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猪源粪肠球菌对猪小肠上皮细胞黏附及致炎作用的影响

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河南农业大学学报 2023年第4期57卷 623-631页

作者：金钺李滨洲郭珍珍王亚宾魏战勇陈丽颖河南农业大学动物医学院河南郑州450046 河南省动物性食品安全重点实验室河南郑州450046 北京市华都峪口禽业有限责任公司北京101206

【目的】通过研究猪源粪肠球菌对肠上皮细胞黏附与致炎作用的影响,探究其致病机制。【方法】利用自行分离鉴定的猪源粪肠球菌N41菌株和N8菌株,通过吉姆萨染色、革兰氏染色、间接免疫荧光检测和场发射扫描电子显微镜观察等手段观察猪源... 详细信息

【目的】通过研究猪源粪肠球菌对肠上皮细胞黏附与致炎作用的影响,探究其致病机制。【方法】利用自行分离鉴定的猪源粪肠球菌N41菌株和N8菌株,通过吉姆萨染色、革兰氏染色、间接免疫荧光检测和场发射扫描电子显微镜观察等手段观察猪源粪肠球菌体外黏附猪小肠上皮细胞(intestinal porcine epithelial cells,IPEC-J2),应用荧光定量PCR方法检测IPEC-J2炎性细胞因子转录水平的变化,以及上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)标志物包括上皮细胞钙黏蛋白(E-cadherin)、神经钙黏蛋白(N-cadherin)、β-连环蛋白(β-catenin)、蜗形蛋白(snail)和波形蛋白(vimen)的转录水平变化。【结果】吉姆萨染色和革兰氏染色镜检结果发现,粪肠球菌能黏附于IPEC-J2,黏附部位位于细胞表面及细胞间紧密连接处,出现聚集现象,呈现不均匀性;携带相同主要毒力基因的粪肠球菌(粪肠球菌N8菌株、粪肠球菌N41菌株)在体外对IPEC-J2的黏附存在差异。荧光定量PCR检测结果显示,感染粪肠球菌后,IPEC-J2中的促炎因子白细胞介素1β(interleukin 1β,IL-1β)、IL-6和IL-8的表达呈现出相似的炎症反应规律,总体趋势为感染后1~4 h炎症反应水平随时间而升高,4~6 h炎症反应降低但仍高于空白对照组细胞。同时,粪肠球菌感染下调了抗炎因子转化生长因子β(transforming growth factorβ,TGF-β)和IL-12的转录水平,以IL-12的下降最显著。此外,不同菌株对于上述细胞因子水平的调节有一定差异,其中N41菌株对促炎因子的上调能力高于N8菌株,而N8菌株对抗炎因子的下调幅度高于N41菌株。EMT标志物检测结果表明,与致病菌肠出血性大肠杆菌O157∶H7相比,猪源粪肠球菌感染IPEC-J2后对EMT标志物的表达水平影响并不明显。【结论】证实了猪源粪肠球菌对IPEC的体外侵袭能力,同时该菌会引起炎性细胞因子的表达升高。

关键词：粪肠球菌黏附机制炎症反应上皮细胞间质转化猪小肠上皮细胞

粪肠球菌Ace抗原表位预测及重组表位疫苗载体构建与表达

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河南农业大学学报 2019年第3期53卷 379-384页

作者：郭珍珍和春昊李滨洲楚红燕张晨昕杨国宇陈丽颖河南农业大学牧医工程学院河南郑州450002 北京化工大学国际教育学院北京102200 河南省动物性食品安全重点实验室河南郑州450002

利用生物信息学软件预测抗原表位,然后将筛选出的6个抗原表位基因片段分别与铁蛋白H亚基基因片段连接,并克隆到pET-32a表达载体中,构建能融合表达Ace抗原表位和铁蛋白H亚基的重组质粒pET-32a-ace1、pET-32a-ace2、pET-32a-ace3、pET-32a... 详细信息

