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糖尿病肾病肾小球足细胞损伤机制的研究—高糖通过NFAT2-BAX信号途径诱导肾小球足细胞凋亡

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糖尿病肾病肾小球足细胞损伤机制的研究—高糖通过NFAT2-BAX信号...

作者：李锐钊南方医科大学

学位级别：硕士

研究背景糖尿病肾病(Diabetic nephropathy,DN)是1型和2型糖尿病的一个重要和常见的并发症,虽然目前有多项医疗措施可延缓疾病进展,但是仍约三分之一的糖尿病患者发展为终末期肾脏疾病,需要行肾脏替代治疗。因此,探索糖尿病肾病中促进... 详细信息

研究背景糖尿病肾病(Diabetic nephropathy,DN)是1型和2型糖尿病的一个重要和常见的并发症,虽然目前有多项医疗措施可延缓疾病进展,但是仍约三分之一的糖尿病患者发展为终末期肾脏疾病,需要行肾脏替代治疗。因此,探索糖尿病肾病中促进肾小球损伤的机制,以期获得新的治疗策略,是目前医学研究的一个热点。肾小球的滤过屏障由毛细血管内皮细胞(endothelial cell)、肾小球基底膜(Glomerular basement memberane, GBM)以及足细胞(Podocyte)组成。肾小球足细胞是一种终末分化的细胞,它驻留在肾小球基底膜的外表面上,并在维持肾小球滤过屏障的结构和功能中发挥关键作用。越来越多的证据表明,肾小球足细胞在糖尿病肾病的发病机制中发挥了举足轻重的作用。一些研究表明,在1型和2型糖尿病中,足细胞的损伤和减少是DN发病机制中最早的机制之一。高葡萄糖(HG)在体外或体内均可诱导足细胞凋亡,导致足细胞损伤和数目的减少。文献报道,高血糖或者氧化应激产物(ROS)增加可能是糖尿病肾病中足细胞损伤和凋亡的触发因素。然而,高血糖诱导足细胞凋亡的具体机制尚未被完全阐明。因此,目前也尚无理想的干预措施来防治DN患者的足细胞凋亡。活化T细胞核因子(nuclear factor of activated T cells, NFAT)是一类Ca2+/钙调磷酸酶(calcineurin, CaN)依赖的转录因子,包括NFAT1、NFAT2、NFAT3、 NFAT4及NFAT5共5个亚型。人们最初发现NFAT的表达在免疫细胞的免疫应答中对细胞因子的基因和其他基因的转录发挥举足轻重的作用;随后发现它们也存在于机体的非免疫细胞中并发挥重要的生物学功能。NFAT不仅在调节多种细胞的生长、增殖生理过程中发挥至关重要的作用：例如调节心脏瓣膜的发育、骨骼肌和平滑肌细胞的分化以及血管的发育。同时,NFAT的过度活化也可导致心肌及骨骼肌细胞的病理性肥大。 NFAT的活化高度依赖于Ca2+/CaN,而环孢素A (cyclosporine A, CSA)可以有效地抑制CaN。正常情况下,NFAT以高度磷酸化的形式存在于胞质中,当细胞受到某种刺激导致钙离子内流增加时,通过激活钙调磷酸酶,随之引起NFATc去磷酸化并转移入核,NFAT的蛋白单独或与其他核伙伴组合形成NFATc转录络合物来控制靶基因的转录,从而发挥相应的生理或病理作用。近期相关文献报道：高葡萄糖可激活血管平滑肌细胞、胰腺β细胞的NFAT。也有文献报道：NFAT的过度活化可导致几种类型细胞的凋亡。同时,最近有研究还表明,NFAT的过度活化参与了足细胞损伤和肾小球硬化,但是目前未见关于高血糖是否可激活肾小球足细胞的NFAT2并进而导致足细胞凋亡的报道。本研究旨在探讨高葡萄糖是否能活化体外培养足细胞的NFAT2和活化的NFAT2在高葡萄糖诱导的足细胞凋亡中所发挥的作用;同时观察NFAT2活化是否对足细胞中的促凋亡因子Bax的表达产生影响并由此促进细胞的凋亡;最后观察高葡萄糖对足细胞Ca2+内流的影响情况。初步探讨DN肾小球足细胞损伤的机制。研究方法一、足细胞培养、鉴定及实验分组 (一)足细胞培养：条件永生性小鼠足细胞由Baylor医学院Danesh教授惠赠。首先在5%C02,33℃培养箱环境,用含20-100U·mL-1IFN-γ的RPMI1640和10%FBS放入Ⅰ型胶原包被的培养瓶中共孵育,使其获得增殖能力。然后转入5%CO2,37℃培养箱,用不含IFN-y的DMEM加5%FBS共孵育,经10-14天的培养诱导,足细胞进入分化阶段并最终分化成熟。 (二)足细胞鉴定及形态学观察：分别对33℃含IFN-y培养及37℃不含IFN-y培养10-14天分化成熟后的足细胞在相差显微镜下直接拍片,观察其形态学差异;表达足细胞骨架蛋白synaptopodin的细胞为分化成熟的足细胞,未分化的足细胞不表达synaptopodin蛋白。 (三)按以下不同目的进行分组干预处理足细胞： 1、不同糖浓度干预下足细胞核中NFAT2的表达情况 1)正常糖组予Glucose5.3mM干预2h;2)高糖组分别予Glucose10mM、Glucose20mM、Glucose30mM和Glucose40mM干预2h。 2、不同作用时间下足细胞核中NFAT2的表达情况 1) Glucose5.3mM分别作用0.5h、1h、2h和4h;2) Glucose20mM分别作用0.5h、1h、2h和4h。 3、不同干预下足细胞核中NFAT2的表达情况 1) Glucose5.3mM作用2h;2) Glucose20m M作用2h;3) Glucose5.3mM+Mannitol14.7mM作用2h;4) Glucose20mM+11R-vivit100nM作用2h;5) Glucose20mM+CsA500n

