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免疫复合物型增效乙型肝炎疫苗细胞免疫检测方法的建立

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中华实验和临床病毒学杂志 2011年第4期25卷 310-312页

作者：王娟吴刚赵莉李计来许丽锋徐静北京生物制品研究所 100024

目的建立免疫复合型增效乙型肝炎疫苗细胞免疫检测方法并与常规乙型肝炎疫苗进行比较。方法增效乙型肝炎疫苗肌内免疫BALB/c小鼠，Elispot方法检测小鼠脾脏淋巴细胞分泌IFN-γ的细胞频数（SFC），优化实验条件：免疫剂量、检测时间和... 详细信息

目的建立免疫复合型增效乙型肝炎疫苗细胞免疫检测方法并与常规乙型肝炎疫苗进行比较。方法增效乙型肝炎疫苗肌内免疫BALB/c小鼠，Elispot方法检测小鼠脾脏淋巴细胞分泌IFN-γ的细胞频数（SFC），优化实验条件：免疫剂量、检测时间和特异性刺激物及刺激浓度。同时将增效乙型肝炎疫苗与常规乙型肝炎疫苗进行比较。结果5μg免疫组IFN-γ SFC明显高于2μg免疫组，初次免疫后3周IFN-γ SFC开始下降，多肽刺激IFN-γ SFC高于蛋白刺激，多肽浓度为2μg即可充分刺激斑点形成；增效乙肝疫苗免疫组IFN-γ SFC高于常规乙型肝炎疫苗组。结论初步建立了免疫复合型增效乙型肝炎疫苗细胞免疫检测方法并证明其重复性良好，其细胞免疫水平高于常规乙型肝炎疫苗。

关键词：肝炎疫苗乙型酶试验

重组乙型肝炎病毒核心抗原的免疫原性及其对乙型肝炎病毒表面抗原的免疫增强作用

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中国生物制品学杂志 2013年第6期26卷 745-749页

作者：李计来徐静王娟吴刚赵莉许丽锋北京生物制品研究所有限责任公司第三研究室北京100024

目的探讨重组乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)的免疫原性及其对重组乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)的免疫增强作用。方法用透射电镜观察HBcAg、HBsAg及HBcAg+HBsAg混合抗原病毒样颗粒(Virus-like particle,VLP)的形态。将小鼠随机分为6组:阴... 详细信息

目的探讨重组乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)的免疫原性及其对重组乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)的免疫增强作用。方法用透射电镜观察HBcAg、HBsAg及HBcAg+HBsAg混合抗原病毒样颗粒(Virus-like particle,VLP)的形态。将小鼠随机分为6组:阴性对照组(NS)、HBcAg组(C)、HBsAg组(S)、HBsAg+铝佐剂组(S+Al)、HBsAg+HBcAg混合组(S+C)及HBsAg+HBcAg+铝佐剂组(S+C+Al),用相应抗原免疫各组小鼠,分别于第0天、第14天经小鼠双侧大腿肌肉进行初次和加强免疫1次,间接ELISA法检测各组小鼠血清中HBsAg和HBcAg的特异性抗体水平,分析HBsAg特异性抗体亚类,ELISPOT法检测各组小鼠脾细胞中HBsAg特异性IFNγ、HBcAg特异性IFNγ及HBsAg特异性IL-4水平。结果电镜观察可见HBsAg和HBcAg均呈大小均一的VLP结构,二者混合后有聚集现象。初次免疫后,S+C组的HBsAg特异性抗体水平与S组差异无统计学意义(P=0.074),加强免疫后,S+C组HBsAg特异性抗体水平明显高于S组(P=0.002),C组和S+C组均可产生高水平HBcAg特异性抗体。S组HBsAg抗体亚类以IgG1为主,S+C组以IgG2a为主。S+C组HBsAg特异性IFNγ斑点数明显高于S组、S+Al组和S+C+Al组(P<0.05),C组与S+C组HBcAg特异性IFNγ斑点数均较高,与S+C+Al组比较,S+Al组HBsAg特异性IL-4斑点数明显升高(P=0.026)。结论 HBcAg具有良好的免疫原性,可增强HBsAg的免疫反应,使反应向Th1方向极化,为治疗性乙肝疫苗的研发奠定了基础。

关键词：乙型肝炎核心抗原乙型肝炎表面抗原免疫原性病毒样颗粒体液免疫细胞免疫

乙型肝炎病毒核心抗原与前S1抗原融合蛋白的原核表达、纯化及其免疫原性

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中国生物制品学杂志 2011年第3期24卷 249-254页

