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CRISPR/Cas9技术在构建荧光标记柔嫩艾美耳球虫β-微管蛋白敲入虫株上的应用

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中国兽医科学 2024年第6期54卷 742-748页

作者：肖琴曲自刚李文卉张念章孙晓林付宝权甘肃农业大学动物医学院甘肃兰州730070 中国农业科学院、兰州兽医研究所、动物疫病防控全国重点实验室甘肃兰州730046 江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心江苏扬州225009

为评价弓形虫CRISPR/Cas9质粒在柔嫩艾美耳球虫基因敲入中的应用,以柔嫩艾美耳球虫Etβ-tubulin为目标基因,根据Etβ-tubulin基因序列设计向导RNA(g RNA),构建含g RNA的基因编辑质粒及含有目标基因和m Cherry基因的同源重组质粒;将含g ... 详细信息

为评价弓形虫CRISPR/Cas9质粒在柔嫩艾美耳球虫基因敲入中的应用,以柔嫩艾美耳球虫Etβ-tubulin为目标基因,根据Etβ-tubulin基因序列设计向导RNA(g RNA),构建含g RNA的基因编辑质粒及含有目标基因和m Cherry基因的同源重组质粒;将含g RNA的基因编辑质粒和含有目标基因、DHFR基因和m Cherry基因的同源重组质粒共同转染柔嫩艾美耳球虫子孢子,将转染后的子孢子接种雏鸡泄殖腔,并在饲料中添加乙胺嘧啶进行筛选,得到表达外源荧光蛋白的标记球虫虫株。挑取单卵囊进行扩繁,并通过PCR和荧光检测方法分别从基因水平和蛋白水平上对标记虫株进行了鉴定。结果显示通过单卵囊筛选和鉴定,成功获得了1株荧光标记β-微管蛋白的柔嫩艾美耳球虫虫株。结果表明,CRISPR/Cas9技术可应用到柔嫩艾美耳球虫的基因敲入研究,同时也为进一步研究Etβ-tubulin在虫体中的功能奠定了基础。

关键词：柔嫩艾美耳球虫 CRISPR/Cas9 基因敲入 β-tubulin

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双金属氧化物负载的凹凸棒石基催化剂的制备及催化性能研究

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双金属氧化物负载的凹凸棒石基催化剂的制备及催化性能研究

作者：李文卉兰州理工大学

学位级别：硕士

本文以氧化石墨烯(GO)改性后的凹凸棒石(ATP)为载体,以多种金属氧化物为活性物质,采用水热法制备了两种复合催化剂:FeO-Cu O/r GO-ATP与FeO-CoO/r GO-ATP,以亚甲基蓝(MB)与四环素(TC)为目标污染物。研究了这两种催化剂的催化性能。研究... 详细信息

本文以氧化石墨烯(GO)改性后的凹凸棒石(ATP)为载体,以多种金属氧化物为活性物质,采用水热法制备了两种复合催化剂:FeO-Cu O/r GO-ATP与FeO-CoO/r GO-ATP,以亚甲基蓝(MB)与四环素(TC)为目标污染物。研究了这两种催化剂的催化性能。研究内容主要有以下三方面:(1)通过改进的Hummers法制备出GO,与凹凸棒石混合得到复合载体,采用水热法制备出复合催化剂FeO-Cu O/r GO-ATP,采用SEM、FT-IR、XRD、XPS、Raman、BET六种手段表征了该复合材料的组成、结构、形态。采用单因素控制变量法研究了催化剂的催化性能,考察了其重复利用性及处理过程中溶液吸收光谱的变化,并且确定了动力学模型。实验结果表明,该催化剂降解TC的最佳反应条件是温度为60℃、催化剂用量为1 g/L、p H为8、转速为10 r/min、曝气强度为1 L/min、溶液初始浓度为50 mg/L,此条件下TC降解率高达94.51%。该催化剂降解MB的最佳反应条件是温度为60℃、催化剂用量为1 g/L、p H为10、转速为20 r/min、曝气强度为1 L/min、溶液初始浓度为50 mg/L,此条件下MB降解率高达99.87%。重复利用实验结果表明,该催化剂有良好的循环应用性。降解不同时刻吸收光谱变化结果表明,随着反应的进行,两种有机物特征峰均逐渐减弱,表明大分子结构已被破坏。通过动力学研究发现,两种污染物的降解都更符合二级动力学模型。(2)采用一步水热法将双金属氧化物FeO与CoO负载于r GO-ATP载体上,制备出复合催化剂FeO-CoO/r GO-ATP,采用SEM、FT-IR、XRD、XPS、BET五种手段进行表征,结果表明,金属氧化物成功负载在载体表面。采用单因素控制变量法研究了催化剂的催化性能,分析了其循环利用性,考察了降解过程不同时刻溶液吸收光谱的变化,并确定了降解动力学模型。结果表明,该催化剂降解TC的最佳反应条件是温度为60℃、催化剂用量为0.8 g/L、p H为7、转速为10 r/min、曝气强度为1 L/min、溶液初始浓度为50 mg/L,此条件下TC降解率为94.06%。该催化剂降解MB的最佳反应条件是温度为60℃、催化剂用量为1 g/L、p H为8、转速为20 r/min、曝气强度为0.6 L/min、溶液初始浓度为100mg/L,此条件下MB的降解率高达98.38%。通过多次使用发现,该催化剂具有良好的重复利用性。降解不同时刻吸收光谱变化结果表明,随着反应的进行,两种污染物的特征峰逐渐减弱,表明大分子结构已被破坏。通过动力学研究发现,两种污染物的降解均更加符合二级动力学模型。(3)探究了催化剂FeO-CoO/r GO-ATP对两种污染物的降解机理,研究发现,该体系中起主导作用的是空穴电子,超氧自由基属于次要物种;由LC-MS的测定结果,推测了TC与MB两种污染物的降解中间产物及可能的路径。

