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二倍体酿酒酵母表面展示半纤维素酶进行木质纤维素乙醇发酵的研究

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太阳能学报 2017年第12期38卷 3455-3460页

作者：杜济良杨玥田沈首都师范大学生命科学学院北京100048

拟构建一株可利用木糖产乙醇的二倍体酿酒酵母Y5,并通过a凝集素表面展示系统实现β-D-1,4内切木聚糖酶(XYNII)、β-D-1,4外切木糖苷酶(Xyl A)表面固定化。通过对菌株免疫荧光验证及酶催化活性的测定,证明融合蛋白以活性形式固定在细胞... 详细信息

拟构建一株可利用木糖产乙醇的二倍体酿酒酵母Y5,并通过a凝集素表面展示系统实现β-D-1,4内切木聚糖酶(XYNII)、β-D-1,4外切木糖苷酶(Xyl A)表面固定化。通过对菌株免疫荧光验证及酶催化活性的测定,证明融合蛋白以活性形式固定在细胞表面。以木聚糖为底物进行乙醇发酵实验,96 h时最大乙醇产量达0.62 g/L,乙醇产率为0.19 g/g,相当于理论值的37.3%。结果证明表面展示半纤维素酶的酿酒酵母可自主降解木聚糖生成木糖,并且利用木糖生产乙醇。

关键词：酿酒酵母细胞工程半纤维素酶半纤维素乙醇

复合功能嵌合纤维小体空间结构优化及性能研究

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太阳能学报 2022年第6期43卷 246-250页

作者：杜济良祁琪刘涵王旭昕万平田沈植物基因资源与低碳生物技术北京市重点实验室北京100048 首都师范大学生命科学学院北京100048

该研究成功构建4种杂合纤维小体支架蛋白,并将纤维素酶与其在胞外组装成空间结构不同的嵌合纤维小体,分析了嵌合纤维小体的酶的热稳定性和酶解动力学特征。并基于酿酒酵母EBY100细胞表面展示系统锚定优化前后的支架蛋白以组装嵌合纤维... 详细信息

该研究成功构建4种杂合纤维小体支架蛋白,并将纤维素酶与其在胞外组装成空间结构不同的嵌合纤维小体,分析了嵌合纤维小体的酶的热稳定性和酶解动力学特征。并基于酿酒酵母EBY100细胞表面展示系统锚定优化前后的支架蛋白以组装嵌合纤维小体进行纤维素同步糖化发酵产乙醇性能分析。结果表明嵌合纤维小体的酶活性在50℃下维持相对稳定状态达到120 h。其中ScafI-Ⅳ型支架蛋白嵌合纤维小体的V_(max)=0.147 mg/(mL·min),K_(m)=6.085 mg/mL及水解纤维素的还原糖产量均高于其他3种结构嵌合纤维小体。CBP酿酒酵母菌群以磷酸膨胀纤维素为底物进行同步糖化发酵产乙醇,ScafI-Ⅳ型结构嵌合纤维小体在96 h时乙醇产量达到1.12 g/L,产量为0.263 g/g,相当于乙醇产率理论值的51.50%。该结果证明通过优化支架蛋白结构可改善嵌合纤维小体的酶解性能,并对于人工设计纤维小体的研究具有一定的理论意义。

关键词：酿酒酵母纤维素乙醇空间结构表面展示纤维小体

分子伴侣与信号肽对分泌蛋白在巴斯德毕赤酵母中表达水平的影响研究

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分子伴侣与信号肽对分泌蛋白在巴斯德毕赤酵母中表达水平的影响研...

作者：杜济良中国人民解放军军事医学科学院

学位级别：硕士

巴斯德毕赤酵母表达系统是一种得到广泛应用的蛋白质表达工具,其相对较高的表达水平,日臻成熟的发酵工艺以及易于操作的蛋白质纯化工艺等特点,使其成为现代蛋白质基因工程药物表达的首选工程菌。但是,随着新的外源蛋白在酵母系统中的表... 详细信息