利用生物信息学软件预测抗原表位,然后将筛选出的6个抗原表位基因片段分别与铁蛋白H亚基基因片段连接,并克隆到pET-32a表达载体中,构建能融合表达Ace抗原表位和铁蛋白H亚基的重组质粒pET-32a-ace1、pET-32a-ace2、pET-32a-ace3、pET-32a-ace4、pET-32a-ace5、pET-32a-ace6,并经测序验证;优化诱导条件获得原核表达的重组蛋白后,用SDS-PAGE和WesternBlot验证其相对分子质量大小和免疫原性;将重组蛋白进行纯化超滤,然后进行透射电镜成像检查。结果显示,本研究成功构建了7种原核表达载体;在IPTG诱导下获得了5种可溶性表达的融合蛋白,且均有较强的免疫原性;重组融合蛋白Ace1-H、Ace3-H、Ace5-H和Ace6-H在透射电镜下观察到了具有与天然铁蛋白类似的特殊中空结构,且其直径与天然铁蛋白纳米笼类似;而带多表位的重组蛋白Ace-H虽然也能自组装成纳米级颗粒,但没有中空核心,其直径也比天然铁蛋白略大。

关键词：粪肠球菌胶原蛋白黏附素铁蛋白纳米笼表位

共培养对猪源粪肠球菌N41株部分生物学特性的影响

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中国预防兽医学报 2018年第1期40卷 74-77页

作者：和春昊武二丽李滨洲赵娣金钺王亚宾陈丽颖河南农业大学牧医工程学院河南郑州450002 河南省动物性食品安全重点实验室河南郑州450002

为探讨粪肠球菌在体外共培养条件下其生物膜形成、黏附能力和抗吞噬作用等生物学特性的变化,本研究以猪源粪肠球菌N41菌株为受试菌株,将其分别与大肠杆菌O157∶H7、沙门氏菌肠炎亚种ATCC 14028以及金黄色葡萄球菌ATCC 25923等参考菌株... 详细信息

为探讨粪肠球菌在体外共培养条件下其生物膜形成、黏附能力和抗吞噬作用等生物学特性的变化,本研究以猪源粪肠球菌N41菌株为受试菌株,将其分别与大肠杆菌O157∶H7、沙门氏菌肠炎亚种ATCC 14028以及金黄色葡萄球菌ATCC 25923等参考菌株共培养,通过结晶紫染色法测定其生物被膜生成量,通过菌落计数对猪肠上皮细胞黏附情况和小鼠腹腔巨噬细胞的抗吞噬能力进行定量。结果显示,大肠杆菌O157∶H7对粪肠球菌N41菌株生物膜生成量、黏附作用和抗吞噬作用的变化均不明显(p>0.05);沙门氏菌ATCC 14028对粪肠球菌N41菌株的黏附作用明显增强(0.010.05);而金黄色葡萄球菌ATCC 25923则对粪肠球菌N41菌株的生物膜量增加和黏附作用明显增强(p<0.01),抗吞噬作用也所有增强(0.01

关键词：粪肠球菌共培养生物膜黏附抗吞噬作用

携肠球菌Ace抗原的铁蛋白纳米粒制备与免疫效果检测

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河南农业大学学报 2020年第4期54卷 638-642页

作者：和春昊金钺张晨昕郭珍珍李滨洲吴秋玲王亚宾陈丽颖河南农业大学牧医工程学院河南郑州450002 北京化工大学国际教育学院北京1022002 河南省动物性食品安全重点实验室河南郑州450002

为制备携肠球菌胶原蛋白黏附素Ace抗原表位的铁蛋白纳米颗粒,并评价其免疫效果,利用生物信息学软件预测Ace抗原表位,合成相应的基因片段,分别构建含有相应抗原表位基因与铁蛋白H亚基基因的融合表达载体,同时构建融合表达Ace蛋白和H亚基... 详细信息

