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HCV不同长度NS5B的表达纯化及体外活性测定新方法的建立

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HCV不同长度NS5B的表达纯化及体外活性测定新方法的建立

作者：杨华凤南京医科大学

学位级别：硕士

全球有3%的人感染丙型肝炎病毒(HCV),可导致肝硬化和肝癌等慢性肝病。目前,无HCV疫苗,主要用α-干扰素和利巴韦林治疗,但有较大的副反应,并且应答率仅约50%。因此,需要研制出更有效更广谱的抑制剂。HCV NS5B是RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp),... 详细信息

全球有3%的人感染丙型肝炎病毒(HCV),可导致肝硬化和肝癌等慢性肝病。目前,无HCV疫苗,主要用α-干扰素和利巴韦林治疗,但有较大的副反应,并且应答率仅约50%。因此,需要研制出更有效更广谱的抑制剂。HCV NS5B是RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp),是HCV复制的关键酶,在正常的宿主细胞中不存在这个酶的相似结构同系物。因此这是一个抗病毒研究的很好的靶标,已用于体外筛选HCV抑制剂。体外筛选HCV NS5B蛋白酶抑制剂的关键是获得溶解性好、活性高的NS5B蛋白,NS5B蛋白C端对其酶活性及水溶性有影响。本研究制备NS5B蛋白C端删除不同长度的三种重组蛋白,以筛选溶解性好、活性高的NS5B蛋白,建立体外检测NS5B蛋白RNA依赖的RNA聚合酶活性的新方法,为高通量筛选HCV抑制剂奠定基础。构建了高效表达全长NS5B(NS5B-FL)、C端截短21个氨基酸NS5B(NS5B-C21)及C端截短51个氨基酸NS5B(NS5B-C51)蛋白的三种工程菌。利用PCR技术扩增三种长度的NS5B基因,BamHⅠ和XhoⅠ双酶酶切后连接到经同样酶酶切的原核表达载体pET-28a(+)上,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳进行鉴定。成功构建了三种重组质粒pET-28a(+)-NS5B-FL,pET-28a(+)-NS5B-C21,pET-28a(+)-NS5B-C51,分别表达6His-NS5B-FL,6His-NS5B-C21,6His-NS5B-C51三种融合蛋白,表达的6His-NS5B-FL主要以包涵体形式存在,而表达的6His-NS5B-C21、6His-NS5B-C51的可溶性明显增加。建立了表达的三种HCV NS5B蛋白的纯化方法,纯化获得了三种蛋白。为易于纯化,在表达三种蛋白的C端均增加了6xHis标签,用Ni柱亲和层析纯化,获得的三种蛋白经SDS-PAGE检测,均显示单一的蛋白条带。纯化的NS5B-C21蛋白浓度相对较高,选用此蛋白用于NS5B RNA聚合酶活性分析。对获得的三种蛋白的抗原性进行了分析,间接ELISA法检测已知的HCV抗体阳性及阴性血清,显示三种蛋白均有较好的抗原性和特异性,提示该蛋白不仅可用于酶活性分析,也可能用于抗体检测及研制检测试剂。将纳米磁分离、酶联等技术相结合,利用表达的NS5B蛋白,建立了一种体外检测NS5B RNA聚合酶活性的新方法。将RNA模板修饰固定在核壳结构复合磁性纳米颗粒上并加入磁分离微孔反应管内,再加入引物,纯化的NS5B蛋白酶,NTP,Bio-11-UTP等反应体系。通过掺入生物素标记单体,利用NS5B蛋白的RNA依赖的RNA聚合酶的活性,使另一条RNA链得到延伸,在外磁场下分离除去非特异性吸附片段,再与酶标记的亲和素结合,洗涤后,向微孔内加入底物显色剂,通过是否显色来判定NS5B蛋白酶活性。该方法可直接通过显色来检测NS5B的RNA聚合酶活性,并且可以在96孔板内进行高通量检测,为高通量筛选NS5B蛋白酶抑制剂奠定了基础。