巴斯德毕赤酵母表达系统是一种得到广泛应用的蛋白质表达工具,其相对较高的表达水平,日臻成熟的发酵工艺以及易于操作的蛋白质纯化工艺等特点,使其成为现代蛋白质基因工程药物表达的首选工程菌。但是,随着新的外源蛋白在酵母系统中的表达,该系统也逐渐暴露出了一些潜在的问题,譬如某些蛋白质表达水平下降,产物活性降低或无活性以及新生多肽连在内质网腔中出现聚集沉淀等,这些问题越来越严重的阻碍了酵母系统的推广应用。因此,有必要阐明蛋白质在酵母细胞中的翻译、转运、折叠和分泌的过程,及其可能涉及到的重要影响因素,以期待对目前酵母表达系统所存在的问题提出解决方案。众所周知,信号肽和分子伴侣在蛋白质合成转运过程中发挥着不可替代的重要作用。其中,信号肽是蛋白质分泌转运过程中引导新生肽转移到内质网腔膜上的信号肽识别蛋白,并引导蛋白质分子分泌到特定位置的一段氨基酸序列,因此信号肽作用于蛋白质新生肽转运的整个过程中。而分子伴侣是存在于蛋白质合成分泌整个过程中的一大类辅助分子,参与了新生多肽的转运、折叠与去折叠、错误折叠蛋白的解聚或降解等过程,因此分子伴侣能够保证目的产物的正常构象和生物活性。本课题以分子伴侣和信号肽为研究对象,研究的特点在于完整的考虑不同细胞定位的多种对蛋白质分泌有重要影响的分子伴侣的作用,并将分子伴侣与信号肽这两种对外源蛋白在酵母表达过程中具有重要影响作用的因素联系起来,期望通过研究分子伴侣之间的相互作用,以及分子伴侣与信号肽之间的相互作用,明确分子伴侣与信号肽在蛋白质合成过程中的作用机制的细节,并提出可行的表达水平提高方案的方向。我们选择了胞外-β-(1,3)-葡聚糖酶(EXG1)作为该研究的报告蛋白,它是巴斯德毕赤酵母的一种内源性酶。根据细胞质、内质网膜及内质网腔的分子伴侣对不同信号肽的EXG1在巴斯德毕赤酵母GS115和GS200中表达的影响,研究分子伴侣及蛋白质分泌信号肽对外源蛋白在巴斯德毕赤酵母中的优化表达策略。实验的技术路线如下,首先,通过融合PCR方法将翻译后转运信号肽αMF和αpre,以及翻译共转运信号肽Bip片段分别连接到报告蛋白EXG1成熟肽部分的N端,然后构建出含有不同信号肽报告蛋白的表达载体EXG1/αMF-pPIC9,EXG1/αpre -pPIC9,EXG1/Bip-pPIC9和EXG1-pPIC9。同时,将分子伴侣基因及其组合构建到质粒pBLArg-IX中。此后,将不同信号肽的含有EXG1基因的表达框在毕赤酵母GS115(His-)中表达,然后再将不同细胞定位的分子伴侣分别与(或)组合表达载体与不同信号肽的EXG1在毕赤酵母宿主菌GS200(表型His-/Arg-)内共表达。用0.5%甲醇诱导EX1在摇瓶中表达,通过测定EXG1酶活性以评价分子伴侣与信号肽对其表达水平的影响。结果发现,一方面不同信号对EXG1的表达水平影响明显,其中翻译共转运信号肽EXG1/Bip的表达水平是相对于自身信号肽EXG1的2倍,但是该水平仍低于翻译后转运信号肽EXG1/αMF和EXG1/αpre。另一方面,细胞质及内质网膜上的分子伴侣sec61α、sec61β以及胞质中的分子伴侣Ydj1、Ssa1、Hsp104及其组合对各种信号肽EXG1的表达水平影响不明显,内质网腔分子伴侣Bip,Ero1,PDI与Hac1组合能够明显提高EXG1的表达水平,其中使αMF和αpre信号肽EXG1表达水平提高了2.6-3.8倍,使EXG1-Bip表达水平提高了20-45%,而对自身信号肽EXG1表达水平无影响。以上结果说明,在酵母细胞中,共转运信号肽能够提高报告蛋白EXG1的表达水平,同时内质网中的分子伴侣是胞外-β-(1,3)-葡聚糖酶表达水平的重要影响因素,Bip和Ero1能够在信使分子Hac1的作用下明显提高EXG1/αMF和EXG1/αpre的分泌量,并且能够在一定程度上提高EXG1/Bip的分泌水平。但是尚未发现分子伴侣对信号肽具有优先选择性。

关键词：分子伴侣翻译共转运信号肽 EXG1 表达水平巴斯德毕赤酵母

自组装嵌合纤维小体酿酒酵母菌群的乙醇发酵研究

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太阳能学报 2018年第8期39卷 2103-2109页