关键词：凹凸棒石氧化石墨烯亚甲基蓝四环素降解机理

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棘球绦虫终末宿主粪样检测方法研究进展

动物医学进展 2022年第7期43卷 83-89页

作者：李敏李立李文卉贾万忠闫鸿斌中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室甘肃兰州730046 江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心江苏扬州225009

犬科动物作为棘球绦虫的重要终末宿主,在棘球蚴病的传播和流行中扮演非常重要的角色。感染了棘球绦虫的犬科动物,其排出的粪便含有大量孕卵节片或虫卵,从而导致棘球蚴病的传播。因此,流行区终末宿主棘球绦虫感染情况的检测是棘球蚴病防... 详细信息

犬科动物作为棘球绦虫的重要终末宿主,在棘球蚴病的传播和流行中扮演非常重要的角色。感染了棘球绦虫的犬科动物,其排出的粪便含有大量孕卵节片或虫卵,从而导致棘球蚴病的传播。因此,流行区终末宿主棘球绦虫感染情况的检测是棘球蚴病防控的重要环节之一,对该病的防控具有重要意义。近年来,传统的病原学检查技术逐渐被免疫学及分子生物学等技术替代,主要有粪抗原ELISA法和粪DNA检测法(PCR、实时荧光PCR、LAMP等)。论文对不同的粪抗原和粪DNA检测方法做一综述,为棘球绦虫终末宿主检测方法的选择提供参考。

关键词：棘球蚴病终末宿主粪抗原-ELISA 粪DNA-PCR

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四川西部小檗属3种植物分类学特征观察及变异式样研究

1981年

作者：李文卉编绘

来源：汇雅图书（南通市图书馆... 评论

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四川西部小檗属3种植物分类学特征观察及变异式样研究

作者：李文卉南京农业大学

学位级别：硕士

于2013年11月至2015年11月,在四川省宝兴县和康定县,通过野外调查与居群取样,结合标本观察,及统计学分析方法,研究了疣枝小檗(Berberis verruculosa)、宝兴小檗(***)和刺红珠(***)的叶、花部和果实等主要性状特征的变异式样,并对这3种... 详细信息

