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NF-κB信号传导途径对TNF-α诱导的SMMC-7721细胞凋亡的影响

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癌症 2002年第9期21卷 974-978页

作者：杨季云曾祥元马布仁成都军区总医院临床实验科四川成都610083

背景与目的:已证明核因子κB(nuclearfactor-κB,NF-κB)在免疫细胞激活、抗病毒、多种应激反应和细胞凋亡的调控等许多方面起着重要作用。本实验研究NF-κB信号传导途径对TNF-α诱导的肝癌细胞株SMMC-7721细胞凋亡的影响。方法:采用EL... 详细信息

背景与目的:已证明核因子κB(nuclearfactor-κB,NF-κB)在免疫细胞激活、抗病毒、多种应激反应和细胞凋亡的调控等许多方面起着重要作用。本实验研究NF-κB信号传导途径对TNF-α诱导的肝癌细胞株SMMC-7721细胞凋亡的影响。方法:采用ELISA和免疫组化检测TNF-α对NF-κB信号传导通路的激活作用,继而用TPCK(n-tosyl-Phe-chloromethylketone)阻断NF-κB的活化,流式细胞仪检测细胞凋亡。结果:①TNF-α能激活NF-κB信号传导通路;②TPCK能抑制TNF-α诱导的NF-κB活化;③TPCK抑制NF-κB活化后,能加强TNF-α诱导的细胞凋亡。结论:SMMC-7721细胞中NF-κB信号传导途径参与了细胞的抗凋亡过程,在SMMC-7721细胞对TNF-α的细胞毒性作用耐受中起重要作用。抑制NF-κB信号传导途径可能在肿瘤治疗中有潜在的应用价值。

关键词：肿瘤坏死因子-α 核因子-кB 信号传导细胞凋亡 SMMC-7721细胞肝癌细胞

NF-κB信号转导通路和IL-6在SMMC-7721细胞对TNF-α的细胞毒性效应耐受中的作用实验研究

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NF-κB信号转导通路和IL-6在SMMC-7721细胞对TNF-α的细胞毒性效...

作者：杨季云第三军医大学

学位级别：硕士

背景：TNF-α是一种多极性的细胞因子，有广泛的生物学功能，如引起炎症、诱导细胞增生、分化和凋亡，在机体免疫和抗肿瘤反应中有重要作用。然而，许多肿瘤细胞对TNF-α的细胞毒性作用耐受。因此，了解肿瘤细胞对TNF-α的细胞毒性作用... 详细信息