作者：吴刚李计来王娟赵莉徐静北京生物制品研究所免疫研究室北京100024

目的原核表达、纯化乙型肝炎病毒(HBV)核心抗原(HBcAg)(1～155)与前S1抗原(PreS1)(3～55)融合蛋白,并分析其免疫原性。方法从HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者血清中提取HBV DNA,以其为模板,PCR分别扩增HBcAg和preS1部分基因片段及融合基因CS1... 详细信息

目的原核表达、纯化乙型肝炎病毒(HBV)核心抗原(HBcAg)(1～155)与前S1抗原(PreS1)(3～55)融合蛋白,并分析其免疫原性。方法从HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者血清中提取HBV DNA,以其为模板,PCR分别扩增HBcAg和preS1部分基因片段及融合基因CS1,将CS1基因亚克隆入原核表达载体pET-32a(+),构建重组原核表达质粒pET-CS1,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,表达产物经纯化后进行SDS-PAGE、HPLC和Western blot等分析。将纯化的融合蛋白免疫BALB/c小鼠,采用竞争抑制法检测血清Anti-HBc水平,间接ELISA法检测Anti-PreS1水平,并检测抗体亚类;ELISPOT法评价其细胞免疫效果。结果重组原核表达质粒pET-CS1经双酶切证明构建正确;电镜分析表明粗纯的CS1可自行组装成病毒样颗粒(VLP),直径约为30 nm;SDS-PAGE和HPLC分析显示,CS1蛋白纯度分别为98.2%和93%;纯化的CS1蛋白可与兔抗人HBcAgr多抗和鼠抗人PreS1单抗特异结合,并能诱导小鼠产生Anti-HBc和Anti-PreS1抗体,抗体亚类以IgG2a为主,并能够诱生小鼠脾细胞产生HBcAg特异性的IFNγ。结论已成功原核表达并纯化了融合蛋白CS1,纯化的CS1纯度较高,能诱导机体产生较高水平的特异性体液免疫和细胞免疫反应。

关键词：肝炎核心抗原,乙型前S1抗原重组融合蛋白质类体液免疫细胞免疫

重组水痘-带状疱疹病毒gEΔ-Fc融合蛋白在CHO细胞中的表达、鉴定及免疫原性分析

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中华微生物学和免疫学杂志 2020年第9期40卷 709-713页

作者：崔文禹李计来张转侯一波徐静国药中生生物技术研究院有限公司第三研究室北京101111

目的应用CHO细胞表达系统表达重组水痘-带状疱疹病毒(varicella-zoster virus,VZV)gEΔ-Fc融合蛋白,为筛选重组带状疱疹疫苗候选抗原提供参考。方法将含有编码gEΔ-Fc基因的真核表达质粒转染CHO细胞,经MSX加压筛选和有限稀释法挑选单克... 详细信息

目的应用CHO细胞表达系统表达重组水痘-带状疱疹病毒(varicella-zoster virus,VZV)gEΔ-Fc融合蛋白,为筛选重组带状疱疹疫苗候选抗原提供参考。方法将含有编码gEΔ-Fc基因的真核表达质粒转染CHO细胞,经MSX加压筛选和有限稀释法挑选单克隆,获得分泌表达gEΔ-Fc融合蛋白的CHO细胞株。MabSelect SuRe亲和层析纯化gEΔ-Fc融合蛋白,ELISA法对gEΔ-Fc融合蛋白与Fc受体结合进行鉴定,流式细胞术检测DC2.4细胞对抗原的吞噬效果。gEΔ-Fc融合蛋白免疫BALB/c小鼠后,ELISA法检测小鼠血清抗体效价。结果获得表达gEΔ-Fc融合蛋白的CHO细胞株;流式细胞术证明DC2.4细胞对gEΔ-Fc融合蛋白的吞噬强于gE;gEΔ-Fc融合蛋白可以诱导BALB/c小鼠产生高滴度的抗VZV抗体。结论应用CHO细胞表达的重组VZV gEΔ-Fc融合蛋白具有较好的免疫原性。本研究为筛选重组带状疱疹疫苗候选抗原提供了数据支持。

关键词：水痘-带状疱疹病毒糖蛋白融合蛋白 Fc受体

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不同佐剂流感疫苗的小鼠免疫效果

中国生物制品学杂志 2012年第12期25卷 1569-1572页

作者：单璞徐立猛李计来李媛媛凌媛马志新徐静北京生物制品研究所有限责任公司北京100024

目的评价不同佐剂流感疫苗的小鼠免疫效果。方法培养并纯化流感病毒鼠肺适应株PR/8/34,制备流感病毒裂解液。将BALB/c小鼠随机分为5组:流感病毒PR/8/34裂解液(HA)组、HA+大肠杆菌不耐热肠毒素b亚单位(Heat-labile exterotoxin B subunit... 详细信息