于2013年11月至2015年11月,在四川省宝兴县和康定县,通过野外调查与居群取样,结合标本观察,及统计学分析方法,研究了疣枝小檗(Berberis verruculosa)、宝兴小檗(***)和刺红珠(***)的叶、花部和果实等主要性状特征的变异式样,并对这3种植物的分类学特征进行了观察。主要研究结果如下:1.对疣枝小檗的重要分类学性状特征进行修订与补充,17株疣枝小檗330个叶片的叶缘刺齿数为1～11,平均为3.72± 1.33个,10株植株上的花序类型为单生或2～4簇生,平均为1.45 ±0.69个,170个子房内胚珠数目为2～7,平均为4.17±0.86枚,以上特征分别与《中国植物志》记载“叶缘具2～4刺齿”、“花单生”以及“胚珠4～6枚”有所差异。《中国植物志》中缺乏疣枝小檗的果实颜色与种子数目资料,结果显示其成熟果实呈紫黑色至黑色,8株植株中150个果实内种子数目为1～7,平均为3.07± 1.59粒。2.宝兴小檗是疣枝小檗和血红小檗的自然杂交新种,该种枝条具柱状皮孔这一特殊性状特征与疣枝小檗相似,但区别在于宝兴小檗叶片较长,为1.1～5.1 cm,平均为2.8±0.79cm,叶背面不被白粉,外萼片紫红色,果实表面不被白粉;本种花2色的特殊性状特征与血红小檗相似,但区别在于宝兴小檗的叶片较宽,叶宽为0.3～1.4cm,平均为1.79 ±0.22 cm,枝条棕黄色,近圆柱形,并具柱状皮孔。对宝兴小檗主要分类学性状特征的变异系数进行研究,发现花部的大部分性状特征相对比较稳定,如花被片数目、内萼片长度和宽度、花瓣长度和宽度以及雄蕊长度的变异系数均小于等于0.1。3.对刺红珠的重要分类学性状特征进行修订与补充,13株刺红珠的250个叶片中,有119片叶缘具1～12刺齿,平均为1.89±2.67。110个花序中,花单生或2～3簇生;7株植株202个花瓣的先端全部为缺裂,5株植株105个子房内胚珠数目为3～7枚。以上特征分别与《中国植物志》记载“叶片全缘”、“花单生”、“花瓣先端全缘”以及“胚珠3～4枚”较大差异。《中国植物志》缺乏刺红珠果实内种子数目资料,结果显示,60个果实内种子数目为1～6,平均为2.81 ± 1.36粒。4.利用光学显微镜和扫描电子显微镜对疣枝小檗、宝兴小檗和刺红珠的花粉进行观察,后两者为首次研究。结果显示三种植物花粉均为近球形,极轴长42.13～60.93 μm,平均为 50.48 ± 4.95 μm,赤道轴长 40.63～56.74 μm,平均为 47.40 ± 4.04 μm;花粉表面具螺旋状萌发沟,沟宽为1.32～3.85μm,平均为2.21±0.56μm,并且萌发沟内具脊状突起及颗粒物质;花粉外壁纹饰为点穴状,外壁厚1.56～2.98μm,平均为2.14 ±0.29μm。3种植物花粉在形态特征上具有较高的相似性。5.国内首次报道了刺红珠和疣枝小檗的染色体数目,两者均为二倍体,染色体数目为2n=28。6.首次对刺红珠和疣枝小檗种子的萌发条件进行探究,结果显示在黑暗,20℃(12h)/25℃(12h),湿度为70%,培养介质为纱布的条件下,疣枝小檗种子的萌发率为64%,萌滞期为14 d,萌发持续时间为20 d。刺红珠种子的萌发率为61%,萌滞期为16 d,萌发持续时间为41 d,为小檗属植物播种育苗条件提供参考。疣枝小檗幼苗时期的真叶为卵形,革质,叶背面被白粉,边缘具5～6刺齿。刺红珠幼苗时期的真叶为近圆形,厚纸质,叶背面被白粉,边缘具5～6刺齿。通过观察植物幼苗期的真叶形态不能识别植物种类。

关键词：宝兴小檗刺红珠疣枝小檗野外调查分类学特征变异式样

微小牛蜱Bm86基因的克隆、真核表达及cDNA文库的构建

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微小牛蜱Bm86基因的克隆、真核表达及cDNA文库的构建

作者：李文卉甘肃农业大学

学位级别：硕士

以微小牛蜱饥饿幼蜱为材料,提取总RNA,采用RT-PCR技术扩增了微小牛蜱Bm86基因,并将其与真核表达载体pPIC9K进行重组;电转化毕赤酵母后,用0.5%甲醇进行诱导表达,通过SDS-PAGE和Westernblot方法对培养上清中的表达产物进行分析。结果表明... 详细信息