为制备携肠球菌胶原蛋白黏附素Ace抗原表位的铁蛋白纳米颗粒,并评价其免疫效果,利用生物信息学软件预测Ace抗原表位,合成相应的基因片段,分别构建含有相应抗原表位基因与铁蛋白H亚基基因的融合表达载体,同时构建融合表达Ace蛋白和H亚基的质粒pET-32a-ace-H,分别转入大肠杆菌中进行融合表达。利用Western blot鉴定各重组融合蛋白的反应原性,并利用透射电镜观察目的蛋白表征。用重组铁蛋白纳米颗粒分别制备免疫原进行家兔接种试验,并定期检测家兔血清特异性抗体水平。结果显示,正确构建了6个Ace蛋白抗原表位基因与H亚基基因的融合表达载体pET-32a-ace1-H^pET-32a-ace6-H,其中pET-32a-ace1-H、pET-32a-ace3-H、pET-32a-ace5-H和pET-32a-ace6-H为可溶性表达载体。Western blot检测显示可溶性表达的4种融合蛋白均具有较好的反应原性。透射电镜图像显示,4种融合蛋白均形成了具有中空结构的铁蛋白纳米笼,其直径与天然铁蛋白类似;而融合蛋白Ace-H纳米笼没有中空结构,且直径比天然铁蛋白大。家兔免疫试验结果显示,6种融合蛋白均在家兔体内诱导产生了特异性抗体,而且,携带单个Ace表位的铁蛋白纳米颗粒Ace1-H、Ace3-H、Ace5-H与携带多表位的Ace重组蛋白以及Ace-H纳米颗粒相比,其诱导的抗体效价和消长规律均一致,其中以铁蛋白纳米粒Ace5-H的免疫效果为最佳。本研究结果表明铁蛋白纳米颗粒能有效增强蛋白质抗原的免疫原性,有望作为候选表位疫苗佐剂得到应用。

关键词：粪肠球菌胶原蛋白黏附素铁蛋白纳米颗粒表位疫苗

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动物源粪肠球菌的遗传关系分析

农业科学 2017年第2期7卷 140-146页

作者：赵娣段志刚崔新格闫瑞杰陈飞李滨洲胡慧王亚宾河南农业大学牧医工程学院河南郑州郑州市畜牧局河南郑州

目的:为了探讨不同动物来源中粪肠球菌(E.faecais)菌株之间的遗传关系。方法:利用PCR技术对59株不同来源粪肠球菌的7个管家基因gdh、gyd、pstS、gki、aroE、xpt、yiqL分别进行扩增测序,根据测序结果,利用多位点序列分型技术(Multilocus ... 详细信息

目的:为了探讨不同动物来源中粪肠球菌(E.faecais)菌株之间的遗传关系。方法:利用PCR技术对59株不同来源粪肠球菌的7个管家基因gdh、gyd、pstS、gki、aroE、xpt、yiqL分别进行扩增测序,根据测序结果,利用多位点序列分型技术(Multilocus Sequence Typing, MLST)进行分析、比对。结果:59株不同来源粪肠球菌被分成了27个序列型(Sequence type, ST),其中,主要流行序列型是ST-16 (占16.9%),其次是ST-163 (占6.8%)、ST-238 (占6.8%)和ST-631 (占6.8%),而与医院内感染密切相关的ST-16序列型,广泛分布在除熟食食品和羊粪外的其它5种来源中。另外,猪和蜂猴的粪便中分别含有7种序列型,且均有ST-16序列型。结论:多种动物来源中均含有感染人的粪肠球菌序列型,这也为粪肠球菌致病机理研究奠定了基础。

关键词：粪肠球菌多位点序列分析管家基因序列型(ST)

生鲜肉肠道病原菌检验中HE和EMB培养基上干扰菌的分离鉴定

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生鲜肉肠道病原菌检验中HE和EMB培养基上干扰菌的分离鉴定

中国毒理学会兽医毒理学委员会与中国畜牧兽医学会兽医食品...

作者：李滨洲陈飞何春昊郭珍珍吴秋玲金钺王亚宾陈丽颖河南农业大学

【目的】在对生鲜猪肉中大肠杆菌和沙门氏菌的常规检验中,常用肠道菌培养基HE和EMB琼脂平板上常会出现一些生长良好、菌落特性与目的菌高度相似的可疑菌。因此,有必要通过多种方法进行鉴别/鉴定,以排除其对目标菌株检测的干扰。【方法... 详细信息