作者：陈宁杜济良杨玥吕途杨秀山田沈首都师范大学生命科学学院

在可共代谢葡萄糖木糖的二倍体酿酒酵母Y6细胞表面,通过组成型强启动子（PGK）控制的a凝集素表面展示系统,构建一个可共代谢纤维素半纤维素的双支架纤维小体。通过免疫荧光、流式细胞术及酶催化活性的测定,证明纤维小体结构能正确组装... 详细信息

在可共代谢葡萄糖木糖的二倍体酿酒酵母Y6细胞表面,通过组成型强启动子（PGK）控制的a凝集素表面展示系统,构建一个可共代谢纤维素半纤维素的双支架纤维小体。通过免疫荧光、流式细胞术及酶催化活性的测定,证明纤维小体结构能正确组装并以活性形式固定在细胞表面。以纤维素和半纤维素为底物进行乙醇发酵实验,60 h时最大乙醇产量达1.98 g/L,乙醇产率为0.33 g/g,相当于理论值的65%。结果证明,表面展示嵌合纤维小体的酿酒酵母可实现共降解纤维素和半纤维素生产乙醇的目标。

关键词：酿酒酵母 a凝集素展示系统嵌合纤维小体纤维素半纤维素

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汽爆柳枝稷乙醇发酵残留物两步厌氧消化研究

太阳能学报 2016年第10期37卷 2682-2687页

作者：白龙吕喆吕途杜济良杨秀山田沈首都师范大学生命科学学院北京100048

为探究木质纤维素乙醇发酵残留物厌氧消化产甲烷性能,以汽爆柳枝稷高底物乙醇发酵残留物为底物,通过甲烷相出水回流至酸化相的方式进行厌氧消化产甲烷研究。结果表明:乙醇发酵残留物可有效进行甲烷生产,通过回流方式,酸化相内过多的挥... 详细信息

为探究木质纤维素乙醇发酵残留物厌氧消化产甲烷性能,以汽爆柳枝稷高底物乙醇发酵残留物为底物,通过甲烷相出水回流至酸化相的方式进行厌氧消化产甲烷研究。结果表明:乙醇发酵残留物可有效进行甲烷生产,通过回流方式,酸化相内过多的挥发酸注入到甲烷相中,甲烷相的出水回流至酸化相,平衡酸化相及甲烷相内的pH值和挥发酸的浓度,提高系统运行稳定性,进而提高厌氧消化效率和甲烷产量。随着甲烷相出水不断地循环至酸化相,甲烷相内的产甲烷菌群也被加入到酸化相内,产甲烷菌群的不断增加、pH值逐渐升高、甲烷含量逐渐上升,使酸化相内产酸菌与产甲烷菌群逐渐趋于平衡,酸化相逐渐向甲烷化发展,并最终转变为产甲烷相。500 mL发酵残留物经厌氧消化,共产生48 L沼气,其中甲烷28.8 L,甲烷产率277 mL/g COD,COD去除率达90%,甲烷含量约60%。

关键词：柳枝稷乙醇发酵残留物厌氧消化甲烷

Pichia stipitis Y7对木质纤维素预处理水解液中发酵抑制剂糠醛的耐受性研究

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太阳能学报 2014年第12期35卷 2570-2576页

作者：莫春玲陈宁吕途杜济良杨秀山田沈首都师范大学生命科学学院北京100048

对专利菌株(Pichia stipitis Y7)进行耐糠醛驯化,得到糠醛耐受性明显提升的菌株Y7-1。为解酵母菌株对糠醛的耐受性响应,运用聚丙烯酰胺凝胶电泳、LC-Q-TOF对驯化前后两株菌的差异蛋白进行鉴定。结果显示:在糠醛胁迫下,驯化前后的菌株在... 详细信息

对专利菌株(Pichia stipitis Y7)进行耐糠醛驯化,得到糠醛耐受性明显提升的菌株Y7-1。为解酵母菌株对糠醛的耐受性响应,运用聚丙烯酰胺凝胶电泳、LC-Q-TOF对驯化前后两株菌的差异蛋白进行鉴定。结果显示:在糠醛胁迫下,驯化前后的菌株在糖酵解途径、磷酸戊糖途径和三羧酸循环中的关键酶蛋白的表达有明显差异。

关键词：纤维素乙醇糠醛树干毕赤酵母耐受性

H2回流对促进CO2减排及甲烷化作用的影响

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太阳能学报 2019年第8期40卷 2143-2147页

