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肿瘤微环境和肿瘤标志物研究中数字空间多组学技术应用的研究进展

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肿瘤学杂志 2023年第5期29卷 430-433页

作者：杜毅超楼美清上海交通大学医学院附属第一人民医院上海200080

肿瘤的发生及进展依赖于肿瘤细胞与肿瘤微环境(tumor microenvironment,TME)之间复杂的相互作用,而TME中显著差异表达的蛋白质、细胞因子等物质可能成为预测肿瘤进展的标志物。探索TME并寻找肿瘤标志物已成为目前肿瘤免疫治疗领域的研... 详细信息

肿瘤的发生及进展依赖于肿瘤细胞与肿瘤微环境(tumor microenvironment,TME)之间复杂的相互作用,而TME中显著差异表达的蛋白质、细胞因子等物质可能成为预测肿瘤进展的标志物。探索TME并寻找肿瘤标志物已成为目前肿瘤免疫治疗领域的研究热点之一。数字空间多组学(Digital Spatial Profiler,DSP)作为一项新型的、基于光学与探针的空间组学技术,在TME和肿瘤标志物等的研究中表现出显著优势。全文论述DSP技术在多种肿瘤研究中的应用,总结其在分析TME和肿瘤标志物中的作用。

关键词：肿瘤微环境肿瘤标志物数字空间多组学

藏红花醛对脂多糖诱导的脓毒症相关肝损伤小鼠模型的作用及其机制

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临床肝胆病杂志 2023年第11期39卷 2643-2650页

作者：陈意陈羿帆杜毅超谭鹏李童希白俊杰付文广西南医科大学附属医院普通外科(肝胆胰方向) 四川泸州646000 四川省院士(专家)工作站四川泸州646000

目的探讨藏红花醛对脂多糖(LPS)诱导的脓毒症相关肝损伤(SRLI)小鼠模型的保护作用及其机制。方法采用简单随机分组法将32只实验用C57BL/6雄性小鼠分为对照组、单药组、模型组和治疗组,每组各8只。单药组和治疗组腹腔注射藏红花醛(60 mg/... 详细信息

目的探讨藏红花醛对脂多糖(LPS)诱导的脓毒症相关肝损伤(SRLI)小鼠模型的保护作用及其机制。方法采用简单随机分组法将32只实验用C57BL/6雄性小鼠分为对照组、单药组、模型组和治疗组,每组各8只。单药组和治疗组腹腔注射藏红花醛(60 mg/kg)预处理7天,模型组和治疗组腹腔注射LPS(10 mg/kg)诱导急性肝损伤。检测各组小鼠血清ALT、AST活性,HE染色观察肝组织切片标本,免疫组化分析信号通路下游蛋白血红素加氧酶-1(HO-1)的表达差异,TUNEL法分析肝细胞凋亡情况,Western Blot法分析肝组织总蛋白[核因子NF-E2相关因子2(Nrf2)、HO-1]表达差异。采用藏红花醛(100μmol/L)预处理人类肝细胞系L02细胞,通过LPS 100 ng/mL诱导急性肝细胞损伤,DCFH-DA荧光标记氧自由基。结果藏红花醛预处理后,治疗组小鼠ALT、AST明显低于模型组(P值均<0.01),治疗组小鼠肝脏维持了较为完整的假小叶结构且坏死面积更小。治疗组小鼠经藏红花醛+LPS处理后肝组织Nrf2、HO-1表达水平相较于模型组明显升高(P值均<0.001),免疫组化结果显示,藏红花醛预处理增加了HO-1阳性细胞的数量。在LPS诱导的急性肝损伤细胞模型中,治疗组相较于模型组ROS的产生量明显减少。结论藏红花醛可通过Nrf-2/HO-1通路介导LPS诱导的小鼠SRLI的保护作用。

关键词：脓毒症肝损伤藏红花醛 NF-E2相关因子2 血红素加氧酶-1

VP22短肽融合猪细小病毒样粒子的制备及免疫原性初步研究

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VP22短肽融合猪细小病毒样粒子的制备及免疫原性初步研究