目的评价不同佐剂流感疫苗的小鼠免疫效果。方法培养并纯化流感病毒鼠肺适应株PR/8/34,制备流感病毒裂解液。将BALB/c小鼠随机分为5组:流感病毒PR/8/34裂解液(HA)组、HA+大肠杆菌不耐热肠毒素b亚单位(Heat-labile exterotoxin B subunit,LTB)组、HA+弗氏不完全佐剂(FIA)组、HA+A(lOH)3组和生理盐水对照组,HA+LTB组采用滴鼻黏膜免疫,免疫剂量为50μl/只,其余各组均采用肌肉注射,免疫剂量为100μl/只,共免疫2次,间隔2周。于初次免疫后28 d,经小鼠眼内眦采血,分离血清,检测各组小鼠血清IgG抗体效价、血凝抑制效价及攻毒后保护力及鼠肺病毒RNA载量,评价不同佐剂对流感疫苗的免疫增强作用。结果各佐剂组小鼠血清IgG抗体水平及血凝抑制效价均显著高于HA组,且差异均有统计学意义(P均0.05)。各佐剂组和HA组小鼠攻毒后均存活,HA+FIA组鼠肺病毒RNA载量最低,HA+LTB组与HA+A(lOH)3组相当。结论不同佐剂对流感疫苗均有一定的免疫增强作用,其中LTB滴鼻免疫和A(lOH)3肌肉注射对流感疫苗的免疫增强作用相当。

关键词：流感疫苗佐剂小鼠免疫效果

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免疫复合物型乙型肝炎疫苗的免疫原性分析

中华微生物学和免疫学杂志 2013年第11期33卷 813-818页

作者：徐静王娟吴刚周嘉琪单璞李计来许丽锋北京生物制品研究所有限责任公司 101111 北京天坛生物制品股份有限公司

目的：分析免疫复合物型乙型肝炎疫苗在小鼠体内和食蟹猴体内的免疫原性。方法免疫复合物型乙型肝炎疫苗单次免疫小鼠，不同时间点采血进行anti-HBs滴度动态检测；不同免疫程序免疫小鼠，进行anti-HBs滴度检测；肌肉注射5μg/只免疫小鼠... 详细信息

目的：分析免疫复合物型乙型肝炎疫苗在小鼠体内和食蟹猴体内的免疫原性。方法免疫复合物型乙型肝炎疫苗单次免疫小鼠，不同时间点采血进行anti-HBs滴度动态检测；不同免疫程序免疫小鼠，进行anti-HBs滴度检测；肌肉注射5μg/只免疫小鼠，ELISPOT方法检测IFN-γ形成斑点数并进行阳转率统计；测定稳定性试验样品的ED50；分别以20μg/只和100μg/只剂量免疫食蟹猴，不同时间点采血检测anti-HBs滴度。结果免疫复合物型乙型肝炎疫苗动态检测anti-HBs滴度均高于重组乙型肝炎疫苗（酿酒酵母）；免疫复合物型乙型肝炎免疫2针次anti-HBs滴度可达到重组乙型肝炎疫苗（酿酒酵母）免疫3针次水平；免疫复合物型乙型肝炎疫苗细胞免疫检测IFN-γ斑点形成细胞（ SFC）及阳转率高于重组乙型肝炎疫苗（酿酒酵母）及酿酒乙型肝炎疫苗国家参考品；免疫复合物型乙型肝炎疫苗长期稳定性优于酿酒酵母乙肝疫苗，ED50值低于后者，高低两种剂量免疫食蟹猴，均可诱导高滴度anti-HBs，且持续性良好。结论免疫复合物型乙型肝炎疫苗有较好的免疫原性，其体液免疫和细胞免疫水平均优于重组乙型肝炎疫苗（酿酒酵母）。

关键词：免疫复合物乙型肝炎疫苗免疫原性

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CHO DG44细胞电转染条件的优化

中国生物制品学杂志 2017年第11期30卷 1207-1210页

作者：李计来崔文禹刘敬郝少杰徐静国药中生生物技术研究院有限公司北京101111

目的优化CHO DG44细胞的电转染条件,提高细胞的转染效率。方法采用电转染的方法将p EGFP-1质粒转入CHO DG44细胞内,利用L9(33)正交试验设计,对质粒量、电压和电容3因素进行优化,流式细胞仪检测不同条件下的绿色荧光蛋白(green fluoresce... 详细信息