背景：TNF-α是一种多极性的细胞因子，有广泛的生物学功能，如引起炎症、诱导细胞增生、分化和凋亡，在机体免疫和抗肿瘤反应中有重要作用。然而，许多肿瘤细胞对TNF-α的细胞毒性作用耐受。因此，了解肿瘤细胞对TNF-α的细胞毒性作用的耐受机制，可能会产生一种新的肿瘤治疗方法。TNF-α对肿瘤细胞的细胞毒性作用受细胞固有的和获得性的因素影响。有研究发现：抑制蛋白质合成能够大大增加TNF-α介导的细胞凋亡，提示可能是合成的蛋白质影响了肿瘤细胞对TNF-α的敏感性。但目前对其靶细胞蛋白合成调控机制了解甚少。目的：本研究采用培养SMMC-7721细胞，观察IL-6对TNF-α的细胞毒性作用的影响;阻断NF-κB活化通路对TNF-α的细胞杀伤作用和细胞周期的影响;并探讨TNF-α激活NF-κB对IL-6表达的影响。希望能更确切地阐明IL-6在肿瘤治疗中的可能作用和NF-κB信号通路在SMMC-7721细胞对TNF-α耐受中的作用。方法：1．用RT-PCR和RIA分别检测SMMC-7721细胞在TNF-α作用下IL-6 mRNA表达和IL-6分泌。同时应用MTT实验、流式细胞仪检测TNF-α诱导的细胞生长和凋亡的影响，并观察IL-6或阻断IL-6活性对细胞生长和凋亡的影响。二用 ELISA检测 TNF－Q对 NF－K B的活化作用;免疫组化检测 p65亚基的转核。同时观察 NF－K B信号通路活化对 SMMC刁72 细胞凋亡和细胞周期的影响及加入活化阻断剂 TPCK后，对 IL－6 mRNA表达、IL－6分泌、凋亡和细胞周期的影响。结果：l．未刺激的 SMMC－772细胞可以少量表达 IL－6，加入＊＊＊－。后能明显地诱导1＊－6的表达增加：随刺激时间的延长表达呈持续性增加，8小时达到高峰，12小时至 24小时稍有降低，此后 IL－6表达一直维持在较高水平。SMMC－772 细胞表达 IL－6 的量随 TNF一口浓度的增加而增加。正常培养状态下 SMMC－772 细胞IL－6mRNA表达微弱;TNF－u刺激后能明显地诱导IL－6mRNA 的表达，至 6小时达到高峰，8 ／J’时 IL－6mRNA表达略有下降，然后一直维持较高的水平。 2．外源加入的 IL－6对 SMMC－772细胞生长起促进作用。加 j＼抗几一6、抗IL－6R抗体时，SNIMC－7721细胞存活率明显降低。 SMMC－772细胞对 TNF一口的敏感性也显著增加。IL－6、抗几一6、抗 IL6R对 TNF。口诱导 SMMC－772细胞凋亡没有显著影响。 ***检测表明：10ng／mlTNF一口刺激SMMC－7721 细胞 3Om…，NF－。P g4发牛界著的转认活朴（P＜O05＼三八活化达十l。、，。｛，然则引蛇口;合，hi;已处5 1;L人、十比拟付他村。V NP。B j;。;一化随TNF－。的剂量增加而增加。NF－。B亚基p65 ＆疫细胞化学显示：正常培养条件下，胞浆中呈强阳性染色;TNF．口刺激能诱导 p65亚基转核，在30分钟时即可观察到p65亚基明显的核转位，胞核、胞浆中均有阳性染色;l小时细胞核中染色呈强阳性，二小时核中染色达到高峰，胞浆染色已变得微弱。p65亚基的核转位也呈TNF a剂量依赖关系。 4．应用20卜mol／L TPCK预处理SMMC－7721细胞30min，力入 10ng／mL TNF－a，分别检测核提取物的p65亚基含量、IL巧和细胞存活率。与对照组比，p65亚基含量、IL革和细胞存活率显著 Vlll 降低。 5．单独用TNF－a处理细胞，细胞对TNF一日诱导的凋亡表现出抵抗。单独使用 TPCK时，SMMC－772细胞的凋亡并没有明显改变，将SMMC－772细胞先用TPCK（20卜mol几）预处理30min，再加入TNF一日共培养刺激至48h，能显著增强TNF－a诱导细胞凋亡的作用。 6．在无血清条件下培养 24小时，加入含 5％小牛血清后，继续培养12小时，正常培养的SMMC－7721细胞很快由GO／GI期进入 S期。10ng／ml TNF一口处理 SMMCJ 细胞，导致细胞加速从GO／GI 期进入S 期。与对照组比较，单独使用TPCK， SMMC－772 细胞的周期分布并没有明显改变，但将 SMMC－772 细胞先用TPCK（20pmol儿）须处理30min，再加入TNF一日共培养刺激至 12h，SMMC－7721细胞周期明显被阻滞在 GO／GI期。

关键词：肝癌7721细胞株肿瘤坏死因子α 白细胞介素6 核因子κB 信号转导凋亡细胞周期

E2A-PBX1融合基因的实时定量检测在小儿急性淋巴细胞白血病微小残留病监测中的应用

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中国当代儿科杂志 2013年第6期15卷 440-443页

作者：张熔廖静李戈孙怀强石毓君杨季云四川省医学科学院/四川省人民医院儿科四川省医学科学院/四川省人民医院分子生物研究室四川成都610072 四川大学华西医院移植工程与移植免疫实验室四川成都610041

目的实时荧光定量PCR方法检测E2A-PBX1融合基因的表达水平,探讨其在监测急性淋巴细胞白血病(ALL)患儿微小残留病(MRD)及判断预后中的临床价值。方法采用实时荧光定量RT-PCR方法,动态检测11例E2A-PBX1融合基因阳性的ALL患儿在初治期(11例... 详细信息