关键词：丙型肝炎病毒非结构区5B蛋白 RNA依赖的RNA聚合酶基因克隆蛋白表达、纯化磁性纳米颗粒活性测定

丙型肝炎病毒NS5B全长基因及截短形式基因的克隆、表达及鉴定

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中国生物制品学杂志 2008年第1期21卷 1-4页

作者：杨华凤潘明洁吕敏李越希南京医科大学公共卫生学院流行病与卫生统计学系南京210029 南京军区军事医学研究所南京210002

目的构建丙型肝炎病毒(HCV)NS5B-FL、NS5B-C21和NS5B-C51重组原核表达载体,并进行目的蛋白的表达及鉴定。方法利用PCR技术扩增3种长度的NS5B基因,经BamHI和XhoI双酶切后连接到经同样酶切的原核表达载体pET-28a(+)上,转化大肠杆菌BL21(DE... 详细信息

目的构建丙型肝炎病毒(HCV)NS5B-FL、NS5B-C21和NS5B-C51重组原核表达载体,并进行目的蛋白的表达及鉴定。方法利用PCR技术扩增3种长度的NS5B基因,经BamHI和XhoI双酶切后连接到经同样酶切的原核表达载体pET-28a(+)上,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达重组蛋白,并进行纯化及鉴定。结果所构建的3种重组质粒pET-28a(+)-NS5B-FL、pET-28a(+)-NS5B-C21和pET-28a(+)-NS5B-C51,转化大肠杆菌BL21(DE3)后,经PCR及酶切鉴定,均能扩增或酶切出相应大小的目的基因片段,表达的6His-NS5B-FL融合蛋白主要以包涵体形式存在,而表达的6His-NS5B-C21和6His-NS5B-C51融合蛋白的可溶性明显增加。纯化的6His-NS5B-C21蛋白未发生降解,6His-NS5B-FL和6His-NS5B-C51蛋白发生了部分降解。纯化后的3种蛋白均能与丙肝患者血清发生反应。结论已成功构建了3种NS5B基因的重组表达载体,并获得了目的蛋白表达,为进一步抗HCV药物的筛选奠定基础。

关键词：丙型肝炎病毒非结构区5B蛋白克隆表达

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西安市孕产妇保健服务效果分析

中国妇幼保健 2007年第27期22卷 3793-3795页

作者：杨华凤张水平陕西省西安市妇幼保健院 710002

目的:降低孕产妇和围产儿死亡率。方法:通过西安市妇幼保健网络逐级上报的《孕产妇保健情况年报》,收集西安市1999年10月1日～2005年9月30日期间的孕产妇,数据采用EXCEL电子表格进行数据录入,SPSS13.0软件包进行统计学处理。结果:保健... 详细信息

目的:降低孕产妇和围产儿死亡率。方法:通过西安市妇幼保健网络逐级上报的《孕产妇保健情况年报》,收集西安市1999年10月1日～2005年9月30日期间的孕产妇,数据采用EXCEL电子表格进行数据录入,SPSS13.0软件包进行统计学处理。结果:保健服务率逐年上升,孕产妇、围产儿死亡率逐年下降,住院分娩率与孕产妇、围产儿死亡率相关性最大。结论:采取多种措施提高围产期保健服务,尤其是孕产妇系统保健管理率和孕产妇住院分娩率,对降低孕产妇和围产儿死亡率具有重要意义。

关键词：孕产妇围产儿死亡率保健服务

南京市2011-2016年主要慢性病早死概率变化趋势分析

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中国卫生统计 2018年第5期35卷 769-771页

作者：杨华凤陈旭鹏洪忻徐斐南京市疾病预防控制中心 210003

目的描述2011-2016年南京市30至70岁户籍居民主要慢性病死亡的特征,分析重大慢性病早死概率的流行趋势,为政府制定慢性病防制规划提供依据。方法采用年估计变化百分比(EAPC)分析南京市2011-2016年户籍人口心脑血管疾病、恶性肿瘤、糖尿... 详细信息

