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面包树果实凝集素的提取纯化及理化性质分析

天然产物研究与开发 2019年第2期31卷 332-337页

作者：张晓青施青杨愈丰遵义医科大学珠海校区珠海市中药基础与应用研究重点实验室珠海519040

建立面包树果实凝集素(frutalin,FTL)的提取纯化方案,并对FTL纯品进行部分理化性质分析。本试验以新鲜的面包树果实籽为材料,经Tris-HCl缓冲液浸提、过滤、硫酸铵沉淀和阳离子交换层析后超滤浓缩得FTL纯品,最后用纯品开展了糖抑制,热稳... 详细信息

建立面包树果实凝集素(frutalin,FTL)的提取纯化方案,并对FTL纯品进行部分理化性质分析。本试验以新鲜的面包树果实籽为材料,经Tris-HCl缓冲液浸提、过滤、硫酸铵沉淀和阳离子交换层析后超滤浓缩得FTL纯品,最后用纯品开展了糖抑制,热稳定性,pH稳定性和金属离子耐受性等试验。提取优化得到的最佳条件为:料液比1∶2(g:m L),浸提时间2 h,浸提温度50℃,硫酸铵饱和度70%,沉淀时间4 h。经阳离子交换层析后FTL回收率为22%。研究结果表明,FTL是一种热稳定性凝集素,在温度不超过60℃时,其凝血活性不受影响,并且不依赖于金属离子来发挥其凝血活性。本研究建立了一个简单高效的FTL分离纯化方案,并对FTL纯品做了部分理化性质研究,为FTL可能的生物医学应用提供研究基础。

关键词：面包树果实凝集素分离纯化凝血活性理化性质

蓝藻丝氨酸蛋白酶抑制剂arthropin的制备及其靶蛋白酶的筛选

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上海交通大学学报（医学版） 2023年第4期43卷 428-436页

作者：许佳伟周爱武杨愈丰遵义医科大学珠海校区生物工程系珠海519040 上海交通大学基础医学院病理生理学系上海200025

目的·制备高纯度的蓝藻丝氨酸蛋白酶抑制剂(serine protease inhibitor,serpin),筛选其靶蛋白酶,并探究其抑制活性。方法·通过氨基酸序列分析,在人类口腔微生物组数据库(eHOMD)发现了一种钝顶节旋藻(Arthrospira platensis)的serpin,... 详细信息

目的·制备高纯度的蓝藻丝氨酸蛋白酶抑制剂(serine protease inhibitor,serpin),筛选其靶蛋白酶,并探究其抑制活性。方法·通过氨基酸序列分析,在人类口腔微生物组数据库(eHOMD)发现了一种钝顶节旋藻(Arthrospira platensis)的serpin,将其命名为arthropin;构建融合表达载体pSUMO3-arthropin,将其转入大肠埃希菌BL21(DE3)诱导表达;采用镍离子亲和层析、酶切、反向镍离子亲和层析、阴离子交换层析的4步层析纯化方案将arthropin重组蛋白分离纯化;将arthropin重组蛋白分别与活化的凝血因子Ⅸ(activated factorⅨ,FⅨa)、FⅩa、FⅪa、活化的蛋白C(activated protein C,APC)、激肽释放酶1(kallikrein 1,KLK1)等14种丝氨酸蛋白酶共孵育,再利用SDS-PAGE分析共价复合物形成情况,利用反应动力学方法检测arthropin对KLK1的抑制速率。对arthropin重组蛋白的结晶条件进行筛选,选取合适的晶体进行X射线衍射并采集数据。利用AlphaFlod Colab预测arthropin亚稳态结构模型。结果·SDS-PAGE分析发现,arthropin融合蛋白在大肠埃希菌BL21(DE3)中表达;纯化后,获得了高纯度的与理论相对分子质量(45800)相近的arthropin重组蛋白。将arthropin重组蛋白与14种丝氨酸蛋白酶共孵育后发现,arthropin能与FⅩa、APC、FⅨa、FⅪa、胰蛋白酶(trypsin)、组织蛋白酶G(cathepsin G)、KLK1、KLK7和凝血酶(thrombin)9种蛋白酶形成稳定的共价复合物。Arthropin抑制KLK1的二级反应抑制速率常数为1.7×103 L/(mol·s)。Arthropin重组蛋白可以在25%聚乙二醇单甲醚550(PEG MME 550)、0.1 mol/L吗啉乙磺酸(MES,pH 6.5)、0.01 mol/L ZnCl2条件下形成片状晶体,X射线衍射分辨率为10Å(1Å=1×10−10 m)。AlphaFlod Colab预测结果发现,arthropin具有经典的抑制型serpin的结构特点。结论·成功获得高纯度的钝顶节旋藻丝氨酸蛋白酶抑制剂arthropin,其具有较广谱的丝氨酸蛋白酶抑制能力,但抑制速率较低。