关键词：高糖足细胞活化T细胞核因子 Bax 凋亡

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外泌体在糖尿病肾病中的研究进展

中华肾脏病杂志 2020年第7期36卷 568-572页

作者：黄颖李锐钊梁馨苓南方医科大学第二临床医学院广州510515 广东省人民医院肾内科广东省医学科学院广州510080

糖尿病肾病(DN)是糖尿病常见的微血管并发症,是导致终末期肾脏病的主要原因。外泌体是由细胞分泌的纳米级细胞外囊泡,含有细胞特异的蛋白、脂质和核酸等生物活性物质,参与多种生理病理过程。外泌体在DN的发生发展、诊断和治疗方面发挥... 详细信息

糖尿病肾病(DN)是糖尿病常见的微血管并发症,是导致终末期肾脏病的主要原因。外泌体是由细胞分泌的纳米级细胞外囊泡,含有细胞特异的蛋白、脂质和核酸等生物活性物质,参与多种生理病理过程。外泌体在DN的发生发展、诊断和治疗方面发挥了重要作用,本文就外泌体在糖尿病肾病中的研究进展进行综述。

关键词：外泌体糖尿病肾病

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急性肾损伤进展至慢性肾脏病的机制研究进展

中华肾脏病杂志 2020年第9期36卷 731-736页

作者：谢志勇李锐钊梁馨苓南方医科大学第二临床医学院广州510515 广东省人民医院(广东省医学科学院)肾内科广州510080

急性肾损伤(AKI)是以肾小球滤过率急速下降为特点的临床综合征,可导致肾小管上皮细胞损伤、微血管内皮修复不良以及持续免疫炎性反应,从而增加慢性肾脏病(CKD)和终末期肾病的发生风险。AKI进展至CKD的过程涉及多种复杂机制,包括炎症损... 详细信息

急性肾损伤(AKI)是以肾小球滤过率急速下降为特点的临床综合征,可导致肾小管上皮细胞损伤、微血管内皮修复不良以及持续免疫炎性反应,从而增加慢性肾脏病(CKD)和终末期肾病的发生风险。AKI进展至CKD的过程涉及多种复杂机制,包括炎症损伤、肾素-血管紧张素系统活化、细胞周期停滞、肾脏缺氧调控、细胞衰老和修复、细胞死亡调控和表观遗传学修饰等多种致病机制。本文针对AKI进展至CKD的机制最新研究进展进行综述,为了解其致病机制及开展治疗靶点研究提供参考。