目的实时荧光定量PCR方法检测E2A-PBX1融合基因的表达水平,探讨其在监测急性淋巴细胞白血病(ALL)患儿微小残留病(MRD)及判断预后中的临床价值。方法采用实时荧光定量RT-PCR方法,动态检测11例E2A-PBX1融合基因阳性的ALL患儿在初治期(11例)、完全缓解期(11例)、复发期(3例)和10例同期骨髓细胞形态学正常的非血液及肿瘤疾病对照组患儿的E2A-PBX1融合基因表达水平。结果 11例ALL患儿初治期和复发期的E2A-PBX1基因表达水平均显著高于缓解期及对照组(P<0.01)。与诱导缓解治疗第33天E2A-PBX1水平表达阴性的患儿比较,表达阳性的患儿3年的复发率增高,无病生存率降低(均P<0.05)。结论实时荧光定量RT-PCR检测E2A-PBX1融合基因的表达水平是监测MRD、预测复发、指导个体化治疗的良好指标,诱导缓解第33天E2A-PBX1融合基因水平可用于判断预后。

关键词： E2A-PBX1 实时荧光定量PCR 微小残留病白血病儿童

Fibrocystin对常染色体隐性遗传多囊肾病囊肿细胞增殖的影响

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中华肾脏病杂志 2008年第5期24卷 349-355页

作者：杨季云杨洋张本四川省医学科学院四川省人民医院检验科四川省人类疾病基因研究重点实验室成都610072

目的研究fibmcystin对表皮生长因子（EGF）诱导的细胞过度增殖的影响并探讨其机制。方法通过RNA干扰技术建立PKHD1-沉默细胞株，分别检测EGF诱导的细胞增殖率、ERK1／2磷酸化水平和细胞内Ca^2＋浓度。通过降低HEK293细胞和增高PKHD1-沉... 详细信息

目的研究fibmcystin对表皮生长因子（EGF）诱导的细胞过度增殖的影响并探讨其机制。方法通过RNA干扰技术建立PKHD1-沉默细胞株，分别检测EGF诱导的细胞增殖率、ERK1／2磷酸化水平和细胞内Ca^2＋浓度。通过降低HEK293细胞和增高PKHD1-沉默细胞内Ca^2＋浓度，研究Ca^2＋在其中的可能作用。结果与HEK293细胞比较，PKHD1-沉默HEK293细胞对EGF作用高度敏感，增殖率为231．5％，显著高于HEK293细胞的152．8％（P〈0．01），细胞内Ca^2＋浓度也显著降低（P〈0．01）。同时PKHD1沉默可显著增高EGF诱导的ERKI／2信号通路活化。运用Ca^2＋通道阻断剂维拉帕米降低HEK293细胞内Ca^2＋浓度后，与未经维拉帕米处理的细胞比较，细胞增殖率为202．2％，显著增高。维拉帕米处理的HEK293细胞的ERKI／2磷酸化水平明显高于未处理的细胞。而运用Ca^2＋通道激活剂BayK8644增高PKHD1-沉默HEK293细胞内Ca^2＋浓度后，显著降低了EGF诱导的PKHD1-沉默HEK293细胞的增殖率（135．5％），BayK8644处理的PKHD1-沉默HEK293细胞的ERK1／2磷酸化水平明显低于未处理的细胞。结论PKHD1基因的突变导致fibrocystin功能缺失，引起细胞内Ca^2＋浓度降低，导致EGF诱导的ERKI／2信号通路过度活化，可能是常染色体隐性遗传多囊肾疾病（ARPKD）患者肾囊肿衬里上皮细胞异常增殖导致ARPKD肾囊肿发生的机制之一。

关键词：多囊肾常染色体隐性 RNA干扰表皮生长因子细胞外信号调节激酶类 PKHD1基因

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常染色体显性多囊肾病的基因诊断与产前诊断

中华医学遗传学杂志 2019年第5期36卷 419-423页

作者：邱碧原杨季云成都中医药大学医学技术学院 610075 自贡市妇幼保健院检验科四川643000 电子科技大学附属医院四川省人民医院人类疾病基因研究重点实验室成都610072 电子科技大学医学院成都610054 电子科技大学附属医院四川省人民医院产前诊断中心成都610072

目的研究常染色体显性遗传多囊肾病(autosomal dominant polycystic kidney disease,ADPKD)的遗传病因,为家系的遗传咨询和产前诊断提供理论依据.方法应用芯片捕获高通量测序检测17例先证者PKD1、PKD2基因,通过多个突变数据库过滤及... 详细信息

