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多酶级联反应催化γ-丁内酯生成1,4-丁二醇

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应用与环境生物学报 2024年第1期30卷 167-175页

作者：郭艺鸣姜君逸潘学玮张显徐美娟杨套伟饶志明江南大学生物工程学院工业生物技术教育部重点实验室无锡214122

1,4-丁二醇是一种重要的化学品中间体,已被列入NICNAS高价值量工业化学品清单(HVICL).随着1,4-丁二醇的全球市场需求量不断增加,利用微生物法合成1,4-丁二醇已成为关注热点.基于多酶级联催化构建了一条以γ-丁内酯为底物合成1,4-丁二醇... 详细信息

1,4-丁二醇是一种重要的化学品中间体,已被列入NICNAS高价值量工业化学品清单(HVICL).随着1,4-丁二醇的全球市场需求量不断增加,利用微生物法合成1,4-丁二醇已成为关注热点.基于多酶级联催化构建了一条以γ-丁内酯为底物合成1,4-丁二醇的路径,首先通过己内酯水解酶(ChnC)将γ-丁内酯水解为4-羟基丁酸,接着在羧酸还原酶(Car)的作用下,将4-羟基丁酸还原成4-羟基丁醛,随后,利用醇脱氢酶(YqhD)将4-羟基丁醛进一步还原生成1,4-丁二醇;同时通过引入了甲酸脱氢酶(FDH)构建了NADH/NAD+辅酶循环再生系统.最后对底物添加浓度、催化温度、pH和多酶添加比例进行了优化.综合3种酶的最适反应条件优化之后,在30℃、pH 7.0、酶活力添加比例为1:3:2的优化条件下,以5 g/Lγ-丁内酯为底物,1,4-丁二醇产量达到2.41 g/L,摩尔转化率为46.1%,与优化前相比分别提高了375.46%和374.79%.最后,通过底物补加试验,1,4-丁二醇的合成量最高达到6.31 g/L,摩尔转化率最高达到67.3%.本研究基于新设计的1,4-丁二醇多酶级联催化路径,实现了1,4-丁二醇酶法合成,结果有望为酶催化合成1,4-丁二醇及其高附加值衍生的产品提供一种新的思路.(图12表2参41)

关键词：多酶级联转化辅酶循环再生 γ-丁内酯 1,4-丁二醇

基于蛋白表面电荷工程分子改造枯草芽孢杆菌谷氨酸脱氢酶最适催化pH

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应用与环境生物学报 2023年第1期29卷 7-14页

作者：武文慧刘菲王雅玲杨套伟饶志明江南大学生物工程学院工业生物技术教育部重点实验室无锡214122

谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase,GDH)催化L-谷氨酸可逆氧化脱氨生成α-酮戊二酸,为研究其催化特性,在大肠杆菌中克隆表达了枯草芽孢杆菌来源的谷氨酸脱氢酶(BsGDH).酶学特征表明,BsGDH具有氧化和还原双向酶活性且最适催化温度分... 详细信息

谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase,GDH)催化L-谷氨酸可逆氧化脱氨生成α-酮戊二酸,为研究其催化特性,在大肠杆菌中克隆表达了枯草芽孢杆菌来源的谷氨酸脱氢酶(BsGDH).酶学特征表明,BsGDH具有氧化和还原双向酶活性且最适催化温度分别为60℃和65℃,最适催化pH均为弱碱性(分别为pH 8.0和pH 7.5),但在弱碱环境下(pH 7.0-8.0)该酶稳定性较差.为提高BsGDH在催化合成α-酮戊二酸应用中的经济性,基于蛋白表面电荷工程,对该酶进行分子改造,以期将其催化最适pH调至其稳定性较高的中性环境.首先利用ROSETTA软件选择7个突变候选位点,结果发现突变体N16D和K218D催化谷氨酸合成α-酮戊二酸的最适pH由8.0下调至7.0,同时在pH 7.0条件下酶活较野生型分别提高2.9倍和5.4倍,且逆反应还原方向酶活降低.另外,突变体N16D和K218D热稳定性都得到显著改善,50℃下放置3 h后,突变体N16D可以保持54%左右的酶活,K218D保持40%左右的酶活,而野生型酶活此时完全丧失.本研究成功将BsGDH最适催化pH范围下调至其稳定性良好的pH范围.(图10表3参23)