作者：杜毅超广西大学

学位级别：硕士

猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)是引起母猪繁殖障碍的主要病原之一,疫苗免疫仍是预防控制该病的主要手段。病毒样粒子(Virus-like particles,VLPs)疫苗以其安全性高、免疫原性好成为各类病毒疫苗研究的热门方向。PPV病毒样粒子(PPV... 详细信息

猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)是引起母猪繁殖障碍的主要病原之一,疫苗免疫仍是预防控制该病的主要手段。病毒样粒子(Virus-like particles,VLPs)疫苗以其安全性高、免疫原性好成为各类病毒疫苗研究的热门方向。PPV病毒样粒子(PPV-VLPs)是不含PPVDNA的空衣壳结构,由PPVVP2(下文简称:VP2)结构蛋白体外自行组装形成,形态上与天然病毒粒子相似,具有很强的免疫原性和生物学活性。单纯疱疹病毒1型(HSV-1)VP22蛋白是该病毒的结构蛋白,不仅具有细胞间自由转运的能力,而且还可以促进融合抗原交叉致敏,增强免疫原性。此外,HSV-1VP22(下文简称:VP22)蛋白还可能提高DNA疫苗的免疫反应。本研究分为三个部分,详细研究内容如下:1、细胞穿膜肽VP22对生物膜穿透性的研究以载体pEGFP-N1为模板扩增增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因,通过SOE-PCR分别将VP22基因片段拼接到EGFP基因的3'/5'端,获得VP22-EGFP和EGFP-VP22融合基因;将融合基因及EGFP基因分别克隆到pET-28a(+)载体构建重组表达质粒 pET28a-EGFP-VP22、pET28a-VP22-EGFP和pET28a-EGFP,并进行测序分析及酶切鉴定,将鉴定正确的各重组表达质粒及pET-28a空载体分别转化宿主菌E.coli BL21(DE3)进行表达,表达产物经SDS-PAGE及Western Blot分析结果可见相对分子量分别为约31 kDa、31 kDa及27kDa的蛋白分子条带,大小与预期相符,表明EGFP-VP22、VP22-EGFP、EGFP蛋白表达成功。对表达的蛋白进行Ni-NTA亲和层析纯化,将纯化后的蛋白添加到Vero细胞中进行共培养,l0h后荧光显微镜下观察到加入VP22-EGFP和EGFP-VP22蛋白的细胞有绿色荧光,而加入EGFP的细胞与空白对照组细胞中则没有观察到绿色荧光存在,提示细胞穿膜肽VP22可有效携带与其融合的EGFP蛋白穿过细胞膜进入细胞,VP22蛋白融合到EGFP蛋白N端或C端并不影响VP22的穿膜效果。2、VP22短肽融合猪细小病毒样粒子的制备及鉴定利用Bac-to-Bac杆状病毒表达载体系统进行PPV VLPs的制备。以PPV N株的基因组为模板扩增其VP2基因,通过SOE-PCR分别VP22基因拼接到VP2基因片段的3'/5'端,获得VP22-VP2和VP2-VP22融合基因;将两种融合基因及VP2基因分别克隆到pFastBacTMl载体,获得重组质粒pFB-VP22-VP2、pFB-VP2-VP22 及 pFB-VP2。重组质粒转化至 DHlOBac 感受态细胞进行同源重组,获得重组杆粒Bacmid-VP22-VP2、Bacmid-VP2-VP22及Bacmid-VP2。重组杆粒经脂质体法转染sf9细胞,获得重组杆状病毒株rBac-VP22-VP2、rBac-VP2-VP22及rBac-VP2。随后将重组杆状病毒株感染到sf9细胞进行重组蛋白的表达,表达产物经SDS-PAGE和Western-blot鉴定分析,结果可见相对分子量分别为约67 kDa、67 kDa及64 kDa的蛋白分子条带,大小与预期相符,表明VP2-VP22、VP22-VP2及VP2蛋白表达成功。进一步用PPV单抗对重组杆状病毒感染细胞进行IFA鉴定,可观察到特异性荧光,再次证实重组蛋白的表达且具有生物活性。表达产物经透射电镜观察,VP2和VP22-VP2均可自我组装形成22-24nm、形态类似天然PPV的病毒样粒子;VP2-VP22没有观察到病毒样粒子,表明VP2的N端融合VP22不影响VP2形成病毒粒子的特性,而C端融合外源蛋白可能影响VP2形成病毒样粒子。3、VP22短肽融合猪细小病毒样粒子免疫原性的初步评价用饱和硫酸铵法初步纯化病毒样粒子VP22-VP2(VLPs-VP22-VP2)、病毒样粒子VP2(VLPs-VP2)及重组蛋白VP2-VP22,分别配以弗氏佐剂、ISA 206佐剂及白油司本佐剂制成疫苗免疫小鼠,并以PPV油乳灭活苗和PBS为对照,比较分析三种重组蛋白的免疫原性及筛选较好的免疫佐剂。通过间接ELISA检测免疫小鼠血清中PPV特异性抗体,结果显示VLPs-VP22-VP2及VLPs-VP2能有效诱导小鼠产生特异性PPV抗体,其配以ISA 206佐剂免疫产生的抗体水平与PPV灭活苗基本相当,而重组蛋白VP2-VP22产生的抗体水平要明显低于PPV灭活苗组;IL-2是T细胞增殖的主要生长因子,IFN-γ仅由活化T细胞和自然杀伤细胞(NK细胞)产生,检测这两个指标的不同程度能反映动物机体的细胞免疫水平,对采集的免疫小鼠血清IL-2和IFN-γ含量测定结果显示,与阴性对照组相比,VLPs-VP22-VP2、VLPs-VP2及重组蛋白