作者：杜济良白龙孙详赵炳镐杜颖田沈首都师范大学生命科学学院

研究两相厌氧消化系统处理乙醇发酵残留物的过程中,酸化相产生的氢气回流到甲烷相中是否促进CO2减排及甲烷化过程,提高清洁能源产量以及实现节能减排的目标。实验过程中回收酸化相产生的H2共10 L,将其回流到甲烷相后,CH4含量提高9.7%,同... 详细信息

研究两相厌氧消化系统处理乙醇发酵残留物的过程中,酸化相产生的氢气回流到甲烷相中是否促进CO2减排及甲烷化过程,提高清洁能源产量以及实现节能减排的目标。实验过程中回收酸化相产生的H2共10 L,将其回流到甲烷相后,CH4含量提高9.7%,同时CO2含量降低7.1%,H2利用率为94%,整个回流H2过程并未对反应系统稳定性造成影响,一方面说明通过H2回流可将酸化相产生的难以分离利用的中间产物转变为底物加以利用,使其转变为CH4气体,提高清洁能源的产量,另一方面可有效减少厌氧消化过程中CO2的排放,实现清洁能源生产过程中节能减排的目标。

关键词：发酵残留物厌氧消化氢气回流甲烷化 CO2减排

嵌合纤维小体酵母菌群同步糖化发酵木质纤维素产乙醇的研究

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太阳能学报 2021年第1期42卷 342-347页

作者：杜济良刘磊万平杨秀山田沈首都师范大学生命科学学院北京100048

为探究CBP酿酒酵母菌群表面展示嵌合纤维小体的协同作用,该文通过组装纤维素酶和半纤维素酶进行木质纤维素乙醇发酵的性能,构建由分别可表面展示纤维素酶嵌合纤维小体(由支架蛋白ScafI,内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡糖苷酶构成)和... 详细信息

为探究CBP酿酒酵母菌群表面展示嵌合纤维小体的协同作用,该文通过组装纤维素酶和半纤维素酶进行木质纤维素乙醇发酵的性能,构建由分别可表面展示纤维素酶嵌合纤维小体(由支架蛋白ScafI,内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡糖苷酶构成)和半纤维素酶嵌合纤维小体(由支架蛋白ScafII,内切木聚糖酶和外切木糖苷酶构成)的重组酿酒酵母菌EBY100株组成的CBP菌群。通过蛋白质的SDS-PAGE、Western Bolt验证、酶活性测定、细胞表面定位和纤维小体组装效率分析,证明了融合蛋白能够以活性形式组装成2种形式的嵌合纤维小体。以蒸汽爆破玉米秸秆为底物进行同步糖化发酵产乙醇,96 h时最大乙醇产量达到0.673 g/L,消耗每克碳水化合物的乙醇产量0.255 g,相当于乙醇产率理论值的50.1%,协同因子为1.06。结果证明两株酵母细胞表面的不同类型嵌合纤维小体在水解木质纤维素过程中存在明显的协同促进作用。

关键词：酿酒酵母纤维素乙醇生物质细胞表面展示嵌合纤维小体统合生物加工

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汽爆玉米秸秆乙醇发酵残留物产甲烷特性研究

太阳能学报 2016年第3期37卷 542-545页

作者：王震吕喆杜济良陈宁杨秀山田沈首都师范大学生命科学学院北京100048

为阐明木质纤维素原料乙醇发酵残留物产甲烷的能力,以汽爆玉米秸秆为原料进行高底物浓度同步糖化发酵(SSF)产乙醇,并将乙醇发酵残留物、发酵残留物上清及固体部分分别进行产甲烷潜力实验。研究结果表明,汽爆玉米秸秆同步糖化发酵底物浓... 详细信息

为阐明木质纤维素原料乙醇发酵残留物产甲烷的能力,以汽爆玉米秸秆为原料进行高底物浓度同步糖化发酵(SSF)产乙醇,并将乙醇发酵残留物、发酵残留物上清及固体部分分别进行产甲烷潜力实验。研究结果表明,汽爆玉米秸秆同步糖化发酵底物浓度达到30%(w/w),乙醇浓度为48.9g/L。发酵残留物产甲烷潜力为46mL CH_4/g底物,上清部分产甲烷潜力为12mL CH_4/g底物,固体部分产甲烷潜力达到286mL CH_4/g底物,从而证明高底物浓度汽爆玉米秸秆乙醇发酵残留物具有较好的产甲烷潜力。

关键词：发酵残留物甲烷潜力厌氧消化乙醇发酵