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Akt1K64/276与SUMO1结合激活ERK1/2-Elk1-BDNF信号通路

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中国生物化学与分子生物学报 2022年第12期38卷 1661-1670页

作者：孟利杜彩萍徐州医科大学江苏省脑病生物信息重点实验室生物化学与分子生物学研究中心江苏徐州221004

本研究主要从蛋白质结构分析Akt1 SUMO化的位点及位点的突变对其结构与功能的影响。采用多种软件分析Akt1 SUMO化位点和Akt1野生型(Akt1wt)及Akt1K64/276R的理化性质、亲/疏水性及二/三级结构;分析结果显示,Akt1K64/276R较Akt1wt,亲/疏... 详细信息

本研究主要从蛋白质结构分析Akt1 SUMO化的位点及位点的突变对其结构与功能的影响。采用多种软件分析Akt1 SUMO化位点和Akt1野生型(Akt1wt)及Akt1K64/276R的理化性质、亲/疏水性及二/三级结构;分析结果显示,Akt1K64/276R较Akt1wt,亲/疏水性未改变,α-螺旋和β-折叠都有少量的不同。三级结构分析显示,与野生型组相比,Akt1K64R氢键增多。以Myc-Akt1wt-pcDNA3.1为模板,采用PCR定点突变技术扩增出Myc-Akt1K64/276R。DNA序列分析结果显示,Myc-Akt1K64/276R基因序列编码赖氨酸(K)的密码子AAG被成功突变为精氨酸(R)密码子AGG。免疫沉淀和免疫印迹结果显示,不共转PIAS3,Akt1也能与SUMO1结合;Myc-Akt1wt和Myc-Akt1K64/276R均可在HEK293细胞中高效表达;转染Myc-Akt1K64/276R组SUMO化水平降低了70%左右(P<0.05)。免疫印迹结果显示,在小鼠海马神经细胞HT22中,Myc-Akt1wt组ERK1/2磷酸化水平及BDNF蛋白水平是突变组的约1.5倍(P<0.05);野生型组p-Elk1是突变体组的2倍(P<0.05),而mTOR、P70S6K、4E-BP1的表达及磷酸化均无显著改变。以上结果表明,Akt1中K64/276的突变对蛋白质结构和表达未见影响,仅引起Akt1 SUMO化降低及下游ERK1/2-Elk1-BDNF信号通路的抑制。

关键词：蛋白质激酶Bα 小泛素化生物信息学分析信号通路

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唐山市中国现代诗歌选修课程现状与反思

唐山市中国现代诗歌选修课程现状与反思

作者：杜彩萍河北师范大学

学位级别：硕士

河北省于2009年秋季起，普通高中学校全面进入新课程实验阶段。随着语文新课程改革的不断推进，中国现代诗歌欣赏选修课的教学暴露出了很多问题，教学现状不容乐观。为了深入了解唐山市普通高中现代诗歌选修课程教学的现状，笔者对唐山... 详细信息

河北省于2009年秋季起，普通高中学校全面进入新课程实验阶段。随着语文新课程改革的不断推进，中国现代诗歌欣赏选修课的教学暴露出了很多问题，教学现状不容乐观。为了深入了解唐山市普通高中现代诗歌选修课程教学的现状，笔者对唐山市开滦一中、滦县一中、滦南县第二高级中学、滦南县胡各庄中学等各层次共四所高中高二年级的学生现代诗歌选修课的学习情况和语文教师的教学情况进行了一次问卷调查。通过对回收的有效问卷的分析与思考，笔者发现，人文精神的缺失、高考指挥棒下的应试教育、教材处理不当、教师素养不足等因素使得现代诗歌遭到了教与学的双重冷遇。针对这些问题，本文试图依据教育心理学、美学和语文教育学等相关理论，结合高中学生的心理特点，通过自己的教学实践和较深入的理论研究，能够设计出更加合理的教学策略，寻求与现代诗歌选修课程目标与内容相适应的教学方法，为高中语文选修课程的教学研究做一点有益的尝试。全文分为三章，主要内容如下：第一章绪论。分为两个部分，第一部分阐述现代诗歌的发展简史，阐明它与中国古典诗歌以及和外国诗歌的关系，分析中国现代诗歌的个性特征。第二部分分析中国现代诗歌选修课程设置的重大意义，解读中国现代诗歌选修课程内容设置与必修阶段现代诗歌教学内容之间的联系以及变化，包括题材、主题、时代、艺术手段技法等方面，在此基础上深入解读课标，释读课标中的相关要求及其所包含的语文教育思想。第二章唐山市现代诗歌选修课教学现状。根据一轮教学实践以及问卷调查的结果，析教材，明现状，找原因。第三章实践反思与对策研究。通过课例分析区别于现代诗歌必修课并适应选修课教学的方法策略;从现代诗歌与中国古典诗歌、外国诗歌的共性和个性入手寻找教学途径;从青少年的心理特点入手发现教学新方式。第四章结语。