关键词：猪细小病毒 VP2蛋白细胞穿膜肽VP22 病毒样粒子免疫原性

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整合素在胰腺癌中的研究进展

中华胰腺病杂志 2022年第4期22卷 306-310页

作者：李模李童希周宇杜毅超谭鹏付文广西南医科大学附属医院普通外科(肝胆胰外科) 泸州646000 西南医科大学附属医院四川省院士(专家)工作站泸州646000

整合素可介导细胞与细胞及细胞与细胞外基质间的相互作用,并可通过调节细胞增殖和迁移等方式在胰腺癌中发挥重要作用。本文就整合素在胰腺癌中的研究进展进行综述。

关键词：整合素胰腺癌增殖侵袭治疗

细胞外基质在肝细胞性肝癌发生发展过程中的作用

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中国普通外科杂志 2021年第1期30卷 91-97页

作者：尹一峰胡启辉杜毅超付文广夏先明西南医科大学附属医院肝胆外科四川泸州646000

肝细胞性肝癌(HCC)是我国常见的恶性肿瘤性疾病。近年来微环境对癌组织的影响受到重视,其中细胞外基质(ECM)作为HCC组织的重要微环境成分,在肿瘤发生发展过程中扮演着重要的角色,涉及肿瘤的生长、凋亡、耐药、侵袭、转移等。纤连蛋白(FN... 详细信息

肝细胞性肝癌(HCC)是我国常见的恶性肿瘤性疾病。近年来微环境对癌组织的影响受到重视,其中细胞外基质(ECM)作为HCC组织的重要微环境成分,在肿瘤发生发展过程中扮演着重要的角色,涉及肿瘤的生长、凋亡、耐药、侵袭、转移等。纤连蛋白(FN)、层粘连蛋白(LN)、透明质酸(HA)、胶原蛋白(COL)以及细胞外基质的硬度在HCC的发生发展过程中所起到的特殊作用。正是由于ECM各蛋白成分在HCC中的特殊作用,若盲目降解或敲除ECM中任意蛋白成分,可能无法达到预期的治疗效果,反而加速HCC的进展。所以需要探索某种特定的方法用于靶向调节ECM中成分,精准控制ECM重塑,从而调控HCC的发生发展。HCC微环境是一个持续变化的动态环境,为了尽可能模拟HCC细胞所处微环境,运用多种ECM蛋白成分而非单一成分联合培养HCC细胞以探究ECM多成分对细胞的共同作用是可行的研究方向。