目的优化CHO DG44细胞的电转染条件,提高细胞的转染效率。方法采用电转染的方法将p EGFP-1质粒转入CHO DG44细胞内,利用L9(33)正交试验设计,对质粒量、电压和电容3因素进行优化,流式细胞仪检测不同条件下的绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)阳性率和GFP的平均荧光强度,台盼蓝染色对细胞进行计数,了解细胞生长情况。结果 3个因素中,电压对转染效率影响最大,其次为电容,质粒浓度影响最小。质粒量8μg、电压300 V、电容900μF为最佳电转染条件。结论优化了CHO DG44细胞的电转染条件,为外源基因转染CHO DG44细胞表达重组蛋白提供了基础数据。

关键词：电转染 CHO DG44细胞正交试验设计转染效率

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带状疱疹疫苗的研究及应用

微生物与感染 2020年第3期15卷 186-191页

作者：李计来徐静国药中生生物技术研究院有限公司第三研究室北京101111

带状疱疹是由潜伏在体内的水痘-带状疱疹病毒再激活引起的一种急性皮肤病,主要发生于老年人等免疫力低下人群。带状疱疹是一种自限性疾病,临床主要表现为带状、成片的皮疹,而其后遗神经痛为该病中最复杂且最常见的不良并发症。带状疱疹... 详细信息

带状疱疹是由潜伏在体内的水痘-带状疱疹病毒再激活引起的一种急性皮肤病,主要发生于老年人等免疫力低下人群。带状疱疹是一种自限性疾病,临床主要表现为带状、成片的皮疹,而其后遗神经痛为该病中最复杂且最常见的不良并发症。带状疱疹的发病机制较为复杂,推测与机体的特异性T细胞免疫水平降低有关。本文就带状疱疹与T细胞之间的关系,最新疫苗研究进展进行综述,为疫苗的研发及带状疱疹的预防提供参考。

关键词：水痘-带状疱疹病毒带状疱疹后遗神经痛发病机制带状疱疹疫苗

HBcAg-VEGF抗原表位融合蛋白的原核表达、纯化及其免疫原性

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中国生物制品学杂志 2013年第9期26卷 1278-1284页

作者：张占东徐静李计来李树香周亚王欣怡刘敬张云涛北京生物制品研究所有限责任公司第三研究室北京100024

目的原核表达、纯化HBcAg-VEGF抗原表位融合蛋白,并分析其免疫原性。方法生物信息学方法预测鼠血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）的B细胞抗原表位,采用重叠延伸PCR（splicing by overlap extension PCR,SO... 详细信息

目的原核表达、纯化HBcAg-VEGF抗原表位融合蛋白,并分析其免疫原性。方法生物信息学方法预测鼠血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）的B细胞抗原表位,采用重叠延伸PCR（splicing by overlap extension PCR,SOE-PCR）法将VEGF抗原表位基因插入到HBcAg基因的免疫优势区内,合成HBcAg-VEGF基因序列,克隆至原核表达载体pET-32a中,构建重组表达质粒pET-32a-HBcAg-VEGF,转化大肠埃希菌BL21（DE3）,IPTG诱导表达。表达产物经羟基磷灰石CHT层析、Sephacryl S-400HR凝胶过滤层析纯化后,与Al（OH）3佐剂混合,分别于第0、7、14、21天经肌肉免疫BALB/c小鼠1次,第28天采血,ELISA法检测血清中抗VEGF抗原表位抗体,VEGF受体结合抑制试验筛选具有良好免疫原性的VEGF优势抗原表位。对筛选出的优势抗原表位融合蛋白进行表达及纯化条件的优化。结果生物信息学软件预测了6个VEGF的B细胞抗原表位;6个重组表达质粒经菌落PCR及测序证实构建正确;表达的HBcAg-VEGF抗原表位融合蛋白相对分子质量为14400～20100,纯度均在85%以上,除HBcAg-VEGF3以单体形式存在、不形成颗粒外,其他融合蛋白均能形成VLP;各组HBcAg-VEGF融合蛋白免疫小鼠后,均刺激机体产生了针对VEGF抗原表位肽的特异性抗体,其中HBcAg-VEGF1组抗体水平最高,且抑制VEGF与VEGFR结合的能力最强;采用优化的条件表达、纯化的HBcAg-VEGF1抗原表位融合蛋白纯度达95%以上。结论筛选得到的HBcAg-VEGF1抗原表位融合蛋白显示出较好的免疫原性,为进一步研究其抗肿瘤效应奠定了基础。

关键词：血管内皮生长因子乙型肝炎核心抗原抗原表位融合蛋白原核细胞基因表达免疫原性