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颠茄qPCR内参基因筛选及TRⅡ基因表达分析

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颠茄qPCR内参基因筛选及TRⅡ基因表达分析

作者：李金弟西南大学

学位级别：硕士

实时荧光定量PCR （qPCR）是在传统的PCR技术基础上发展起来的一种新型的核酸定量技术,具有灵敏度高,特异性好,快速准确等优点而被广泛应用于基因的表达分析。为了排除不同组织和细胞样本之间在RNA的含量、质量和反转录效率上可能存在... 详细信息

实时荧光定量PCR （qPCR）是在传统的PCR技术基础上发展起来的一种新型的核酸定量技术,具有灵敏度高,特异性好,快速准确等优点而被广泛应用于基因的表达分析。为了排除不同组织和细胞样本之间在RNA的含量、质量和反转录效率上可能存在的某些差异,从而获得目的基因特异性表达的真正差异,通常需要使用表达相对稳定内参基因,进行目的基因的校正和标准化。理想的内参基因应该是在各种试验环境或影响因素的作用下,在不同类型的组织或细胞中表达恒定或相对稳定。然而,大量的研究结果表明,并不是所有的内参基因的表达都是十分稳定的,因此在进行目的基因的表达分析之前都应该进行内参基因的筛选,选定一个或两个较为稳定的内参基因有益于获得更为真实可信的结果。颠茄是中国药典唯一规定的托品烷类生物碱（tropane alkaloids, TAs）药源植物。目前还没有关于颠茄内参基因筛选的报道。本实验以颠茄为研究对象,应用qPCR技术,研究经过各种处理（42℃、4℃、MeJA、SA、ABA、EtOH、UV-B和NaCl）之后,颠茄根、茎和叶组织中8个候选内参基因（18S、ACT、GAPDH、TUB、PGK、EF-1α、CYC and FRU）的表达情况,通过三个内参基因表达分析软件包括geNorm、NormFinder、BestKeeper进行内参基因的稳定性分析,最终筛选出相对稳定的内参基因并确定合适的内参基因数。从而更好的对颠茄目的基因的表达分析进行校正,同时也为其它茄科植物内参基因的选择提供理论依据。本研究表明通过geNorm、NormFinder和BestKeeper分析显示：在处理的或未处理的颠茄不同组织中,PGK都表现出较高的稳定性,在今后进行qPCR分析颠茄目的基因的表达分析时,PGK会是一个可靠的内参基因。另外geNorm分析配对差异,结果显示除高温处理颠茄根的V2/3值大于0.15之外,其余的V2/3值都小于0.15。表明应用qPCR分析颠茄目的基因表达量时,需两个内参基因进行校正。而第二个内参基因的选择具有条件特异性。莨菪碱（hyoscyamine）和东莨菪碱（scopolamine）属于TAs,是两种重要的并且在临床上应用广泛的抗胆碱药,市场需求巨大。由于东莨菪碱具有更高的药效和低的副作用,需求更大,然而在野生型颠茄中东莨菪碱的含量比莨菪碱低得多,仅为干重的0.01%-0.08%,使得东莨菪碱的价格高昂。开展代谢工程以提高颠茄中TAs含量具有十分重要的意义。目前TAs的生物合成途径比较清晰,然而对颠茄中托品酮还原酶Ⅱ （tropinone reductase Ⅱ, TRⅡ）基因的克隆和代谢工程研究尚未见报道。TRⅡ是TAs生物合成途径上中间分支处的关键酶,影响TAs代谢的分流,本研究采用RACE方法克隆药用植物颠茄AbTRⅡ基因的cDNA全长,进行详细的生物信息学分析,并用筛选出来的表达相对稳定的内参基因分析颠茄TRⅡ基因的组织表达谱和毛状根诱导表达谱。颠茄的TRⅡ基因（登录号：KC012910）cDNA全长为1124bp,包含一段长度为783bp的CDS、64bp的5’UTR和277bp的3’UTR,polyA长度为12bp,终止密码子为TAA;编码一段含260个氨基酸的蛋白序列（AbTRⅡ）,其编码的氨基酸序列与已经报道的其它茄科TRⅡs氨基酸序列的相似性均在93%以上,保守性很高,进化树分析显示AbTRⅡ与同科不同属植物莨菪（Hyoscyamus niger）的TRⅡ的亲缘关系最近;另外AbTRⅡ蛋白与已报道的曼陀罗及莨菪的TRⅡ同属于短链脱氢酶家族（SDR）,其C端包含SDR所需要的NADP+结合位点（11e192、Thrl94和Ser195）,与底物托品酮的结合位点也主要在C端（Glu156、Va1191和Leu210）。颠茄组织表达谱分析显示AbTRⅡ基因在颠茄的各个部位都有表达,但表达丰度各不相同,在须根的表达量最高,其次是老叶;颠茄空白毛状根诱导表达谱分析显示,AbTRⅡ受UV-B诱导而表达量上调,与空白对照相比具有显著性差异（p＜0.05）;AbTRⅡ表达受到ABA、SA诱导而表达量下调,与乙醇对照相比具有显著性差异（p＜0.05）。诱导子处理的颠茄发根东莨菪碱含量结果显示：ABA处理后,东莨菪碱提高的幅度最大,达到0.88mg·g-1DW,比空白对照的东莨菪碱含量（0.12mg·g-1DW）提高了6.3倍,比EtOH处理的东莨菪碱含量（0.28mg·g-1DW）提高了2.1倍。 AbTRⅡ基因的表达分析及诱导子处理后发根东莨菪碱的含量分析有助于我们筛选出合适的诱导子用于处理颠茄植株以提高其东莨菪碱含量。