关键词：丝氨酸蛋白酶抑制剂钝顶节旋藻原核表达蛋白结晶

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细菌表面展示技术研究新进展

生物化学与生物物理进展 2019年第2期46卷 162-168页

作者：向红英王菊芳杨愈丰吕延成遵义医科大学珠海校区珠海519040 珠海市中药基础与应用研究重点实验室珠海519040 广东省发酵与酶工程重点实验室(华南理工大学生物科学与工程学院) 广州510640

细菌表面展示是将靶标蛋白质表达于细菌表面以更好地实现其功能的一种技术,它在重组细菌疫苗、生物燃料电池、全细胞催化剂和生物修复等多个领域均有广泛的应用.随着相关技术的发展,表面展示系统的各种性能被不断地改良,同时新的表面展... 详细信息

细菌表面展示是将靶标蛋白质表达于细菌表面以更好地实现其功能的一种技术,它在重组细菌疫苗、生物燃料电池、全细胞催化剂和生物修复等多个领域均有广泛的应用.随着相关技术的发展,表面展示系统的各种性能被不断地改良,同时新的表面展示系统也陆续被开发和应用,使该技术得到持续的丰富和发展.本文重点关注近年研究得较多的细菌表面展示系统,主要对各类细菌表面展示系统的开发、改造和修饰,以及该技术在生物修复和生物传感器方面的应用作一综述.

关键词：细菌表面展示系统载体蛋白冰核蛋白生物修复生物传感器

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柚子皮精油提取及其驱蚊效果研究

天然产物研究与开发 2017年第5期29卷 867-872页

作者：杨愈丰柳敦耀向红英吕延成王菊芳遵义医学院珠海校区生物化学与分子生物学教研室珠海519041 华南理工大学生物科学与工程学院广州510640 珠海市中药基础与应用研究重点实验室珠海519041

本文通过响应面法研究了柚子皮精油的提取工艺,并初步考察了所提取精油的驱蚊效果。柚子皮精油提取采用微波辅助蒸馏法,在采用单因素实验考察蒸馏时间、料液比和NaCl质量分数对精油提取率的影响之后,通过响应面法进行提取工艺优化,以获... 详细信息

本文通过响应面法研究了柚子皮精油的提取工艺,并初步考察了所提取精油的驱蚊效果。柚子皮精油提取采用微波辅助蒸馏法,在采用单因素实验考察蒸馏时间、料液比和NaCl质量分数对精油提取率的影响之后,通过响应面法进行提取工艺优化,以获得最佳提取方案;然后采用趋避法验证柚子皮精油的驱蚊活性。结果表明,最佳柚子皮精油提取方案如下:蒸馏时间100 min,料液比0.3∶2(g/m L),NaCl的质量分数1%,采用该方案柚子皮精油提取率达1.65%。通过初步驱蚊实验发现柚子皮精油具有较好的驱蚊活性,和市售六神花露水效果相当,驱蚊效应具有进一步深入研究的价值。