目的描述2011-2016年南京市30至70岁户籍居民主要慢性病死亡的特征,分析重大慢性病早死概率的流行趋势,为政府制定慢性病防制规划提供依据。方法采用年估计变化百分比(EAPC)分析南京市2011-2016年户籍人口心脑血管疾病、恶性肿瘤、糖尿病、慢性呼吸系统疾病等四类主要慢性病死亡特征及其变化趋势,利用寿命表计算主要慢性病过早死亡概率。结果 2011-2016年,南京市30～70岁户籍人口主要慢性病死亡率230. 72/10万(225. 58/10万～251. 60/10万),其中,心脑血管疾病(EAPC=-2. 67%,P=0. 034)、慢性呼吸系统疾病(EAPC=-3. 52%,P=0. 018)死亡率呈下降趋势,而糖尿病死亡率上升(EAPC=-3. 96%,P=0. 031)。主要慢性病早死概率由2011年的15. 61%下降到2016年的10. 10%。结论 2011年以来,南京市30至70岁户籍居民主要慢性病早死概率不断下降,慢性病的过早死亡是可以预防的,政府部门需进一步制定促进健康生活方式和保证公平的卫生保健的政策,以减少慢性病的过早死亡。

关键词：慢性病过早死亡死亡率年估计变化百分比(EAPC)

南京中学生抑郁症状现状及其与父母职业状况的关系

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卫生研究 2013年第4期42卷 637-641页

作者：洪忻李解权王志勇梁亚琼杨华凤徐斐南京市疾病预防控制中心南京210003

目的了解南京市中学生抑郁症状流行现状,并探讨父母职业状况与抑郁症状的关联。方法采用分层整群随机抽样方法,使用抑郁自评量表(SDS),于2009年从南京市6个主城区中随机选取白下区,抽取5所中学(初中3所、高中2所)所有初一和高一年级,共5... 详细信息

目的了解南京市中学生抑郁症状流行现状,并探讨父母职业状况与抑郁症状的关联。方法采用分层整群随机抽样方法,使用抑郁自评量表(SDS),于2009年从南京市6个主城区中随机选取白下区,抽取5所中学(初中3所、高中2所)所有初一和高一年级,共53个班级2202名在校中学生开展抑郁基线调查。于2010年和2011年分别针对同一样本人群进行连续2年随访调查。父母职业状况分为父母均有工作、父亲失业、母亲失业、父母均失业4类。基线实际调查2160名中学生,调查率为98.1%。1年后、2年后随访调查2118名和2032名中学生,随访率分别为98.1%、94.1%。结果 3次调查相比,抑郁症状检出率差异无显著性(P=0.108),但中度、重度抑郁比例有所提高,差异有显著性(P=0.002)。父母均失业的中学生SDS标准总分、抑郁症状检出率及中重度抑郁症状所占比例均最高。经多因素Logistic回归分析,与父母均有工作的中学生相比,父母均失业的中学生基线、1年后随访、2年后随访罹患抑郁的风险逐渐增大,仅2年后随访差异有统计学意义。广义估计方程回归分析表明,父母职业状况与中学生抑郁症状有关联,父或母失业、父母均失业是抑郁症状的危险因素,差异均有统计学意义。结论南京中学生抑郁症状的比例较高,且父母职业状况是中学生抑郁症状的影响因素。

关键词：抑郁症状中学生抑郁自评量表父母职业状况随访研究

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南京市城区居民膳食模式与腰围及血脂的关系

卫生研究 2015年第6期44卷 996-998页

作者：叶青洪忻王志勇梁亚琼杨华凤徐斐南京市疾病预防控制中心慢病防制科南京210003

目的了解南京市城区居民的膳食模式与腰围(WC)及血脂的关系。方法采用多阶段分层整群随机抽样方法,对南京市2个城区7个社区年满30周岁的常住居民进行调查。采用专门设计的食物频数量表,应用探索性因子分析方法建立膳食模式,分析不同膳... 详细信息