关键词：癌,肝细胞细胞外基质细胞外基质蛋白质类基质硬度

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猪细小病毒病毒样颗粒研究进展

动物医学进展 2016年第7期37卷 71-75页

作者：杜毅超吴健敏刘金凤广西大学动物科学技术学院广西南宁530004 广西兽医研究所动物疫病病原学与诊断重点实验室广西南宁530001

猪细小病毒(PPV)是引起母猪繁殖障碍和仔猪死亡的主要病原,疫苗免疫预防是控制该病的主要手段。由于对生物安全的担心,目前国内使用的疫苗仍以灭活苗为主。病毒样颗粒(VLPs)疫苗以其安全性高、免疫原性好成为各类病毒疫苗研究的热门方... 详细信息

猪细小病毒(PPV)是引起母猪繁殖障碍和仔猪死亡的主要病原,疫苗免疫预防是控制该病的主要手段。由于对生物安全的担心,目前国内使用的疫苗仍以灭活苗为主。病毒样颗粒(VLPs)疫苗以其安全性高、免疫原性好成为各类病毒疫苗研究的热门方向。猪细小病毒病毒样颗粒(PPV-VLPs)是不含PPV DNA的空衣壳结构,由PPV VP2结构蛋白体外自行组装形成,形态上与天然病毒粒子相似,具有很强的免疫原性和生物学活性。论文就VLPs疫苗的免疫机制及PPV-VLPs的组装及其在国内外的研究进行综述,为PPV-VLPs研究提供参考。

关键词：猪细小病毒 VP2 病毒样颗粒

芹菜素对H2O2诱导人肝细胞L02氧化损伤模型的影响

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临床肝胆病杂志 2020年第5期36卷 1077-1081页

作者：杜毅超张浩黄治伟浦仕林钱保林赖莉谭鹏夏先明付文广西南医科大学附属医院四川省院士(专家)工作站四川泸州646000 西南医科大学附属医院肝胆外科四川泸州646000

目的探索芹菜素对H2O2致人肝细胞L02损伤模型的保护作用。方法以H2O2诱导L02细胞建立氧化损伤模型,CCK-8法检测细胞存活率,DCFH-DA法检测细胞活性氧的生成,试剂盒检测细胞上清液中乳酸脱氢酶(LDH)、丙二醛(MDA)及超氧化物歧化酶(SOD)活... 详细信息