关键词：柚子皮精油蒸馏法响应面法驱蚊活性

FAD-GDH的改造和表达优化及其在血糖检测方面的应用

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FAD-GDH的改造和表达优化及其在血糖检测方面的应用

中国生物工程学会第十三届学术年会暨2019年全国生物技术大会

作者：郭坚杨愈丰遵义医科大学珠海校区

FAD依赖的葡萄糖脱氢酶(FAD-GDH)是一类酶学性质优良的酶。凭借其较好的稳定性和底物专一性,以及高电流输出、高灵敏度等特点,FAD-GDH极具血糖检测、工业催化剂以及生物燃料电池等领域的应用潜力,成为近年来研究的热点。关于FAD-GDH的... 详细信息

FAD依赖的葡萄糖脱氢酶(FAD-GDH)是一类酶学性质优良的酶。凭借其较好的稳定性和底物专一性,以及高电流输出、高灵敏度等特点,FAD-GDH极具血糖检测、工业催化剂以及生物燃料电池等领域的应用潜力,成为近年来研究的热点。关于FAD-GDH的研究主要集中在新酶及其来源的发现,底物专一性等酶学性质的进一步提高,FAD-GDH的应用拓展等。本文主要总结了FAD-GDH的改造和重组表达条件优化的相关进展,同时比较了目前血糖检测设备优劣性,并总结了部分基于FAD-GDH改造酶电极的方法。

关键词： FAD-GDH 蛋白质工程底物专一性饱和突变生物传感器

抗菌肽的设计、改造、重组表达和应用研究进展

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抗菌肽的设计、改造、重组表达和应用研究进展

中国生物工程学会第十三届学术年会暨2019年全国生物技术大会

作者：刘迪嘉杨愈丰遵义医科大学珠海校区

抗菌肽(antimicrobial peptide,AMPs)是一类的由10-50个氨基酸构成的生物活性短肽,具有广谱抗菌活性、抗肿瘤、免疫调节等功能。AMPs来源广泛,主要包括动物、植物和微生物等,是机体抵御外来细菌或病毒攻击的第一道防线。AMPs特有的生物... 详细信息

抗菌肽(antimicrobial peptide,AMPs)是一类的由10-50个氨基酸构成的生物活性短肽,具有广谱抗菌活性、抗肿瘤、免疫调节等功能。AMPs来源广泛,主要包括动物、植物和微生物等,是机体抵御外来细菌或病毒攻击的第一道防线。AMPs特有的生物活性使其可能成为解决目前抗生素耐药泛滥成灾问题的一个突破口。近几年AMPs相关研究主要集中在新型AMPs的发现、设计、合成、修饰、重组表达和应用开发等多个方面。笔者课题组开展AMPs开发研究已有三年多,主要集中在全新序列的AMPs的设计、构效关系相关研究,目前已申请中国发明专利7项,其中4项已授权,更多的研究结果还在整理中。目前,AMPs的应用中存在生产成本较高,容易被蛋白酶降解和溶血活性较强等问题限制了其进一步发展,这些问题的解决将成为提高AMPs成药性,加速AMPs走向临床的关键环节。本文在归纳整理AMPs重组表达的相关研究进展的基础上,重点关注新型AMPs设计方法的开发和AMPs减毒增效相关改造研究的新进展,以期为AMPs进一步研究开发提供有益的参考。

关键词：抗菌肽设计改造重组表达抑菌活性

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抗癌肽改造修饰研究新进展

抗癌肽改造修饰研究新进展

中国生物工程学会第十三届学术年会暨2019年全国生物技术大会

作者：谢明峰杨愈丰遵义医科大学珠海校区

抗癌肽(Anti-cancer peptides, ACPs)是一类大约由10-60个氨基酸组成的短肽,ACPs可以抑制肿瘤细胞增殖、迁移和肿瘤血管的形成,不易导致肿瘤耐药,是一类极具开发潜力的抗癌药物候选物。目前有大量ACPs处于临床研究的不同阶段。当然,ACP... 详细信息