关键词：颠茄 qPCR 内参基因托品酮还原酶Ⅱ

过表达莨菪h6h基因提高颠茄东莨菪碱含量的研究

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中国中药杂志 2013年第11期38卷 1719-1724页

作者：李金弟秦白富杨春贤兰小中吴能表廖志华西南大学生命科学学院重庆市甘薯工程技术研究中心重庆400715 西南大学三峡库区生态环境教育部重点实验室重庆400715 西藏农牧学院西藏林芝860000

文章采用代谢工程方法培育东莨菪碱高产转基因颠茄。根癌农杆菌遗传转化颠茄,过量表达东莨菪碱合成途径中限速酶基因h6h(Hnh6h),卡那霉素筛选获得转基因植株,快繁炼苗后,田间栽培至果期。基因组PCR鉴定转Hnh6h基因颠茄。SPSS软件分析转... 详细信息

文章采用代谢工程方法培育东莨菪碱高产转基因颠茄。根癌农杆菌遗传转化颠茄,过量表达东莨菪碱合成途径中限速酶基因h6h(Hnh6h),卡那霉素筛选获得转基因植株,快繁炼苗后,田间栽培至果期。基因组PCR鉴定转Hnh6h基因颠茄。SPSS软件分析转基因与非转基因颠茄株高、顶宽、主茎粗、叶长、叶宽、分支数和鲜重等性状的差异;HPLC测定其根、茎、叶、果中莨菪碱及东莨菪碱含量;采用qPCR技术测定各组织Hnh6h基因表达量。结果所获得的5个转基因颠茄株系(A8,A11,A12,C8,C19)都能同时检测到Kanr和Hnh6h基因,在非转基因颠茄中没有检测到这2个基因;与非转基因颠茄比较,转基因颠茄株系的株高、顶宽、主茎粗、叶长、叶宽、分支数和鲜重等都没有降低,且部分性状优于对照。转基因颠茄叶片中东莨菪碱含量最高,且高于莨菪碱;不同转基因颠茄株系叶片中东莨菪碱含量依次为C8>A12>C19>A11>A8,C8的东莨菪碱质量分数(2.17 mg.g-1DW)比非转基因颠茄(0.42 mg.g-1DW)提高4.2倍;在转基因颠茄根、茎、叶和果中都检测到Hnh6h基因表达,且在叶片中表达量最高,非转基因颠茄没有检测到Hnh6h基因表达。因此,过表达Hnh6h基因能够打破颠茄的东莨菪碱生物合成的限速反应,从而推动代谢流向东莨菪碱合成方向流动,提高了东莨菪碱合成能力,最终获得了东莨菪碱高含量的转基因颠茄。

关键词：颠茄莨菪碱6β-羟化酶东莨菪碱转基因

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补阳还五汤联合针灸治疗中风的临床效果

名医 2021年第5期 100-101页

作者：李金弟北京银龄中医医院

目的:分析补阳还五汤联合针灸治疗中风的临床效果。方法:选取本院2019年1—12月收治的168例中风患者为研究对象,采用随机数表法分为对照组和观察组,各84例,对照组患者给予常规西医治疗,观察组在该基础上给予补阳还五汤联合针灸治疗。比... 详细信息

