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FGFR3真核表达载体的构建及其在慢性粒细胞白血病细胞系K562中的作用研究

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FGFR3真核表达载体的构建及其在慢性粒细胞白血病细胞系K562中的...

作者：杜彤华吉林大学

学位级别：硕士

研究背景：慢性粒细胞白血病（chronic myeloid leukemia,CML）是一种粒细胞增生性疾病，占成人白血病的15-20%[1]。虽然伊马替尼等药物的临床应用使得无法进行造血干细胞移植的病人病程得以控制，但这些药物并不能治愈CML，因为这些... 详细信息

研究背景：慢性粒细胞白血病（chronic myeloid leukemia,CML）是一种粒细胞增生性疾病，占成人白血病的15-20%[1]。虽然伊马替尼等药物的临床应用使得无法进行造血干细胞移植的病人病程得以控制，但这些药物并不能治愈CML，因为这些药物无法清除白血病干细胞，进而使得疾病复发[2]。另外伊马替尼类药物的价格异常昂贵，病人往往无法支付高额的医药费用，而放弃治疗或延误治疗时间，所以解决白血病干细胞的耐药问题是治疗本病的关键。在多种肿瘤中发现FGFR3突变或过表达，如多发性骨髓瘤[3]、尿路上皮肿瘤[4]、膀胱癌[5]、口腔[6]、睾丸癌[7]和大肠癌[8]等。FGFR3信号的增强促进了肿瘤细胞的增殖、生存、迁移和耐药等多种生理功能。前期研究结果揭示，FGFR3可能与CML白血病的发生发展存在着密切的关系。如FGFR3在K562细胞中的表达明显高于其它各种急性白血病细胞系，FGFR3在CML白血病干/祖细胞（CD34+）中的表达也明显高于分化较成熟的白血病细胞（CD34-），这与国外文献的报道一致[9]，表明FGFR3与慢性粒细胞白血病的发生和发展以及白血病干细胞的耐药可能都有密切的关系。为了探讨FGFR3信号与CML发生发展及耐药的关系，本课题克隆了野生型和截短失活型的FGFR3基因，并构建了真核表达载体，通过脂质体转染和药物筛选，建立了过表达野生型和截短失活型FGFR3基因的K562细胞系，并研究了FGFR3基因在CML中的功能，为慢性粒细胞白血病的发病机制研究奠定了基础。目的：构建FGFR3真核表达载体MSCV/puro-fgfr3-WT和MSCV/puro-fgfr3-DN，并检测其在人白血病细胞系K562中的表达，在转染FGFR3-DN同时给予Imatinib经典治疗CML药物，初步观察转染FGFR3-DN治疗效果，为后续探讨FGFR3在治疗慢性粒细胞白血病中的作用及其耐药机制奠定基础。方法: 通过PCR方法获得FGFR3全长基因（fgfr3-WT）和截短失活型的FGFR3（fgfr3-DN），经双酶切后与真核表达载体MSCV/puro连接，构建MSCV/puro-fgfr3-WT和MSCV/puro-fgfr3-DN重组表达质粒。PCR、双酶切及测序鉴定正确后，经脂质体介导转染至人白血病细胞系K562中，经puromycin抗性筛选后，应用Western blotting和流式细胞术方法检测细胞中FGFR3蛋白的表达，应用CCK8法检测重组质粒FGFR3转染K562稳转细胞细胞增殖能力影响，应用CFU实验检测FGFR3对K562细胞克隆形成能力的影响。结果： MSCV/puro-fgfr3-WT和MSCV/puro-fgfr3-DN重组质粒PCR结果鉴定显示，2个质粒分别能扩增出在2400bp的fgfr3-WT全长基因片段和1200bp的fgfr3-DN截短型片段,表明成功扩增fgfr3-WT全长基因和1200bp的fgfr3-DN基因。双酶切MSCV/puro-fgfr3-WT重组质粒，也能够获得2400bp的目的基因片段。测序结果显示，fgfr3-WT大小为2400bp,Blast对比分析表明，测序结果与GeneBank中的FGFR3序列完全一致。Fgfr3-DN大小为1200bp,与预先设计的序列完全一致,表明野生型FGFR3和截短失活型FGFR3真核质粒表达质粒构建成功。Westernblotting检测分析， MSCV/puro-fgfr3-WT转染组（K562-WT）与对照组（K562-MSCV）相比，有较高的FGFR3蛋白表达，表达量是对照组的10倍以上。MSCV/puro-fgfr3-DN转染组（K562-DN）有较高的截短型的FGFR3（K562-DN）表达，而对照组和K562-WT转染组则无此片段。流式细胞术方法检测显示fgfr3-WT中有57.5%的细胞高表达FGFR3，K562-DN有41.5%的细胞高表达FGFR3-DN。CCK8结果显示转染FGFR3-DN后，与空质粒组相比，K562细胞增殖明显减少<0.05）;克隆形成试验也证明FR3-DN组较空质粒组细胞增殖较缓慢。结论： 1.成功构建了高表达野生型和截短失活型FGFR3的表达载体。 2.成功构建了高表达野生型和截短失活型FGFR3的人白血病细胞系K562。 3.通过CCK8及CFU实验证明了FGFR3促进K562细胞的增殖。

