维微菌(Cellulosimicrobium sp.)CICIM6906的β-1,3-葡聚糖酶编码基因,该基因命名为bgl6906并与表达载体连接,构建重组质粒pET28a-bgl6906,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),获得重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a-bgl6906。重组菌在TB培养基中进行诱导表达,表达产物在自身信号肽引导下大部分分泌到细胞外。以茯苓多糖为底物时,重组酶BGL6906纯酶比酶活力为567.8 U/mg,最适pH为5.5,最适温度为50℃。重组菌在15 L发酵罐中发酵72 h胞外酶活力达到67 U/mL。重组酶BGL6906与果胶酶交替水解灵芝菌丝体培养物,可以有效水解细胞壁,获得部分原生质体。进一步辅助短时超声波破碎可以大幅度提高灵芝胞内产物的释放。

关键词：纤维微菌 β-1,3-葡聚糖酶分泌表达灵芝细胞破碎

黑曲霉高耐热葡聚糖酶的分子截短与制备条件优化

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食品与发酵工业 2023年第4期49卷 216-223页

作者：吴尚武杨梦莲沈微单逸蓝王施岚杨海泉夏媛媛陈献忠江南大学生物工程学院工业生物技术教育部重点实验室江苏无锡214122 苏州药明康德新药开发有限公司江苏苏州215000

该文旨在通过分子截短的方式提高高耐热葡聚糖酶AnEglA6的表达水平并针对重组菌建立相应的发酵方法。高耐热β-葡聚糖酶在禽类饲料生产中有着重要作用。黑曲霉来源的葡聚糖酶AnEglA6具有优越的耐热性能,适合在禽类饲料中使用。采用C端... 详细信息

该文旨在通过分子截短的方式提高高耐热葡聚糖酶AnEglA6的表达水平并针对重组菌建立相应的发酵方法。高耐热β-葡聚糖酶在禽类饲料生产中有着重要作用。黑曲霉来源的葡聚糖酶AnEglA6具有优越的耐热性能,适合在禽类饲料中使用。采用C端截短方式对该葡聚糖酶进行分子精简,构建了去除连接桥和纤维素结合结构域的截短体基因eglA6c,分别在乳酸克鲁维酵母和巴斯德毕赤酵母中进行异源表达获得重组酶AnEglA6cK和AnEglA6cP。乳酸克鲁维酵母表达的重组酶AnEglA6cK最适温度为75℃,在80℃下酶活力半衰期达55 min,能短时耐受85℃高温,应用性能显著优于AnEglA6cP。针对截短体酶AnEglA6cK在发酵后期酶活力快速下降的问题,对发酵条件进行了优化。通过以大豆蛋白胨替代酪蛋白胨的方式延长产酶时间、大幅度提高了摇瓶发酵水平。

关键词：高耐热β-1,4-葡聚糖酶 AnEglA6 分子截短乳酸克鲁维酵母大豆蛋白胨

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贵州省极贫乡镇数字乡村平台建设探索

科技资讯 2023年第17期21卷 249-252页

作者：湛青青湛雷杨梦莲贵州省第一测绘院贵州贵阳550025

根据国家实施乡村振兴战略的重大决策部署和一系列政策文件,依托现代地理信息、大数据、物联网、云计算、移动互联网等新技术,该文以贵州省极贫乡镇示范乡董地乡为例,探索研究极贫乡镇数字乡村建设的总体框架和建设内容,集聚和整合小城... 详细信息

根据国家实施乡村振兴战略的重大决策部署和一系列政策文件,依托现代地理信息、大数据、物联网、云计算、移动互联网等新技术,该文以贵州省极贫乡镇示范乡董地乡为例,探索研究极贫乡镇数字乡村建设的总体框架和建设内容,集聚和整合小城镇各行各业资源,构建“数字乡村(董地苗族彝族乡)”平台,实现政府管理高效、社会治理科学、惠民服务便捷的目标,为贵州极贫乡镇数字乡村建设和发展提供参考。

关键词：乡村振兴数字乡村贵州省测绘地理信息

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南大西洋西非岸盆地群构造、沉积演化对比

中国地质 2021年第1期48卷 120-128页

作者：洛怡李江海杨梦莲造山带与地壳演化教育部重点实验室北京大学地球与空间科学学院北京100871

非洲西部海岸盆地群经历了裂谷期、同裂谷期和漂移期构造演化阶段,构造演化和沉积充填有一定的相似性,但是由于后期局部构造和差异沉积的影响,现今盆地发育的构造样式和沉积建造有一定区别,导致勘探效果有较大的差异。本文通过对比南大... 详细信息

非洲西部海岸盆地群经历了裂谷期、同裂谷期和漂移期构造演化阶段,构造演化和沉积充填有一定的相似性,但是由于后期局部构造和差异沉积的影响,现今盆地发育的构造样式和沉积建造有一定区别,导致勘探效果有较大的差异。本文通过对比南大西洋赤道段转换型、中段含泥型、中段含盐型和南段火山型盆地的综合柱状图,加上对尼日尔三角洲盆地和下刚果盆地进行平衡剖面恢复,探讨西非岸三段四类盆地的特征,以求对盆地的勘探工作有所帮助。赤道段转换型盆地在阿普特期和阿尔比期的裂谷阶段完成了湖泊、河流等陆相沉积到浅海碳酸盐岩沉积的转换,未发育盐岩。中段含泥盆地巨厚的新生代阿卡塔组泥岩为滑脱层,在差异负载作用下,泥岩层发生变形。中段含盐盆地在阿普特期,由陆相沉积过渡为浅海碳酸盐岩沉积。阿普特期盐岩层在差异负载和重力滑脱作用下流动变形,形成了伸展、底辟和挤压构造带。南段火山型盆地以裂谷期发育的溢流相玄武岩和凝灰岩为特征,发育典型的向海倾斜反射体。

关键词：南大西洋构造沉积演化被动大陆边缘平衡剖面恢复