关键词：新课标现代诗歌选修课程教学策略

大鼠His-Akt1重组蛋白的真核表达、蛋白纯化及活性鉴定

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生物技术通报 2020年第12期36卷 98-103页

作者：孟利杜彩萍徐州医科大学江苏省脑病生物信息重点实验室生物化学与分子生物学研究中心徐州221004

构建His-Akt1-pcDNA3.1真核表达载体,于HEK293细胞进行表达,Ni-NTA亲和纯化His-Akt1,并对Akt1进行活性鉴定。以Akt1(全长)-pcDNA3.1重组体为模板,采用PCR扩增目的基因,然后克隆入真核表达载体pcDNA3.1;将His-Akt1-pcDNA3.1转染HEK293细胞表达,Ni-NTA纯化His-Akt1,用SDS-PAGE、考马斯亮蓝染色及免疫印迹鉴定蛋白纯度;蛋白经透析后,免疫印迹检测Akt1 Ser473和Thr308磷酸化水平。His-Akt1-pcDNA3.1真核表达载体构建成功,在HEK293细胞中高效表达;考马斯亮蓝染色和免疫印迹结果显示,取2 mg过表达His-Akt1的蛋白混合液经Ni-NTA纯化后,加入含100 mmol/L咪唑的洗脱液洗脱,可获得高纯度His-Akt1重组蛋白。上述His-Akt1重组蛋白经透析后,免疫印迹结果显示His-Akt1 Ser473和Thr308磷酸化水平(活化水平)均呈高水平。重组His-Akt1-pcDNA3.1真核表达载体成功构建,且蛋白高表达,His-Akt1经提取纯化后具有较高的酶活性。

关键词： Akt1 真核表达载体蛋白纯化活性鉴定

神经型一氧化氮合酶(nNOS)与SUMO连接酶PIAS3相互作用结构基础鉴定

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中国生物化学与分子生物学报 2020年第9期36卷 1055-1063页

作者：胡露露杜彩萍徐州医科大学江苏省脑病生物信息重点实验室生物化学与分子生物学研究中心江苏徐州221004

神经型一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase,nNOS)在中枢神经系统广泛分布。本课题组前期研究报道,神经活性增强促进神经型一氧化氮合酶SUMO化,继而上调其活性,激活下游ERK1/2信号通路,参与调控兴奋性突触传递。SUMO连接酶PIAS... 详细信息

神经型一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase,nNOS)在中枢神经系统广泛分布。本课题组前期研究报道,神经活性增强促进神经型一氧化氮合酶SUMO化,继而上调其活性,激活下游ERK1/2信号通路,参与调控兴奋性突触传递。SUMO连接酶PIAS3可通过其N-末端AAs 43~86与nNOS结合,参与介导神经型一氧化氮合酶SUMO化。本文进一步筛选和鉴定nNOS中与PIAS3结合的氨基酸序列,深入研究nNOS与PIAS3相互作用的结构基础。采用分子克隆技术,分别构建nNOS缺失结构域突变体(AAs 1~1396、1~756和1~720)的真核表达载体,然后分别与Myc-PIAS3质粒共转染于COS7细胞。结果显示,AAs 1~720与PIAS3共转染组nNOS-PIAS3的结合水平显著低于其他组;Myc-nNOS(AAs 721~756)化学合成小肽与纯化的His-PIAS3在体外也可相互结合。结果表明,nNOS的AAs 721~756(CaM结合结构域,CaMB)可与PIAS3直接结合。GST pull-down进一步证明,nNOS的CaMB与PIAS3 AAs 43~86可直接结合。构建CaMB-pcDNA3.1真核表达载体,共表达nNOS、Myc-PIAS3和CaMB,CaMB共表达组nNOS-PIAS3结合明显降低。结果提示,CaMB通过竞争结合PIAS3从而干预nNOS与PIAS3的结合。将化学合成的穿膜肽Tat融合的CaMB(Tat-CaMB,5μmol/L)与皮质神经元预孵育1 h,用荷包牡丹碱(bicuculline,50μmol/L)诱导化学性长时程增强(long-term potentiation,LTP)。结果显示,Tat-CaMB可显著逆转bicuculline诱导的ERK1/2磷酸化(活化)水平的升高,与荷包牡丹碱处理组相比,下降了29%(P<0.05)。结果表明,Tat-CaMB可通过干预nNOS-PIAS3结合,进而抑制神经型一氧化氮合酶SUMO化及其下游ERK1/2信号通路的活化。通过上述研究,证明nNOS可通过CaM结合结构域(AAs 721~756)与PIAS3结合,并提供了一种鉴定和验证蛋白质间相互作用结构基础的有效方法。

关键词：神经型一氧化氮合酶 SUMO连接酶 PIAS3 CaM结合结构域结合

海人藻酸受体GluK2亚基复制缺陷型腺病毒的构建

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生物技术 2014年第1期24卷 12-16页

作者：杜彩萍徐镇胡书群李婷侯筱宇徐州医学院江苏省脑病生物信息重点实验室生物化学与分子生物学研究中心江苏徐州221004

目的:构建海人藻酸(kainate,KA)受体GluK2亚基复制缺陷型腺病毒重组体。方法:以GluK2-pcDNA3.1真核表达载体为模板,经PCR扩增GluK2目的基因,然后将其亚克隆入腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV,后将重组的穿梭质粒与腺病毒骨架载体pAdEasy-1... 详细信息

目的:构建海人藻酸(kainate,KA)受体GluK2亚基复制缺陷型腺病毒重组体。方法:以GluK2-pcDNA3.1真核表达载体为模板,经PCR扩增GluK2目的基因,然后将其亚克隆入腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV,后将重组的穿梭质粒与腺病毒骨架载体pAdEasy-1共同电转入BJ5183电穿孔感受态细胞筛选阳性同源重组子。阳性重组体经限制性内切酶PacⅠ消化,经脂质体转染入HEK293细胞进行包装与扩增。接着腺病毒经大量提取纯化后进行滴度测定。结果:GluK2腺病毒具有较强的感染能力(6.75×109ifu/ml)并可表达目的蛋白。结论:GluK2复制缺陷型腺病毒成功构建。GluK2腺病毒可高效感染原代神经元及神经细胞系,为进一步研究其对神经元的调控作用奠定基础。

关键词： GluK2 海人藻酸受体腺病毒复制缺陷型感染能力