【目的】在对生鲜猪肉中大肠杆菌和沙门氏菌的常规检验中,常用肠道菌培养基HE和EMB琼脂平板上常会出现一些生长良好、菌落特性与目的菌高度相似的可疑菌。因此,有必要通过多种方法进行鉴别/鉴定,以排除其对目标菌株检测的干扰。【方法】在郑州市不同地区的综合性超市和冷鲜肉专卖店分批次采集164份生鲜猪肉样品,按照国标方法进行增菌培养,并使用沙门氏菌选择性培养基HE和大肠杆菌鉴别性培养基EMB对细菌进行分离纯化。观察菌落形态并挑取生长良好的菌落接种于5ml的LB液体培养基中,在37℃摇床上进行恒温培养14h。将纯培养菌划线于普通营养琼脂平板上,挑取单个菌落,用生理盐水稀释后涂片,革兰氏染色并镜检。然后,通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术对将疑似菌单个菌落进行鉴定,经电离解析飞行时间质谱得出菌株图谱,与数据库里标准菌株质谱图进行比对分析,得出鉴定结果。同时,提取被检菌株基因组DNA,根据MALDI-TOF-MS得出的指示菌株,依据GenBank中相关菌株的部分已知序列,分别设计引物,进行PCR扩增,回收纯化PCR产物并送上海生工生物科技有限公司测序,根据测序结果与GenBank上已知序列进行比对,以验证MALDI-TOF-MS鉴定结果。【结果】经与质谱标准菌株数据库匹配,通过MALDI-TOF-MS方法从68个待检菌株中检出柠檬酸杆菌(Citrobacter)6株、奇异杆菌(Proteobacteria)5株、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)9株、绿脓杆菌(Pseudomonasaeruginosa)1株、阴沟肠杆菌(Enterobactercloacae)1株、不动杆菌(Acinetobacter)1株。PCR引物序列分别针对上述6种细菌的特有基因(Idh、ureR、phoE、AmpC、rpoB及Lasl基因),经PCR扩增、1%琼脂糖凝胶电泳和PCR产物测序,分别有9个菌株扩增出柠檬酸杆菌Idh基因(586bp),5株扩增出奇异杆菌ureR基因(374bp),扩增出肺炎克雷伯氏菌phoE基因(369bp)的有11株,具有阴沟肠杆菌AmpC基因(476bp)的为3株,而扩增出不动杆菌rpoB基因(408bp)的为1株,绿脓杆菌LasI基因(600bp)1株。将测序结果与GenBank中收录的各菌株的特异性核苷酸序列比对,柠檬酸杆菌同源性为99.3%8,1%,奇异杆菌同源性为99.4%7.7%,肺炎克雷伯氏菌同源性为99.4%7.7%,阴沟肠杆菌同源性为99.5%9.3%,不动杆菌同源性为99.6%8,2%,绿脓杆菌同源性为99.8%9.3%。PCR鉴定结果与飞行时间质谱鉴定结果一致。【结论】经MALDI-TOF-MS技术与PCR技术检测,在生鲜肉食品中均检验出了6种在HE和EMB培养基上与沙门氏菌/大肠杆菌菌落特征类似的肠杆菌科其他细菌,这些细菌多属于条件性致病菌,其中,奇异变形杆菌、肺炎克雷伯氏菌等近年来引起人和动物感染的报道不断增多。由此可见,条件致病性肠道细菌在生鲜猪肉中存在着一定程度的污染,有可能会威胁到人体健康,应当对相应的食品安全风险给予重视。

关键词：生鲜肉飞行时间质谱条件致病菌肠道病原菌

来源： cnki会议评论

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猪源铁蛋白重链亚基纳米粒的制备

河南农业大学学报 2018年第3期52卷 361-365页

作者：李滨洲和春昊吴秋玲郭珍珍张留君杨国宇王亚宾陈丽颖河南农业大学牧医工程学院河南郑州450002 河南省动物性食品安全重点实验室河南郑州450002

根据Gen Bank公布的铁蛋白重链基因序列,设计出1对特异性引物;提取猪心脏总RNA,采用RT-PCR方法扩增出铁蛋白重链亚基基因片段,经测序正确后,再将双酶切的纯化产物与PET32a原核表达载体相连接,构建重组质粒、把测序正确的重组质粒转化入... 详细信息