关键词：谷氨酸脱氢酶酶学性质最适pH 表面电荷工程定点突变

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重组大肠杆菌全细胞催化高效合成胆绿素

生物工程学报 2022年第7期38卷 2581-2593页

作者：闫思翰邵明龙徐美娟张显杨套伟饶志明江南大学生物工程学院工业生物技术教育部重点实验室江苏无锡214122

胆绿素作为一种重要的保护细胞的抗氧化剂,其传统生产方法主要由胆红素的化学氧化产生,但过程复杂、纯度不高。本研究提出了一种高效、绿色、安全的生产胆绿素的方法。通过比较,筛选得到了破伤风梭状芽孢杆菌(Clostridium tetani)来源... 详细信息

胆绿素作为一种重要的保护细胞的抗氧化剂,其传统生产方法主要由胆红素的化学氧化产生,但过程复杂、纯度不高。本研究提出了一种高效、绿色、安全的生产胆绿素的方法。通过比较,筛选得到了破伤风梭状芽孢杆菌(Clostridium tetani)来源的血红素加氧酶(heme oxygenase,HO)基因,并成功构建具备转化血红素合成胆绿素能力的重组大肠杆菌(Escherichiacoli)BL21/pETDuet-hoCt。在pH 7.0、35℃、100 mg/L底物浓度条件下胆绿素产量为32.9 mg/L。为提高还原力,构建了基于谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase,GdhA)的NADPH辅酶再生系统,获得重组菌E.coli BL21/pETDuet-gdhAEc-hoCt,胆绿素产量为71.5 mg/L。此外,通过引入膜表面展示系统,构建重组菌E.coli BL21/pETDuet-gdhAEc-blc/hoCt,缩短转化时间的同时,胆绿素产量进一步得到提高,达到76.3 mg/L,是目前生物法合成胆绿素的最高研究报道。本研究为胆绿素的绿色生产奠定了良好的基础。

关键词：血红素加氧酶谷氨酸脱氢酶锚定蛋白胆绿素IXα 生物催化合成生物学

谷氨酸棒杆菌anti-σ因子CseE及其突变体与σ因子SigE的相互作用分析

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微生物学报 2022年第9期62卷 3542-3557页

作者：上官春雨徐美娟夏博雅杨套伟张显饶志明江南大学生物工程学院工业生物技术教育部重点实验室江苏无锡214122

【目的】谷氨酸棒杆菌是重要的氨基酸生产菌株,本研究针对SigE与ZAS家族蛋白CseE相互作用机制进行探索研究,重点分析CseE突变体影响与SigE结合能力的机制。【方法】本研究选择谷氨酸棒杆菌ATCC 13032来源的SigE和CseE蛋白为研究目标,利... 详细信息