目的:分析补阳还五汤联合针灸治疗中风的临床效果。方法:选取本院2019年1—12月收治的168例中风患者为研究对象,采用随机数表法分为对照组和观察组,各84例,对照组患者给予常规西医治疗,观察组在该基础上给予补阳还五汤联合针灸治疗。比较两组住院时间、治疗前后患者血液流变学指标、神经功能评分、总有效率。结果:观察组患者住院时间短于对照组,治疗后患者血液流变学指标、神经功能评分低于对照组,总有效率高于对照组,组间比较,差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论:补阳还五汤联合针灸治疗中风患者的效果良好,可改善神经功能和血液流变学,缩短住院时间。

关键词：补阳还五汤针灸中风患者影响

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海木提取物对小鼠学习记忆功能的影响

时珍国医国药 2010年第9期21卷 2277-2279页

作者：李家洲卢海啸李金弟黎建玲玉林师范学院广西玉林537000

目的探讨海木提取物对小鼠学习记忆功能的影响。方法运用避暗法、跳台法、Morris水迷宫法等方法检测海木枝叶不同萃取物对正常小鼠及盐酸氯丙嗪、亚硝酸钠、乙醇所致记忆障碍小鼠学习记忆能力的影响,并筛选出最高活性部位。结果①海木... 详细信息

目的探讨海木提取物对小鼠学习记忆功能的影响。方法运用避暗法、跳台法、Morris水迷宫法等方法检测海木枝叶不同萃取物对正常小鼠及盐酸氯丙嗪、亚硝酸钠、乙醇所致记忆障碍小鼠学习记忆能力的影响,并筛选出最高活性部位。结果①海木各提取部位均能延长小鼠避暗实验的潜伏期,减少错误次数,其中氯仿部位活性最高(P<0.01);②氯仿萃取物的中、大剂量组与对照组比较,能显著缩短正常小鼠定位航行实验中的逃避潜伏期,增加经过原平台的次数以及在原平台象限停留的时间(P<0.05);③氯仿萃取物对盐酸氯丙嗪、亚硝酸钠及乙醇所致记忆障碍小鼠均具有显著的改善作用(P<0.05)。结论海木提取物具有增强正常小鼠学习记忆能力,改善学习记忆障碍小鼠学习记忆能力的作用,其中氯仿萃取物为最高活性部位,其作用呈现一定的量效关系。

关键词：海木小鼠学习记忆

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颠茄高频再生体系的建立及卡那霉素抗性筛选

安徽农业科学 2011年第17期39卷 10197-10198,10373页

作者：王细荣强玮卢衍李金弟陈敏廖志华西南大学生命科学学院重庆400715

[目的]建立颠茄高频再生体系及筛选卡那霉素(Kan)抗性。[方法]以颠茄叶片及腋芽为外植体,研究了培养基中6-BA和NAA不同配比对其不定芽分化的影响以及叶片不定芽对Kan的敏感性。[结果]MS+4.5mg/L6-BA+0.2mg/LNAA为叶片不定芽分化的最佳... 详细信息

[目的]建立颠茄高频再生体系及筛选卡那霉素(Kan)抗性。[方法]以颠茄叶片及腋芽为外植体,研究了培养基中6-BA和NAA不同配比对其不定芽分化的影响以及叶片不定芽对Kan的敏感性。[结果]MS+4.5mg/L6-BA+0.2mg/LNAA为叶片不定芽分化的最佳培养基,不定芽分化率达100%,在1cm×1cm叶块上的不定芽分化数平均达5.85;MS+3.0mg/L6-BA+0.1mg/LNAA为腋芽不定芽分化的最适培养基,不定芽分化率达100%,每个腋芽不定芽分化平均数为4～8个;400.0mg/LKan为颠茄叶片遗传转化的最佳筛选浓度。[结论]为颠茄无菌苗的快速繁殖以及基于叶盘法的遗传转化奠定了基础。

关键词：颠茄再生体系 Kan 敏感性

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热可贴土工膜的生产与应用技术

塑料加工 2002年第4期35卷 42-43页

作者：郭元生李金弟等山东泰峰塑料有限公司，泰安271000

介绍热可贴土工膜的结构、特点、生产工艺流程、关键技术、原材料的配方、关键工艺、质量标准、物理力学性能指标、应用领域、应用时注意事项等。

关键词：热可贴土工膜生产应用工艺质量标准

颠茄托品烷生物碱合成途径基因表达分析与生物碱积累研究

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中国中药杂志 2014年第1期39卷 52-58页

作者：强玮王亚雄张巧卓李金弟夏科吴能表廖志华西南大学生命科学学院教育部三峡库区生态环境重点实验室重庆400715 西南大学生命科学学院重庆市甘薯工程技术研究中心重庆400715