目的了解南京市城区居民的膳食模式与腰围(WC)及血脂的关系。方法采用多阶段分层整群随机抽样方法,对南京市2个城区7个社区年满30周岁的常住居民进行调查。采用专门设计的食物频数量表,应用探索性因子分析方法建立膳食模式,分析不同膳食模式与腰围及血脂的关系。结果因子分析共得到5种膳食模式:调味品模式、动植物蛋白质模式、传统健康模式、甜食模式和饮品模式。经多因素调整后,越倾向动植物蛋白质模式的人群WC、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)水平越高;越倾向于传统健康模式的人群WC水平越低;越倾向于饮品模式的人群WC和TG水平越高。饮品模式人群的WC水平高于其他4种膳食模式人群;饮品模式和动植物蛋白质模式人群的TG高于其他3种膳食模式人群。结论膳食模式与WC、TC及TG密切相关。

关键词：膳食模式因子分析腰围血脂

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浅谈班主任工作

雅安职业技术学院学报 2008年第4期22卷 98-99页

作者：杨华凤名山县解放小学

记得在一本书上看到，老师分四种类型：智慧爱心型，爱心操劳型，操劳劳良心型，良心应付型。记得一个优秀班主任在做经验报告的时说：班主任在，学生能做好，是一个基本合格的班主任；班主任不在，学生能做好，是一个优秀的班主任；班... 详细信息

记得在一本书上看到，老师分四种类型：智慧爱心型，爱心操劳型，操劳劳良心型，良心应付型。记得一个优秀班主任在做经验报告的时说：班主任在，学生能做好，是一个基本合格的班主任；班主任不在，学生能做好，是一个优秀的班主任；班主任在，学生仍不能做好，则是一个失败的班主任。工作以来我一直积极思考如何做好班主任工作，希望自己成为一名智慧爱心型的优秀班主任。下面，我就谈谈我的具体工作和具体做法。

关键词：班主任工作优秀班主任爱心学生智慧良心老师

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中职院校财务管理体制创新探析

财经界 2020年第6期 176-177页

作者：杨华凤北海市中等职业技术学校

中职院校的主要目标是培养拥有一技之长的技术人员,从整体上看这些技术性人才在我国市场经济建设中发挥出了非常重要的作用。但是近年来中职院校的财务管理体制并没有紧跟学校内部管理以及社会经济发展情况进行改革创新,从而对中职院校... 详细信息

中职院校的主要目标是培养拥有一技之长的技术人员,从整体上看这些技术性人才在我国市场经济建设中发挥出了非常重要的作用。但是近年来中职院校的财务管理体制并没有紧跟学校内部管理以及社会经济发展情况进行改革创新,从而对中职院校的进一步发展造成了很大的阻碍。在这种情况下,有必要就中职院校财务管理体制的改革创新进行分析和探讨,从而使中职院校的财务管理能力能够得到有效的提高,最终实现中职院校的健康可持续发展,切实履行职责,创新人才培养机制,为社会培养出更多的技术人才。

关键词：中职院校财务管理体制创新

《政府会计制度》对学校财务管理工作的影响探讨

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当代会计 2019年第11期 64-65页

作者：杨华凤北海市中等职业技术学校

《政府会计制度》当前已经经过了一段时间的使用和验证,发现在一些学校的运行过程中其能够发挥更好的作用.基于对《政府会计制度》下,学校财务管理工作存在问题的分析,探索了《政府会计制度》对财务管理工作方面的影响,在此基础上,针对... 详细信息

《政府会计制度》当前已经经过了一段时间的使用和验证,发现在一些学校的运行过程中其能够发挥更好的作用.基于对《政府会计制度》下,学校财务管理工作存在问题的分析,探索了《政府会计制度》对财务管理工作方面的影响,在此基础上,针对学校财务管理工作中出现的问题提出具体解决办法.

关键词：《政府会计制度》学校财务管理财务会计管理会计