关键词： FGFR3 K562细胞系稳定转染伊马替尼

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血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤1例

中国老年学杂志 2013年第12期33卷 2921-2922页

作者：杜彤华孙艳荣容李亚荣许慧静夏大文吉林大学第二医院肿瘤血液内科吉林长春130021

血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤（T—AILT）是较罕见的外周T细胞肿瘤，占非霍奇金淋巴瘤（NHL）1％～2％，占外周T细胞淋巴瘤15％．20％。

关键词：血管免疫母细胞性 T细胞淋巴瘤

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子宫血管周上皮细胞样肿瘤1例

中国老年学杂志 2013年第19期33卷 4871-4872页

作者：上官梦原杜彤华赵淑华谭文溪张传琪吉林大学第二医院妇产科吉林长春130041 吉林大学第二医院肿瘤科

血管周上皮细胞样肿瘤（PEComa）是一种罕见的间叶来源肿瘤,本文通过报道1例我院收治的术后病理诊断为子宫PE-Coma的病例,探讨其临床特征及诊断、治疗、预后的关系.

关键词：上皮细胞肿瘤子宫

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封丘县青陵台是梁祝'化蝶'的源头

新乡师范高等专科学校学报 2006年第1期20卷 124-126页

作者：杜彤华新乡市博物馆河南新乡453000

封丘县东北留光乡青堆村的青陵台是东晋干宝(?-336)《搜神记》中韩凭夫妇故事的发生地,至今韩凭妻墓犹存.韩凭夫妇为爱而殉情,最后双双化为蝴蝶,这应该是我国四大传说之一--梁山伯与祝英台化蝶的源头,只是后人将其化蝶用浪漫主义手法移... 详细信息

封丘县东北留光乡青堆村的青陵台是东晋干宝(?-336)《搜神记》中韩凭夫妇故事的发生地,至今韩凭妻墓犹存.韩凭夫妇为爱而殉情,最后双双化为蝴蝶,这应该是我国四大传说之一--梁山伯与祝英台化蝶的源头,只是后人将其化蝶用浪漫主义手法移接到了梁祝故事中.

关键词：封丘青陵台梁祝 '化蝶' 源头

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《慕完墓志》及其有关的几个问题

中原文物 1984年第2期 75-79页

作者：杜彤华

新乡市博物馆石刻仓库有元代《慕完墓志》及志盖各一方。志盖为盝顶,盝顶长61,宽57厘米,四杀厚4.5、下部长81.5、宽78,沿厚24厘米。素面无纹饰,有阴格,阴格内双钩篆书“大元故侍御史赠参知政事慕公墓志铭”16字。志石长83、宽78、厚32... 详细信息

新乡市博物馆石刻仓库有元代《慕完墓志》及志盖各一方。志盖为盝顶,盝顶长61,宽57厘米,四杀厚4.5、下部长81.5、宽78,沿厚24厘米。素面无纹饰,有阴格,阴格内双钩篆书“大元故侍御史赠参知政事慕公墓志铭”16字。志石长83、宽78、厚32厘米。志文共40行,满行44字,共约1600百余字。该石右上角略残。志石与志盖显得厚重硕大。其出土时间、地点皆不详。明代正德年间由新乡县儒学训导李锦编辑、新乡县知事储珊作序并校正的《正德新乡县志》卷三(陵墓)记有:“慕卫公墓在县东北三里,元时累官至参议中书省事,拜治书侍御史。念祖父之思德,求翰林传讲。虞集为墓表以彰之。至元丙子追封卫郡公。”清代乾