关键词：急性肾损伤肾功能不全,慢性进展

11R-VIVIT抑制脂多糖诱导的足细胞尿激酶型纤溶酶原激活剂受体的表达

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南方医科大学学报 2013年第7期33卷 1022-1026页

作者：李锐钊史伟马娟章斌张丽梁馨苓陈源汉刘双信王文健广东省人民医院肾内科广东省医学科学院广东广州510080 南方医科大学研究生学院广东广州510515

目的观察11R-VIVIT对脂多糖诱导的足细胞尿激酶型纤溶酶原激活剂受体(uPAR)表达的影响。方法分别建立脂多糖诱导小鼠蛋白尿模型和脂多糖诱导足细胞损伤模型,两种模型均分为正常对照组、脂多糖组和脂多糖+11R-VIVIT组。通过测量尿蛋白—... 详细信息

目的观察11R-VIVIT对脂多糖诱导的足细胞尿激酶型纤溶酶原激活剂受体(uPAR)表达的影响。方法分别建立脂多糖诱导小鼠蛋白尿模型和脂多糖诱导足细胞损伤模型,两种模型均分为正常对照组、脂多糖组和脂多糖+11R-VIVIT组。通过测量尿蛋白—尿肌酐比值观察各组小鼠尿蛋白的情况;通过免疫荧光激光共聚焦,RT—PCR及Western blot观察各组小鼠肾组织及足细胞uPAR基因及蛋白水平。结果脂多糖组小鼠尿蛋白—尿肌酐比值高于正常对照组(P<0.001)及脂多糖+11R—VIVIT组(P<0.001);脂多糖+11R—VIVIT组的小鼠肾组织及足细胞的uPAR的荧光表达弱于脂多糖组,但与正常对照组相似;足细胞脂多糖+11R—VIVIT组的uPAR mRNA和uPAR蛋白表达均低于脂多糖组(PuPAR mRNA<0.001;PuPAR=0.001),但与正常对照组相类似(PuPAR mRNA=0.095;PuPAR=0.252)。结论 11R—VIVIT可能通过抑制足细胞uPAR的表达、稳定和保护足细胞从而起到降蛋白尿的作用。

关键词： 11R-VIVIT 足细胞尿激酶型纤溶酶原激活剂受体

维持性血液透析患者不宁腿综合征的横断面研究

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中华内科杂志 2013年第8期52卷 672-674页

作者：肖成根梁馨苓李锐钊蔡璐许德珍南方医科大学广州510515 广东省人民医院肾内科

【摘要】目的了解维持性血液透析患者中不宁腿综合征（restlesslegssyndrome，RLS）的发病率及其影响因素。方法入选2012年9月1—30日在广东省人民医院血液净化中心行维持性血液透析的375例患者，收集相关实验室和透析指标数据，应用多... 详细信息

【摘要】目的了解维持性血液透析患者中不宁腿综合征（restlesslegssyndrome，RLS）的发病率及其影响因素。方法入选2012年9月1—30日在广东省人民医院血液净化中心行维持性血液透析的375例患者，收集相关实验室和透析指标数据，应用多元logistic回归分析对相关危险因素进行统计分析。结果RLS的发病率为13．3％，严重程度评分为（18．69±0．95）分，多元logistic回归分析显示无尿（OR0．292，95％C10．114～0．750）和B2微球蛋白升高（OR1．023，95％CI1．003～1．044）是维持性血液透析患者发生RLS的危险因素，而体重指数、血红蛋白、血清铁、甲状旁腺素等与RLS无相关性。结论维持性血液透析患者RLS发病率高，其发生危险因素为无尿和B：微球蛋白升高，故保存残余肾功能，提高透析充分性，特别是清除中分子毒素，可降低不宁腿的发生率进而改善透析患者的生活质量。

关键词：不宁腿综合征肾透析横断面研究

缬沙坦对高糖诱导肾小球足细胞活化T细胞核因子2活化及细胞凋亡的影响

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中国新药与临床杂志 2013年第6期32卷 455-459页

作者：李锐钊章斌张丽史伟梁馨苓刘双信王文健南方医科大学.广东广州510515 广东省医学科学院广东省人民医院肾内科广东广州510080

目的探讨缬沙坦对高糖诱导肾小球足细胞活化T细胞核因子2(NFAT2)活化及细胞凋亡的影响。方法将分化成熟的足细胞分组给予不同糖浓度、不同干预时间、NFAT2抑制剂11R-VIVIT、NFAT2活化剂ionomycin等刺激,采用Western blot检测足细胞胞核... 详细信息