目的研究常染色体显性遗传多囊肾病(autosomal dominant polycystic kidney disease,ADPKD)的遗传病因,为家系的遗传咨询和产前诊断提供理论依据.方法应用芯片捕获高通量测序检测17例先证者PKD1、PKD2基因,通过多个突变数据库过滤及生物信息学分析,并采用Sanger测序进行家系验证.对其中一个家系行产前基因诊断.结果 17例先证者中检出14个PKD1突变,3个PKD2突变,包括6个错义突变、4个无义突变、7个移码突变.其中,8个突变位点已报道与ADPKD相关,9个突变位点未报道过:PKD1:c.7625G>T(***2542Val),c.3673C>T(***1225*),c.11048dupT(***3684Aspfs* 38),c.9083_ 9084delAG (***3028Glyfs* 40),c.10560delG(***3521 Hisfs* 6),c.7952_7974 delTGTCCCTGAGGGTCCACACTGTG(***12651Glyfs*2);PKD2:c.662T>G(***221*),c.1202_1203 insCT (***401Aspfs*2),c.919 delA (***307Valfs* 10).1个家系的产前基因检测结果显示胎儿未携带与先证者相同的突变.结论明确了17个ADPKD家系的遗传病因,鉴定了PKD1、PKD2基因的9个未曾报道的新突变,丰富了ADPKD基因突变谱,为其遗传咨询和生育指导提供了理论依据.并成功对1个家系进行了产前诊断.

关键词：常染色体显性遗传多囊肾病高通量测序 PKD1基因 PKD2基因产前诊断

窄谱中波紫外线对人脐静脉内皮细胞的作用机制研究

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中华皮肤科杂志 2010年第4期43卷 278-280页

作者：李福民陆洁段西凌杨季云四川省医学科学院、四川省人民医院皮肤病性病研究所成都610071 人类疾病基因研究实验室

银屑病最先发生的病理改变是血管的分布和形成的改变。血管内皮生长因子（VEGF）是众多血管生成因子中效力最强、作用最关键的特异性调控因子。血管内皮细胞产生的基质金属蛋白酶（MMP）在血管发生、形成和再生中具有重要意义。窄谱中... 详细信息

银屑病最先发生的病理改变是血管的分布和形成的改变。血管内皮生长因子（VEGF）是众多血管生成因子中效力最强、作用最关键的特异性调控因子。血管内皮细胞产生的基质金属蛋白酶（MMP）在血管发生、形成和再生中具有重要意义。窄谱中波紫外线（NB—UVB）（波峰311nm）治疗银屑病具有很好的疗效和安全性^[1]。

关键词：窄谱中波紫外线人脐静脉内皮细胞血管内皮生长因子血管生成因子基质金属蛋白酶血管内皮细胞病理改变调控因子

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小鼠Rnf141多克隆抗体的制备及鉴定

四川大学学报（医学版） 2008年第5期39卷 697-700页

作者：宋红霞张思仲杨季云四川大学华西医院医学遗传学研究室成都610041

目的获得小鼠Rnf141多克隆抗体,并对其功能进行初步研究。方法利用多聚酶链反应(PCR)扩增获得鼠Rnf141基因并且与原核表达载体pGEX-5X-3(含GST标签)进行重组,将重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3),经1mmol/L IPTG在25℃条件下诱导,用SDS-PAG... 详细信息

目的获得小鼠Rnf141多克隆抗体,并对其功能进行初步研究。方法利用多聚酶链反应(PCR)扩增获得鼠Rnf141基因并且与原核表达载体pGEX-5X-3(含GST标签)进行重组,将重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3),经1mmol/L IPTG在25℃条件下诱导,用SDS-PAGE检测,获得GST-Rnf141融合蛋白高效表达后,通过Glutathione Sephorase4B纯化。纯化的融合蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,通过Western blot和免疫组织化学的方法检测抗体的特异性。结果成功构建了重组质粒pGEX-Rnf141,该质粒能在大肠杆菌BL21(DE3)中表达融合蛋白GST-Rnf141,融合蛋白表达量约占细菌总蛋白的46%,制备的多抗效价达1∶128000,它可以与GST-Rnf141重组蛋白和小鼠不同脏器组织Rnf141蛋白发生特异的抗原抗体反应,在脾脏和脑组织中Rnf141蛋白表达量较高。结论成功制备小鼠Rnf141多克隆抗体,该抗体为研究Rnf141的表达与功能提供了有用的工具。

关键词： Rnf141 融合蛋白多克隆抗体

肿瘤坏死因子α通过激活NF-κB信号通路加快肝细胞周期进程

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生物化学与生物物理进展 2007年第6期34卷 604-610页