根据Gen Bank公布的铁蛋白重链基因序列,设计出1对特异性引物;提取猪心脏总RNA,采用RT-PCR方法扩增出铁蛋白重链亚基基因片段,经测序正确后,再将双酶切的纯化产物与PET32a原核表达载体相连接,构建重组质粒、把测序正确的重组质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3),用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达。将表达的重组蛋白用Ni^+离子亲和层析柱纯化后,用SDS-PAGE和Western blot鉴定纯化的表达产物。将鉴定正确的铁蛋白产物置于透射电镜下观察其表征,以进一步鉴定铁蛋白纳米颗粒是否自组装成功。结果表明,本研究成功表达并纯化出了猪源铁蛋白重链亚基,而透射电镜下观察到了大量直径为10~13 nm的颗粒,说明重组猪源铁蛋白重链纳米粒自组装成功。

关键词：猪铁蛋白纳米粒免疫佐剂

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术分离鉴定生鲜猪肉中沙门氏菌/大肠杆菌类似菌

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食品安全质量检测学报 2018年第4期9卷 717-722页

作者：李滨洲陈飞郭珍珍和春昊吴秋玲金钺王亚宾陈丽颖河南农业大学牧医工程学院郑州450002 河南省动物性食品安全重点实验室郑州450002

目的利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)技术鉴别生鲜猪肉中大肠杆菌和沙门氏菌的常规检验中出现的类似菌。方法在郑州市不同地区分... 详细信息

目的利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)技术鉴别生鲜猪肉中大肠杆菌和沙门氏菌的常规检验中出现的类似菌。方法在郑州市不同地区分批次采集164份生鲜猪肉样品,按照国标方法进行增菌培养,选择性培养基HE和EMB对细菌进行分离纯化。通过MALDI-TOF-MS技术对疑似菌落进行鉴定;提取被检菌株基因组DNA,根据MALDI-TOF-MS鉴定出的细菌种类,参考Gen Bank中相关菌株的已知基因序列分别设计引物,进行PCR扩增、测序和序列比对,以验证MALDI-TOF-MS鉴定结果。结果经MALDI-TOF-MS方法鉴定,从68个疑似菌株中分别检出柠檬酸杆菌(Citrobacter)6株、奇异变形杆菌(Proteobacteria)5株、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)9株、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)1株、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)3株、不动杆菌(Acinetobacter)1株。PCR结果与MALDI-TOF-MS鉴定结果完全一致。结论 MALDI-TOF-MS可用于生鲜猪肉检验过程中大肠杆菌和沙门氏菌的分离鉴定。本次共检出6种在HE和EMB培养基上与沙门氏菌/大肠杆菌菌落特征类似的肠杆菌科其他细菌,说明在生鲜猪肉中存在着一定程度的条件致病性肠道细菌污染,因此具有一定的食品安全风险。

关键词：生鲜肉基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法条件致病菌肠道病原菌

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市场鸡沙门氏菌分离鉴定及致病性研究

山东畜牧兽医 2024年第3期45卷 9-11页

作者：陈小娇张妹蔡晓庆康翠翠郝再翠毛东有李滨洲王全武陈文平北京市华都峪口禽业有限责任公司北京平谷101206 国家蛋鸡产业技术体系平谷综合试验站北京平谷

为了研究不同沙门氏菌对雏鸡致病性的强弱以及不同药物敏感性情况,本试验对送检的病料进行病原分离鉴定,同时进行1日龄雏鸡致病性试验和药物敏感性试验。结果表明,分离菌为3种不同沙门氏菌,3种菌株在同时间内导致雏鸡不同程度的死亡,其... 详细信息

为了研究不同沙门氏菌对雏鸡致病性的强弱以及不同药物敏感性情况,本试验对送检的病料进行病原分离鉴定,同时进行1日龄雏鸡致病性试验和药物敏感性试验。结果表明,分离菌为3种不同沙门氏菌,3种菌株在同时间内导致雏鸡不同程度的死亡,其中鸡白痢标准菌株致病力强,死亡速度快;同时3种菌株均对丁胺卡那、林可霉素类抗生素药物敏感,对氧氟沙星耐药。本研究为临床诊断沙门氏菌导致的雏鸡症状提供了理论依据,同时为筛选沙门氏菌病有效药物提供参考。

关键词：沙门氏菌鸡致病性药物敏感性