目的探讨缬沙坦对高糖诱导肾小球足细胞活化T细胞核因子2(NFAT2)活化及细胞凋亡的影响。方法将分化成熟的足细胞分组给予不同糖浓度、不同干预时间、NFAT2抑制剂11R-VIVIT、NFAT2活化剂ionomycin等刺激,采用Western blot检测足细胞胞核中NFAT2的表达水平、流式细胞仪检测足细胞凋亡情况。结果高糖能刺激足细胞NFAT2活化入核,20 mmol.L-1葡萄糖作用2 h时NFAT2活化入核达到高峰;这与Ionomycin作用相似,两者刺激下的NFAT2的表达水平无显著差异(P>0.05)。缬沙坦、11R-VIVIT与高糖共同刺激下,足细胞核中NFAT2的表达水平低于单纯高糖刺激(P0.05)。20 mmol.L-1葡萄糖作用48 h时,足细胞凋亡率为(21.47±6.24)%,高于5.3 mmol.L-1葡萄糖作用48 h[(12.27±1.31)%,P0.05)。结论缬沙坦可能通过抑制高糖诱导的足细胞NFAT2的过度活化,从而降低高糖诱导的细胞凋亡。

关键词：缬沙坦足细胞糖尿病肾病 NFATC转录因子类细胞凋亡

亲环素D对氧化应激诱发的肾小管上皮细胞坏死的影响

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广东医学 2017年第24期38卷 3784-3787,3791页

作者：杨欢李锐钊董伟张舒刘双信梁馨苓华南理工大学医学院广东广州510006 广东省人民医院(广东省医学科学院)肾内科广东广州510080

目的探讨亲环素D(CypD)在氧化应激时对肾小管上皮细胞坏死的影响。方法 Wistar雄性大鼠随机分对照组(n=6)、假手术组(n=6)及缺血再灌注组(n=6),观察各组血肌酐及肾小管坏死情况。体外培养人近端肾小管上皮细胞HK-2细胞系,以不同浓度(0.7... 详细信息

目的探讨亲环素D(CypD)在氧化应激时对肾小管上皮细胞坏死的影响。方法 Wistar雄性大鼠随机分对照组(n=6)、假手术组(n=6)及缺血再灌注组(n=6),观察各组血肌酐及肾小管坏死情况。体外培养人近端肾小管上皮细胞HK-2细胞系,以不同浓度(0.75、1.5、3 mmol/L)过氧化氢作用12 h及以1.5 mmol/L过氧化氢作用HK-2细胞不同时间(6、12、24 h),观察不同处理条件下细胞的坏死情况;使用环孢素A(CsA)或CypD-siRNA预处理、1.5 mmol/L过氧化氢作用HK-2细胞12 h后,观察细胞坏死情况。结果缺血再灌注组大鼠的血肌酐较对照组及假手术组明显升高(P=0.017,P=0.018);肾组织行HE染色,可见缺血再灌注组近端肾小管明显扩张、刷状缘消失,并存在大量管型、细胞空泡变性以及上皮细胞坏死脱落,对照组和假手术组未见肾脏组织损伤。H_2O_2刺激HK-2细胞系,细胞坏死呈时间及浓度依赖性,随着作用时间增加及H_2O_2浓度的增加,HK-2细胞坏死率显著增加;CypD-siRNA及CypD抑制剂CsA均可明显减轻H_2O_2所诱导的细胞坏死(P=0.026,P=0.008)。结论 CypD介导了氧化应激诱发的肾小管上皮细胞坏死,通过抑制CypD可以改善氧化应激下肾小管上皮细胞的存活率,从而在一定程度上减少缺血再灌注诱发的急性肾损伤。

关键词：亲环素D 肾小管上皮细胞坏死急性肾损伤氧化应激

术后早期使用ACEI／ARB或利尿剂对老年心脏术后急性肾损伤发生的影响

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中华危重病急救医学 2013年第7期25卷 394-398页