【目的】谷氨酸棒杆菌是重要的氨基酸生产菌株,本研究针对SigE与ZAS家族蛋白CseE相互作用机制进行探索研究,重点分析CseE突变体影响与SigE结合能力的机制。【方法】本研究选择谷氨酸棒杆菌ATCC 13032来源的SigE和CseE蛋白为研究目标,利用遗传学方法获得过表达的重组谷氨酸棒杆菌,通过RT-qPCR研究SigE调控sigE和cseE的转录情况。同时,利用ITC和His pull-down实验验证ZAS家族的CseE蛋白与Zn^(2+)及SigE的结合情况。之后对CseE蛋白进行功能域分析、多序列比对,研究功能域关键氨基酸位点对SigE结合能力的影响。其次对SigE和CseE蛋白进行分子对接和动力学模拟,分析关键氨基酸影响其结合的机制。【结果】谷氨酸棒杆菌SigE调控基因sigE和cseE的转录并且其活性受CseE蛋白控制。CseE蛋白为ZAS家族蛋白,具有Zn^(2+)结合能力。CseE_(His83A)、CseE_(cys87A)和CseE_(cys90A)突变体不会影响与SigE的结合能力,而CseE_(C87A-C90A)和CseE_(His83A-C87A-C90A)突变体与SigE的结合能力略有下降。分子动力学模拟发现SigE-CseE_(C87A-C90A)和SigE-CseE_(His83A-C87A-C90A)之间的结合能量为−17.23 kcal/mol和−14.06 kcal/mol,分别比未突变体系结合能量降低22.8%及36.9%。【结论】谷氨酸棒杆菌SigE通过聚集RNA聚合酶来调控基因sigE和cseE的表达。CseE蛋白属于ZAS家族,具有Zn^(2+)结合能力同时通过与SigE蛋白互作来抑制SigE活性。CseE_(C87A-C90A)及CseE_(His83A-C87A-C90A)突变体能影响与SigE结合的能力,减弱对SigE活性的控制。本研究产生的三维结构和确定的氨基酸关键位点为后续探索谷氨酸棒杆菌SigE和CseE响应环境压力机制提供了理论基础。

关键词： SigE CseE anti-σ因子 ZAS家族谷氨酸棒杆菌

钝齿棒杆菌异源表达乙酰辅酶A合成酶对L-精氨酸合成的影响

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食品与发酵工业 2022年第21期48卷 9-16页

作者：吴洁琴石电徐华张显杨套伟徐美娟饶志明江南大学生物工程学院江苏无锡214122

L-精氨酸是一种人体必需氨基酸,在医疗保健、食品添加等制造行业中商业价值显著。针对1株产L-精氨酸的钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)SYPA5-5进行代谢改造,通过比较异源乙酰辅酶A合成酶(acetyl-CoA synthetases,ACS)的酶学性质,... 详细信息

L-精氨酸是一种人体必需氨基酸,在医疗保健、食品添加等制造行业中商业价值显著。针对1株产L-精氨酸的钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)SYPA5-5进行代谢改造,通过比较异源乙酰辅酶A合成酶(acetyl-CoA synthetases,ACS)的酶学性质,构建了过表达ACS的重组钝齿棒杆菌SYPA-ACS,能有效利用乙酸提高菌株产L-精氨酸能力。首先在大肠杆菌中分别克隆表达及纯化4种不同细菌来源的ACS,发现巴氏醋酸杆菌(Acetobacter pasteurianus)ATCC 33445来源的ApACS1酶活力最高,为784.59 U/mL,最适反应的pH为7.0,最适反应温度37℃,与其他3种ACS来源相比,ApACS1具有更好的pH和温度稳定性。然后通过pXMJ19载体,将A.pasteurianus来源的编码基因acs_(1)在C.crenatum中表达,有效提高了乙酰辅酶A含量。利用5 L发酵罐,将SYPA-ACS菌株培养96 h后,L-精氨酸的产量达53.43 g/L,产率为0.577 g/(L·h),相较于出发菌株SYPA5-5,产量提高了27.48%。该策略既可以利用乙酸,降低乙酸对菌株的危害作用,又能提高乙酰辅酶A的含量,促进L-精氨酸的积累。研究结果为L-精氨酸的制备提供了绿色、高效的合成策略,具有工业化应用潜力。

关键词： L-精氨酸钝齿棒杆菌乙酰辅酶A合成酶 ApACS1 乙酸

大肠杆菌胞内半胱氨酸响应型启动子的筛选表征

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微生物学报 2023年第3期63卷 1204-1216页

作者：刘雪琪傅雅雯李鲁华杨套伟饶志明江南大学生物工程学院工业生物技术教育部重点实验室江苏无锡214122

【目的】半胱氨酸是一种重要的含硫氨基酸,广泛应用于化妆品、药品、食品等行业,微生物发酵法合成半胱氨酸已成为当前研究的热点。基于比较转录组学分析等技术,筛选并表征大肠杆菌(Escherichia coli)胞内对半胱氨酸浓度变化显著响应的... 详细信息