目的探索芹菜素对H2O2致人肝细胞L02损伤模型的保护作用。方法以H2O2诱导L02细胞建立氧化损伤模型,CCK-8法检测细胞存活率,DCFH-DA法检测细胞活性氧的生成,试剂盒检测细胞上清液中乳酸脱氢酶(LDH)、丙二醛(MDA)及超氧化物歧化酶(SOD)活性,Hoechst染色观察细胞凋亡情况,试剂盒检测caspase-3的活性。计量资料多组间比较采用单因素方差分析,进一步两两比较采用LSD-t检验。结果芹菜素浓度为≥20μmol/L时对L02细胞的增殖有显著抑制作用(P值均<0.01);与空白对照组L02细胞活力相比,500μmol/L及以上的H2O2浓度均可使细胞活力极显著降低(P值均<0.001),500μmol/L为H2O2的建模浓度;模型组细胞活力与空白对照组相比差异显著(P<0.01),与模型组相比,芹菜素5、10μmol/L组细胞存活率显著提高(P值均<0.01);空白对照组细胞状态较好,模型组细胞间收缩变圆,细胞破损变形严重,芹菜素5μmol/L组与模型组相比,明显得到改善,变圆破损细胞较少;空白对照组、模型组、芹菜素5μmol/L组3组间相对荧光强度比较差异有统计学意义(1.00±0.26 vs 32.94±1.29 vs 13.49±1.23,F=1.10,P<0.001),模型组相对荧光强度较空白对照组明显增强(P<0.001),芹菜素5μmol/L组与模型组比较,芹菜素可明显清除H2O2诱发的ROS(P<0.001);模型组中LDH和MDA水平均明显升高,SOD水平明显降低,与正常对照组相比差异均有统计学意义(F值分别为3.21、2.03、3.32,P值均<0.05),芹菜素(5μmol/L)处理后,与模型组相比,LDH和MDA水平均明显降低,SOD水平明显升高(P值均<0.05);空白对照组、模型组、芹菜素5μmol/L组3组间细胞凋亡率比较差异有统计学意义(7.54%±0.52%vs 39.77%±3.44%vs 14.40%±0.79%,F=9.44,P<0.01);模型组细胞凋亡率显著高于对照组(P<0.01);给与芹菜素处理后,相比于模型组凋亡率明显降低(P<0.01);空白对照组、模型组、芹菜素5μmol/L组3组间caspase-3活性比较差异有统计学意义[(4.38±0.59)U/mg vs(16.44±1.13)U/mg vs(10.60±1.04)U/mg,F=1.17,P<0.05],模型组细胞caspase-3活性与对照组相比明显增强(P<0.05),芹菜素处理后,相比于模型组caspase-3活性明显降低(P<0.05)。结论芹菜素可能通过消除ROS的生成、降低caspase-3活性对H2O2诱导的L02细胞损伤产生保护作用。

关键词：芹菜素过氧化氢 L02细胞氧化损伤细胞凋亡

Hic-5基因敲除对NF-κB/p65表达及CCl4诱导的肝纤维化小鼠模型的影响

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临床肝胆病杂志 2019年第11期35卷 2483-2488页

作者：杨大银杜毅超谭鹏陈浩钱保林王安康黄诗尧付文广夏先明西南医科大学附属医院肝胆外科四川泸州646000 西南医科大学附属医院院士工作站四川泸州646000 核医学与分子影像四川省重点实验室四川泸州646000

目的探讨Hic-5基因敲除对NF-κB/p65表达及肝纤维化的影响。方法野生型C57BL/6雄性小鼠10只,随机分为2组,野生型对照组(WT-Control,n=5)、野生型实验组(WT-CCl4,n=5);Hic-5基因敲除C57BL/6雄性小鼠10只,随机分为2组,敲除对照组(Hic-5 KO... 详细信息