抗癌肽(Anti-cancer peptides, ACPs)是一类大约由10-60个氨基酸组成的短肽,ACPs可以抑制肿瘤细胞增殖、迁移和肿瘤血管的形成,不易导致肿瘤耐药,是一类极具开发潜力的抗癌药物候选物。目前有大量ACPs处于临床研究的不同阶段。当然,ACPs也存在容易被蛋白酶降解,有较大的细胞毒性等问题。因此,关于ACPs增效减毒的相关改造或修饰是目前肽类研究的热点。ACPs的改造主要包括主链改造和侧链修饰。本文在对ACPs的分类和作用机制进行归纳整理的基础上,着重关注ACPs改造和修饰方面取得的新进展,期望为ACPs的相关改造等基础研究或应用开发提供有益的参考。

关键词：肿瘤耐药抗癌肽改造修饰

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气味结合蛋白OBP26的原核表达及纯化

气味结合蛋白OBP26的原核表达及纯化

中国生物工程学会第十三届学术年会暨2019年全国生物技术大会

作者：许佳伟杨愈丰遵义医科大学珠海校区

目的:建立德国小蠊气味结合蛋白OBP26的原核表达及纯化方案,对表达条件进行优化,以获得产量高、均一好的蛋白。方法:利用无缝克隆技术构建pET32a(+)-SUMO-OBP26融合表达载体;比较不同诱导温度、诱导时间、异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG... 详细信息

目的:建立德国小蠊气味结合蛋白OBP26的原核表达及纯化方案,对表达条件进行优化,以获得产量高、均一好的蛋白。方法:利用无缝克隆技术构建pET32a(+)-SUMO-OBP26融合表达载体;比较不同诱导温度、诱导时间、异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导终浓度和诱导时机(菌液OD600值)对OBP26融合蛋白表达量的影响,筛选融合蛋白最优表达条件;运用镍离子亲和层析和凝胶过滤层析纯化融合蛋白,探究高效、稳定的纯化方案。结果:在诱导温度24℃、菌液OD600值为0.8、IPTG终浓度为0.1 mmol/L的条件下诱导培养10 h,OBP26融合蛋白的表达量最高且杂蛋白较少;建立融合蛋白OBP26的"四步"纯化方案,即:第一次金属镍亲和层析、SENP2酶切SUMO靶点、第二次金属镍亲和层析、凝胶过滤层析,获得纯度高、均一性好的蛋白。结论:建立了稳定的OBP26蛋白原核表达及纯化方案,获得了纯度高、均一性好的OBP26蛋白,为后续该蛋白的结晶、结构与功能机制的深入研究及应用奠定基础。

关键词：德国小蠊气味结合蛋白原核表达纯化

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面包树果实凝集素的提取纯化及部分性质分析

面包树果实凝集素的提取纯化及部分性质分析

中国生物工程学会第十三届学术年会暨2019年全国生物技术大会

作者：张晓青施青杨愈丰遵义医科大学珠海校区珠海市中药基础与应用研究重点实验室

建立了面包树果实凝集素(frutalin, FTL)的提取纯化方案,并对FTL纯品进行部分理化性质分析。将新鲜的面包树果实籽匀浆,经Tris-HCl缓冲液浸提、过滤、硫酸铵沉淀和阳离子交换层析后超滤浓缩得FTL纯品,最后用纯品开展了糖抑制,热稳定性,p... 详细信息

建立了面包树果实凝集素(frutalin, FTL)的提取纯化方案,并对FTL纯品进行部分理化性质分析。将新鲜的面包树果实籽匀浆,经Tris-HCl缓冲液浸提、过滤、硫酸铵沉淀和阳离子交换层析后超滤浓缩得FTL纯品,最后用纯品开展了糖抑制,热稳定性,pH稳定性和金属离子耐受性等试验。提取优化得到的最佳条件为:料液比1:2(g/mL),浸提时间2 h,浸提温度50℃,硫酸铵饱和度70%,沉淀时间4 h。经阳离子交换层析后FTL回收率为22%。FTL是一种热稳定性凝集素,在温度不超过60℃时,其凝血活性不受影响,并且不依赖于金属离子来发挥其凝血活性。本研究建立了一个简单高效的FTL分离纯化方案,并对FTL纯品做了部分理化性质研究,为FTL可能的生物医学应用提供研究基础。

关键词：面包树果实凝集素分离纯化凝血活性理化性质