【目的】半胱氨酸是一种重要的含硫氨基酸,广泛应用于化妆品、药品、食品等行业,微生物发酵法合成半胱氨酸已成为当前研究的热点。基于比较转录组学分析等技术,筛选并表征大肠杆菌(Escherichia coli)胞内对半胱氨酸浓度变化显著响应的启动子。【方法】在Escherichia coli W3110培养基中外源添加不同终浓度的半胱氨酸,通过比较转录组学分析筛选转录水平显著响应半胱氨酸浓度变化的基因,融合目标基因的启动子片段与荧光报告基因egfp构建启动子文库,进一步测定不同半胱氨酸浓度条件下,含有不同启动子重组菌的绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)荧光强度。【结果】筛选并挖掘了随着半胱氨酸浓度提高而转录水平显著提升的27个基因,并将基因的潜在启动子片段与荧光报告基因egfp融合构建启动子文库,筛选获得对半胱氨酸变化具备特异性响应的启动子PE2。最后,对PE2启动子−35区间隔区域AAAT进行随机突变,最终获得在1−7 g/L半胱氨酸浓度范围内特异性响应性能显著提高的启动子PE2-33。【结论】本研究筛选表征的启动子PE2-33是半胱氨酸特异性响应型启动子,为构建半胱氨酸特异性生物传感器并用于半胱氨酸高产菌的高通量筛选奠定了基础。

关键词：大肠杆菌半胱氨酸启动子响应型

钝齿棒杆菌黄素血红蛋白Hmp在L-精氨酸合成中的作用

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应用与环境生物学报 2022年第3期28卷 561-568页

作者：孙聪陈鑫上官春雨张显杨套伟徐美娟饶志明江南大学生物工程学院工业生物技术教育部重点实验室无锡214122

钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)SYPA5-5是本实验室选育的一株L-精氨酸高产菌,基于前期转录组和蛋白组数据分析,发现黄素血红蛋白(flavohemoglobin,Hmp)在高氮源相对于低氮源条件下表达水平上调,进一步研究Hmp的抗氧化胁迫功能和... 详细信息

钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)SYPA5-5是本实验室选育的一株L-精氨酸高产菌,基于前期转录组和蛋白组数据分析,发现黄素血红蛋白(flavohemoglobin,Hmp)在高氮源相对于低氮源条件下表达水平上调,进一步研究Hmp的抗氧化胁迫功能和在L-精氨酸合成中的作用.构建了hmp过表达和敲除菌株,首先以Hmp蛋白为研究对象,分析Hmp的圆二色谱结构,用SWISS-MODEL建模分析,测其NAD(P)H氧化酶酶活,验证了Hmp的结构与功能.接下来研究Hmp与氧化应激之间的关系,首先测定发酵过程胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平以及超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)酶活,最后通过5-L发酵罐扩大发酵体系来探究Hmp在L-精氨酸合成中的作用.过表达hmp在发酵过程中降低了活性氧水平,分别提高了9.2%和8.7%的SOD和CAT酶活,促进了菌体生长代谢和提高目标代谢产物的积累.通过检测发酵过程的细胞干重、葡萄糖含量和L-精氨酸产量,发现hmp过表达菌株Cc-hmp的L-精氨酸产量和得率相比于原始菌株Cc5-5分别提高了19.7%和29.6%,hmp敲除菌株Cc-Δhmp的L-精氨酸产量和得率相比于原始菌株Cc5-5分别减少37.9%和14.8%.本研究表明高氮高溶氧条件下,使用发酵法生产L-精氨酸的过程中,氧化应激的产生及带来的氧化损伤不可避免,Hmp可以有效抵抗胞内氧化应激,改善胞内的氧化还原状态,维持一个良好的胞内环境,从而提高L-精氨酸的产量.(图10表3参31)