托品烷类生物碱(tropane alkaloids,TAs)是临床上广泛使用的抗胆碱药物,颠茄是药典收录的TAs最主要的商业栽培药源植物。基于颠茄转录组测序数据构建TAs合成途径中9个结构基因(ODC,ADC,AIH,CPA,SPDS,PMT,CYP80F1,H6H,TRⅡ)UniGene序列... 详细信息

托品烷类生物碱(tropane alkaloids,TAs)是临床上广泛使用的抗胆碱药物,颠茄是药典收录的TAs最主要的商业栽培药源植物。基于颠茄转录组测序数据构建TAs合成途径中9个结构基因(ODC,ADC,AIH,CPA,SPDS,PMT,CYP80F1,H6H,TRⅡ)UniGene序列的数字表达谱,采用qPCR对其中4个已报道基因(PMT,CYP80F1,H6H,TRⅡ)的表达水平进行验证分析,同时采用HPLC测定不同组织中TAs含量。数字表达谱分析结果表明4个TAs上游合成途径基因(ODC,ADC,AIH,CPA)和2个支路途径基因(SPDS,TRⅡ)在颠茄各器官中均有表达,但在须根中高水平表达;3个TAs合成途径特异的结构基因PMT,CYP80F1和H6H均只在须根中大量表达,主根中其次。qPCR检测PMT,CYP80F1,H6H,TRⅡ的表达结果与数字表达谱基本一致,但PMT,CYP80F1,H6H在主根中表达量很低。莨菪碱质量分数在嫩茎中最高(3.364 mg·g-1),幼叶,根,幼果和果萼中其次(分别为1.526,1.598,1.271,1.413 mg·g-1);东莨菪碱质量分数在果萼中最高(1.003 mg·g-1),嫩茎和幼叶(分别为0.600,0.601 mg·g-1)中其次;2种生物碱在老茎(莨菪碱0.283 mg·g-1,东莨菪碱0.043 mg·g-1)和老叶(莨菪碱0.313 mg·g-1,东莨菪碱0.080 mg·g-1)中质量分数均为最低。该研究结果表明须根是颠茄TAs生物合成主要器官,而地上幼嫩组织是TAs主要存贮积累器官,TAs合成后存在转运过程。PMT下游基因均只在须根中表达,筛选颠茄须根的转录组数据库就可能为解决该途径中不清晰的合成步骤和相关转录调控因子提供有力的帮助。

关键词：颠茄托品烷生物碱数字表达谱 qPCR

黄连温胆汤联合心理疗法治疗痰热扰神型失眠症的价值

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心理月刊 2021年第15期16卷 76-77页

作者：李金弟刘佃飞董洪海北京银龄中医医院中医科

目的对黄连温胆汤联合心理疗法治疗痰热扰神型失眠症的价值进行研究。方法抽取90例2020年1月～2020年12月来医院治疗痰热内扰型失眠症的患者作为研究对象。与患者沟通后,按入院顺序进行分组,甲组给予黄连温胆汤中药治疗,乙组给予黄连温... 详细信息

目的对黄连温胆汤联合心理疗法治疗痰热扰神型失眠症的价值进行研究。方法抽取90例2020年1月～2020年12月来医院治疗痰热内扰型失眠症的患者作为研究对象。与患者沟通后,按入院顺序进行分组,甲组给予黄连温胆汤中药治疗,乙组给予黄连温胆汤联合心理疗法治疗,每组45例。经过不同方法治疗后,分析两组患者治疗前后夜间觉醒次数、入睡时间、睡眠时间、失眠、头晕、口苦、痰多、胸闷情况;比较两组的治疗效果。结果治疗后,两组患者的睡眠质量和各种症状指标均优于治疗前,效果最为显著的是乙组(P<0.05)。结论心理疗法与黄连温胆汤联合治疗痰热扰神型失眠症效果好,既能改善患者失眠情况,还能提升患者睡眠质量,缓解患者的失眠症状。

关键词：黄连温胆汤心理疗法痰热扰神失眠症