关键词：墓志铭追封至顺赠封新乡县志伯颜口口郡公虞集侍御史

从出土的东魏造像碑看历史上获嘉县的地理位置

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中原文物 1980年第4期 28-31页

作者：杜彤华

解放初期,新乡市博物馆收集到一块东魏天平四年获嘉安村道俗一百余人造像碑。该碑为卧碑形制,高76,宽141,厚13厘米。碑中部凿一佛龛,龛上端阴纹线刻有帷幔。龛中刻一佛二胁侍。佛,肉髻大耳,博衣宽带,内著僧祗支,结跏趺坐,手“施无畏与... 详细信息

解放初期,新乡市博物馆收集到一块东魏天平四年获嘉安村道俗一百余人造像碑。该碑为卧碑形制,高76,宽141,厚13厘米。碑中部凿一佛龛,龛上端阴纹线刻有帷幔。龛中刻一佛二胁侍。佛,肉髻大耳,博衣宽带,内著僧祗支,结跏趺坐,手“施无畏与愿印”,下衣有稠密的折褶纹,复于须弥座

关键词：获嘉县开运元鼎六年新中乡安村造像碑新乡县志地理位置

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新乡市博物馆购得一件北魏铜佛造像

中原文物 1978年第2期 61-62页

作者：杜彤华新乡市博物馆

1978年元月上旬,新乡市博物馆从新乡市废旧公司购得一件铜佛造像。佛像高9.5、造像通高31厘米。

关键词：佛造像佛像须弥座博物馆博物院文化机构新乡市

FGFR3真核表达载体的构建及其在人白血病细胞系K562中的表达

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吉林大学学报（医学版） 2014年第3期40卷 465-470页

作者：许会静杜彤华孙艳李校堃肖业臣吉林大学基础医学院生物化学教研室吉林长春130021 吉林医药学院检验学院临床生物化学检验教研室吉林吉林132013 吉林大学第二医院肿瘤血液内科吉林长春130041

目的:构建成纤维细胞生长因子受体3(FGFR3)真核表达载体MSCV/puro-fgfr3-WT和MSCV/purofgfr3-DN,并检测FGFR3蛋白在人白血病细胞系K562中的表达。方法:通过PCR法获得FGFR3全长基因(fgfr3-WT)和截短失活型的FGFR3(fgfr3-DN),经双酶切后与真核表达载体MSCV/puro连接,构建MSCV/puro-fgfr3-WT和MSCV/puro-fgfr3-DN重组表达质粒。经PCR、双酶切及测序鉴定正确后,脂质体介导转染至人白血病细胞系K562中,经puromycin抗性筛选后,Western blotting法和流式细胞术检测细胞中FGFR3蛋白的表达。结果:PCR法鉴定MSCV/puro-fgfr3-WT和MSCV/puro-fgfr3-DN重组质粒,2个质粒分别扩增出2 400bp的fgfr3-WT全长基因片段和1 200bp的fgfr3-DN截短型片段,表明成功扩增fgfr3-WT全长基因和1 200bp的fgfr3-DN基因;双酶切MSCV/puro-fgfr3-WT重组质粒,获得2 400bp的目的基因片段;测序显示,fgfr3-WT片段大小为2 400bp,Blast对比分析表明测序结果与GenBank中的FGFR3序列完全一致。fgfr3-DN片段大小与预先设计的序列完全一致,表明成功构建野生型FGFR3和突变失活型FGFR3真核表达载体;Western blotting检测,与对照组(K562-MSCV)比较,MSCV/puro-fgfr3-WT转染组(K562-WT)FGFR3蛋白表达水平增加,表达水平是对照组的10倍以上;MSCV/puro-fgfr3-DN转染组(K562-DN)的截短型的FGFR3(K562-DN)高表达,而对照组和K562-WT转染组则无此片段;流式细胞术检测,K562-WT组有57.5%的细胞高表达FGFR3,K562-DN组有41.5%的细胞高表达FGFR3-DN。结论:成功构建高表达野生型和突变型FGFR3的人白血病细胞系K562。

关键词：受体,成纤维细胞生长因子,3型真核表达载体 K562 细胞系基因转染白血病,粒-单核细胞,慢性