作者：杨季云张思仲郭红曾祥元马布仁四川大学华西医院医学遗传研究室生物治疗国家重点实验室疾病基因组学研究室成都610041 四川大学生物治疗国家重点实验室基因工程小鼠中心成都610041 成都军区总医院临床实验科成都610083

在慢性炎症部位有易发肿瘤的倾向,大约有20%的恶性肿瘤发生与慢性炎症相关,肝细胞癌是世界第三大癌症死亡病因,其患者多数有慢性炎症病史,当炎症慢性迁延,肝细胞癌发生率明显增加.但慢性炎症与肿瘤发生与发展的细胞和分子机制仍然不清楚... 详细信息

在慢性炎症部位有易发肿瘤的倾向,大约有20%的恶性肿瘤发生与慢性炎症相关,肝细胞癌是世界第三大癌症死亡病因,其患者多数有慢性炎症病史,当炎症慢性迁延,肝细胞癌发生率明显增加.但慢性炎症与肿瘤发生与发展的细胞和分子机制仍然不清楚.利用人肝细胞株L-02细胞,研究肿瘤坏死因子α(TNF-α)对细胞周期的影响及其机制,并探讨核因子κB(NF-κB)和ERK1/2活化对细胞周期的影响,以期能更确切地阐明炎症介质TNF-α在肝细胞癌发生发展中的作用.发现TNF-α能促进肝细胞从G0/G1期向S期转换.蛋白质印迹检测表明,TNF-α能以剂量依赖方式诱导cyclinD1表达,而对cyclinE的表达无明显影响.同时TNF-α能激活NF-κB,ERK1/2,抑制NF-κB活化降低了TNF-α诱导的cyclinD1表达,导致细胞周期阻滞于G0/G1期.抑制ERK1/2活化则对细胞周期和cyclinD1表达无显著影响.结果提示,TNF-α通过活化NF-κB信号通路,诱导cyclinD1表达,加快细胞周期进程,这可能是促进肿瘤的发生发展重要机制.针对TNF-α和NF-κB的治疗可能延长慢性炎症相关性肿瘤的潜伏期和抑制肿瘤的发展.

关键词：肿瘤坏死因子α(TNF-α) 核因子κB(NF-κB) 胞外信号调节激酶(ERK) 细胞周期慢性炎症肿瘤发生

四川部分地区阿片类药物依赖人群生命质量及其影响因素的研究

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卫生研究 2007年第5期36卷 591-595页

作者：张本杨季云栾荣生张媛何静波涂国平贺伟旗四川省医学科学院四川省人民医院检验科成都610072 四川大学华西公共卫生学院成都市武侯区卫生局宜宾市卫生局成都市金牛区卫生局成都军区总医院

目的调查四川地区三城市阿片类药物依赖人群生命质量,找出影响生命质量的因素。方法用SF-36量表和PSSS量表来评估阿片类药物依赖人群的生命质量和社会支持,同时用自编量表调查该人群的一般特征及其与药物依赖相关的因素。用t检验、相关... 详细信息

目的调查四川地区三城市阿片类药物依赖人群生命质量,找出影响生命质量的因素。方法用SF-36量表和PSSS量表来评估阿片类药物依赖人群的生命质量和社会支持,同时用自编量表调查该人群的一般特征及其与药物依赖相关的因素。用t检验、相关分析、方差分析和多元线形逐步回归等统计分析对资料进行分析。结果①阿片类药物依赖人群的生命质量显著性低于正常对照人群(P<0.001);该人群的社会支持在PSSS量表所测的不同领域均低于对照人群(P<0.001)。②单因素分析时,年龄、婚姻状况、文化程度、职业、收入、吸烟、患有慢性病、社会支持的3个维度、吸毒方式、共用针管、家庭成员吸毒、吸毒时间、吸毒剂量、戒毒方式及复吸次数等17种因素与研究人群生命质量的各领域或部分领域均有关系。③多因素分析后发现,对研究人群生命质量的主要影响因素是吸毒时间、吸毒剂量、家庭外源性社会支持、全部社会支持、共用针管和收入。婚姻状况、家庭内源性社会支持、吸毒方式、患有慢性病、吸烟、家庭成员吸毒、戒毒方式及复吸次数等因素则对个别领域有影响。结论四川地区三城市阿片类药物依赖人群生命质量较低,且缺乏足够的社会支持。

关键词：吸毒者生命质量药物依赖海洛因