作者：胡鹏华陈源汉梁馨苓李锐钊李志莲蒋芬史伟广东省人民医院肾内科、血液净化中心广东省医学科学院广州510080 南方医科大学广东广州510515

【摘要】目的探讨老年心脏手术患者术后早期使用血管紧张素转换酶抑制剂／血管紧张素受体拮抗剂（ACEI／ARB）或利尿剂对术后发生急性肾损伤（AKI）的影响。方法收集2007年1月至2010年12月在广东省人民医院行体外循环（CPB）心脏手术的... 详细信息

【摘要】目的探讨老年心脏手术患者术后早期使用血管紧张素转换酶抑制剂／血管紧张素受体拮抗剂（ACEI／ARB）或利尿剂对术后发生急性肾损伤（AKI）的影响。方法收集2007年1月至2010年12月在广东省人民医院行体外循环（CPB）心脏手术的老年（年龄／〉60岁）患者的临床资料。观察终点为以术前最后一次血肌酐值为基线、且符合RIFLE（危险、损伤、衰竭、肾功能丧失、终末期肾病）标准诊断的AKI。采用logistic回归分析确定心脏术后AKI的独立危险因素。结果共入组618例患者，其中76例（12．3％）术后早期使用ACEI／ARB，491例（79．4％）术后早期使用利尿剂；394例（63．8％）术后发生AKI。术后早期使用ACEI／ARB组AKI的发生率低于未使用ACEI／ARB组（46．1％比66．2％，P〈0．001）；术后早期使用利尿剂组AKI的发生率明显低于未使用利尿剂组（57．0％比89．8％，P〈zO．001）。Logistic回归分析显示，术后早期使用ACEI／ARB[优势比（OR）----0．131，95％可信区间（95％口）为0．033—0．517，P=0．004]或利尿剂（OR-=0．149，95％C1为0．076—0．291，P〈0．001）是具有肾脏保护作用的独立因素。结论术后早期使用ACEI／ARB或利尿剂可降低老年心脏手术患者术后发生AKI的风险。

关键词：血管紧张素转换酶抑制剂血管紧张素受体拮抗剂利尿剂心脏手术急性肾损伤

活性氧自由基在肾小管上皮细胞necroptosis中的作用

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肾脏病与透析肾移植杂志 2017年第3期26卷 246-250页

作者：董伟张舒陈源汉李志莲李锐钊史伟王蔚东李春凌梁馨苓南方医科大学广州510515 广东省人民医院广东省医学科学院中山大学中山医学院高血压研究所

目的:探讨活性氧自由基(ROS)在肾小管上皮细胞necroptosis中的作用。方法:构建肾小管上皮细胞HK-2细胞necroptosis模型,检测其ROS升高程度。并使用NADPH酶抑制剂Apocynin抑制HK-2细胞necroptosis模型中ROS的生成,通过流式细胞计数及检测... 详细信息

目的:探讨活性氧自由基(ROS)在肾小管上皮细胞necroptosis中的作用。方法:构建肾小管上皮细胞HK-2细胞necroptosis模型,检测其ROS升高程度。并使用NADPH酶抑制剂Apocynin抑制HK-2细胞necroptosis模型中ROS的生成,通过流式细胞计数及检测necroptosis的关键蛋白观察HK-2细胞necroptosis的变化。结果:使用肿瘤坏死因子α、苄氧羰酰-缬氨酰-丙氨酰-天冬氨酰-氟甲基酮及抗霉素A成功建立了HK-2细胞necroptosis模型,并观察到HK-2细胞发生necroptosis时ROS显著升高(43.29±2.49 vs 25.90±1.27,P<0.001),而使用necrostatin-1抑制necroptosis后ROS生成受到抑制(35.58±1.08 vs 43.29±2.49,P=0.002)。当对necroptosis模型使用Apocynin干预时,HK-2细胞ROS明显下降(30.71±2.82 vs 43.29±2.49,P<0.001),并且流式细胞计数结果显示坏死细胞比例减少(2.00%±0.30%vs 6.99%±2.79%,P<0.001),同时受体相关蛋白3和混合系列蛋白激酶样结构域的磷酸化水平降低。结论:ROS参与了HK-2细胞的necroptosis,并且通过抑制ROS的生成可减少necroptosis发生,提高损伤状态下HK-2细胞存活率,减轻急性肾小管坏死。

关键词：活性氧自由基 necroptosis 肾小管上皮细胞急性肾损伤