目的探讨Hic-5基因敲除对NF-κB/p65表达及肝纤维化的影响。方法野生型C57BL/6雄性小鼠10只,随机分为2组,野生型对照组(WT-Control,n=5)、野生型实验组(WT-CCl4,n=5);Hic-5基因敲除C57BL/6雄性小鼠10只,随机分为2组,敲除对照组(Hic-5 KO-Control,n=5)、敲除实验组(Hic-5 KO-CCl 4,n=5)。检测血清ALT和AST;天狼猩红染色观察肝组织胶原沉积;免疫组化检测α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、p65蛋白表达;定量PCR检测肝组织中α-SMA、Collagen1、p65 mRNA表达。分离小鼠原代肝星状细胞,在予以不同浓度TGFβ1刺激后定量PCR检测肝星状细胞中α-SMA、Collagen1、p65 mRNA的表达。多组间计量资料比较采用单因素方差分析,进一步两两比较采用LSD-t检验。结果天狼猩红染色显示,与WT-CCl4组相比较Hic-5 KO-CCl4组肝组织胶原纤维减少(P值<0.001)。血清ALT和AST检测结果提示WT-Control组、WT-CCl4组、Hic-5 KO-Control组、Hic-5 KO-CCl4组间ALT、AST比较差异均有统计学意义(F值分别为22.85、25.15,P值均<0.001),Hic-5 KO-CCl4组血清ALT和AST水平均低于WT-CCl4组(P值均<0.05);免疫组化显示WT-Control组、WT-CCl4组、Hic-5 KO-Control组、Hic-5 KO-CCl4组4组间肝组织α-SMA、p65蛋白表达水平比较差异均有统计学意义(F值分别为207.10、98.16,P值均<0.001),Hic-5 KO-CCl4组肝组织α-SMA、p65蛋白表达量低于WT-CCl4组(P值均<0.01);定量PCR结果示WT-Control组、WT-CCl4组、Hic-5 KO-Control组、Hic-5 KO-CCl4组4组间肝组织α-SMA、Collagen1、p65 mRNA相对表达量比较差异均有统计学意义(F值分别为41.62、13.93、98.16,P值均<0.001),Hic-5 KO-CCl 4组肝组织α-SMA、Collagen1、p65 mRNA相对表达量低于WT-CCl4组(P值均<0.05);0 ng/ml、5 ng/ml、10 ng/ml TGFβ1刺激原代肝星状细胞,WT(0 ng/ml、5 ng/ml、10 ng/ml)组及KO(0 ng/ml、5 ng/ml、10 ng/ml)组间α-SMA、Collagen1、p65 mRNA相对表达量比较差异均有统计学意义(F值分别为53.90、75.82、52.41,P值均<0.001),不同浓度TGFβ1刺激原代肝星状细胞Hic-5 KO组α-SMA、Collagen1、p65 mRNA相对表达量均低于WT组(P值均<0.01)。结论Hic-5基因敲除抑制NF-κB/p65表达,抑制肝星状细胞活化,缓解CCl4诱导的肝纤维化。

关键词：肝硬化肝星状细胞小鼠,基因敲除小鼠,近交C57BL

抗PRRSV双功能单链抗体基因的构建、序列分析及蛋白结构预测

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基因组学与应用生物学 2015年第5期34卷 988-994页

作者：刘金凤吴健敏杜毅超覃绍敏林俊马玲白安斌陈凤莲饶桂波广西兽医研究所广西畜禽疫苗新技术重点实验室南宁530001 广西大学动物科学技术学院南宁530001

为构建抗PRRSV与抗人红细胞单链抗体(2E8-Sc Fv)融合的双功能单链抗体基因并预测其结构和功能,本研究以PRRSV杂交瘤细胞株为模板,通过RT-PCR和SOE-PCR构建PRRSV-Sc Fv基因,将其重组到2E8-Sc Fv C端构建双功能单链抗体基因并测序分析,利... 详细信息

为构建抗PRRSV与抗人红细胞单链抗体(2E8-Sc Fv)融合的双功能单链抗体基因并预测其结构和功能,本研究以PRRSV杂交瘤细胞株为模板,通过RT-PCR和SOE-PCR构建PRRSV-Sc Fv基因,将其重组到2E8-Sc Fv C端构建双功能单链抗体基因并测序分析,利用生物信息学软件预测其结构功能。结果显示,成功获得长735 bp的PRRSV-Sc Fv基因,由Linker、VH和VL组成,VH、VL均含明确的CDR和FR区及特征性Cys,与多种鼠源Sc Fv基因高度同源,具有重组功能性鼠源抗体可变区特征,与2E8融合后形成全长1 470 bp的2E8-PRRSV-Sc Fv基因。经生物信息学分析,融合基因编码490个氨基酸,亲水性评估值为-0.365,为亲水性蛋白;结构预测分析显示,其存在丰富的二级结构,可折叠形成含有多个沟槽结构的空间构象,利于抗原的结合,理论上具有良好的抗原结合活性。本研究成功构建抗PRRSV双功能单链抗体基因并对其编码的蛋白质结构进行了预测,为今后进行融合蛋白的表达及最终研究PRRSV抗原快速检测方法奠定基础。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) 双功能单链抗体序列分析蛋白结构预测