关键词： L-精氨酸钝齿棒杆菌黄素血红蛋白Hmp 氧化应激

重组谷氨酸棒杆菌全细胞催化一步法合成高果糖浆

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食品与发酵工业 2022年第2期48卷 8-14页

作者： HABIMANA 乔郅钠徐美娟杨套伟张显邵明龙饶志明江南大学生物工程学院江苏无锡214122

高果糖浆是一种可替代蔗糖的甜味剂,在食品和饮料行业应用广泛。该研究实现了经密码子优化的密苏里游动放线菌(Actinoplanes missouriensis) CICIM B0118(A)来源的葡萄糖异构酶在食品安全菌株谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum) ... 详细信息

高果糖浆是一种可替代蔗糖的甜味剂,在食品和饮料行业应用广泛。该研究实现了经密码子优化的密苏里游动放线菌(Actinoplanes missouriensis) CICIM B0118(A)来源的葡萄糖异构酶在食品安全菌株谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum) 13032中的异源表达,构建了重组谷氨酸棒杆菌C.glutamicum 13032/pXMJ19-xylA。以其细胞菌体作为全细胞催化剂,对D-葡萄糖异构化生成D-果糖的全细胞转化体系进行优化,结果表明,菌体质量浓度40 g/L、底物D-葡萄糖质量浓度180 g/L、Mg^(2+)浓度10 mmol/L、Co^(2+)浓度1 mmol/L,70℃、220 r/min下连续转化18 h,D-果糖质量浓度达到103.32 g/L,转化率为57.4%,实现了高果糖浆的一步法安全生物合成。该研究为高果糖浆的工业化生产提供了实验和理论基础,具有重要的参考价值。

关键词：葡萄糖异构酶异构化全细胞催化谷氨酸棒杆菌高果糖浆

理性代谢工程改造促进谷氨酸棒杆菌高效合成L-谷氨酸

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生物工程学报 2023年第8期39卷 3273-3289页

作者：刘佳峰乔郅钠赵有玺徐美娟张显杨套伟饶志明江南大学生物工程学院江苏无锡214122 北京联合大学生物化学工程学院北京100023

L-谷氨酸是世界上第一大宗氨基酸产品,广泛应用于食品医药及化工等行业。以谷氨酸高产菌谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)G01为出发菌株,首先通过敲除主要副产物丙氨酸合成相关基因-丙氨酸氨基转移酶编码基因(alaT),降低了发... 详细信息

L-谷氨酸是世界上第一大宗氨基酸产品,广泛应用于食品医药及化工等行业。以谷氨酸高产菌谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)G01为出发菌株,首先通过敲除主要副产物丙氨酸合成相关基因-丙氨酸氨基转移酶编码基因(alaT),降低了发酵副产物丙氨酸含量。其次,α-酮戊二酸节点碳流量对谷氨酸合成起重要作用,因此,采用核糖体结合位点(ribosome-binding site,RBS)序列优化降低了α-酮戊二酸脱氢酶的活性,强化了谷氨酸合成代谢流。同时通过筛选不同来源的谷氨酸脱氢酶,加强了α-酮戊二酸内源转化为谷氨酸的能力。接着,对谷氨酸转运蛋白进行理性设计,提高了谷氨酸的外排能力。最后,对基于以上策略构建的整合菌株进行了5L发酵罐发酵优化,通过梯度升温结合分批补料策略,谷氨酸产量为(136.33±4.68)g/L,较原始菌的产量(96.53±2.32)g/L提高了41.2%;糖酸转化率为55.8%,较原始菌的44.2%提高了11.6%;且降低了副产物丙氨酸的含量。以上策略一定程度上提高了谷氨酸的产量与糖酸转化率,可为谷氨酸生产菌株的代谢改造提供参考。

关键词：谷氨酸棒杆菌谷氨酸转录分析核糖体结合位点(RBS)序列优化谷氨酸转运蛋白