以微小牛蜱饥饿幼蜱为材料,提取总RNA,采用RT-PCR技术扩增了微小牛蜱Bm86基因,并将其与真核表达载体pPIC9K进行重组;电转化毕赤酵母后,用0.5%甲醇进行诱导表达,通过SDS-PAGE和Westernblot方法对培养上清中的表达产物进行分析。结果表明:本试验自从微小牛蜱中成功克隆了Bm86基因,它与自GenBank上下载的国外发表的Bm86基因的同源性达97.4%,并构建了真核表达载体pPIC9K-Bm86,转化后经PCR证实目的基因已整合到毕赤酵母染色体中。通过甲醇诱导,重组菌株高效地分泌表达了Bm86蛋白,表达浓度为0.36mg/mL,占分泌总蛋白质的32%。经初步纯化,对表达产物的性质鉴定表明,其分子量约为68KD,具有免疫活性。该研究为大量获得重组Bm86蛋白,研制微小牛蜱分子疫苗奠定基础。　为了自微小牛蜱获得新的免疫相关基因,构建了微小牛蜱cDNA文库。从微小牛蜱幼蜱研磨物中提取总RNA,并分离纯化mRNA,采用oligo(dT)引物合成双链cDNA,接着在其两端加EcoRⅠ/Hind　Ⅲ定向接头;然后将所产生的cDNA分子用Mini Column Fractionation　凝胶过滤柱纯化后定向克隆到λSCREEN载体的EcoRⅠ和HindⅢ的双酶切位点之间,体外包装后得到我国微小牛蜱幼虫cDNA文库。经测定,所构建的表达文库的容量为4.5×105pfu/ml,扩增后的文库库容量为7.2×1010pfu/ml,重组率为97%,这说明所构建微小牛蜱幼虫cDNA表达文库库容量大、重组率高,为进一步分离其功能性抗原基因奠定基础。

关键词：微小牛蜱 Bm86基因表达毕赤酵母 cDNA表达文库构建

多头带绦虫成虫和幼虫的iTRAQ蛋白质组学分析

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作者：李文卉编绘

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中国人兽共患病学报 2022年第12期38卷 1051-1056页

作者：李文卉王建魁张念章曲自刚刘垠鞠贾万忠付宝权中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室兰州730046 甘肃省兰州市七里河区动物疫病预防与控制中心兰州730050 江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心扬州225009

目的分析多头带绦虫成虫和幼虫样本中的差异蛋白定量结果,为筛选调节寄生虫发育和生长的特定蛋白奠定基础。方法提取多头带绦虫成虫与脑多头蚴原头节蛋白质样本进行SDS-PAGE电泳分析后,采用同位素标记相对与绝对定量技术(iTRAQ)技术和... 详细信息

目的分析多头带绦虫成虫和幼虫样本中的差异蛋白定量结果,为筛选调节寄生虫发育和生长的特定蛋白奠定基础。方法提取多头带绦虫成虫与脑多头蚴原头节蛋白质样本进行SDS-PAGE电泳分析后,采用同位素标记相对与绝对定量技术(iTRAQ)技术和液相串联质谱(LC-MS/MS)分析,当两种样品蛋白的差异倍数达到1.5倍以上,且经检验有统计学意义时,视为差异蛋白。结果本研究共鉴定了684个蛋白,其中130个差异表达蛋白,相对于幼虫,成虫上调蛋白69个,分别为副肌球蛋白,果糖-1,6-二磷酸酶,钙结合蛋白,六钩蚴蛋白Tso22c,热休克蛋白70,8 kDa糖蛋白,肌球蛋白轻链,钙调蛋白等;成虫下调蛋白61个,分别是抗原cC1,钙蛋白酶,膜联蛋白B3,皮层蛋白,糖脂转移蛋白,微管相关蛋白,乳酸脱氢酶B,xpa-结合蛋白等。通过实时定量PCR验证了10个差异明显的蛋白。另外,差异蛋白路径注释中约30%的蛋白参与了代谢途径和次生代谢物的生物合成。结论本研究为多头带绦虫发育、生活史及寄生虫-宿主的互作机制研究提供了基线资料。

关键词：多头带绦虫脑多头蚴蛋白质组学 iTRAQ技术液相色谱串联质谱

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脑多头蚴病研究进展

动物医学进展 2010年第10期31卷 87-91页

作者：李文卉付宝权中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部兽医公共卫生重点开放实验室甘肃省动物寄生虫病重点实验室甘肃兰州730046

脑多头蚴病是由多头带绦虫的中绦期幼虫脑多头蚴寄生于绵羊、山羊、黄牛、牦牛等有蹄动物的脑及脊髓中引起的一种人兽共患寄生虫病,人可因误食虫卵而感染此病。该病在宿主出现典型临床症状后如果得不到治疗,多以死亡为转归,给畜牧业生... 详细信息

脑多头蚴病是由多头带绦虫的中绦期幼虫脑多头蚴寄生于绵羊、山羊、黄牛、牦牛等有蹄动物的脑及脊髓中引起的一种人兽共患寄生虫病,人可因误食虫卵而感染此病。该病在宿主出现典型临床症状后如果得不到治疗,多以死亡为转归,给畜牧业生产造成了巨大的经济损失。论文就脑多头蚴病的病原学、生活史、流行病学、临床症状、诊断、治疗及免疫预防等方面的研究进展进行了综述。

关键词：脑多头蚴病多头带绦虫脑多头蚴