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组织蛋白酶B基因敲除抑制布鲁菌胞内感染

军事医学 2024年第5期48卷 362-368页

作者：陆菁菁许荷玲张琦黄芳李山虎军事科学院军事医学研究院北京100850

目的研究组织蛋白酶B(cathepsin B,CTSB)在布鲁菌感染中的作用。方法利用CRISPR/Cas9技术构建ctsb基因敲除的人宫颈癌HeLa细胞株,并检测ctsb敲除对细胞增殖的影响。通过CCK-8法和胞内菌计数检测布鲁菌感染中ctsb敲除对细胞增殖活性和细... 详细信息

目的研究组织蛋白酶B(cathepsin B,CTSB)在布鲁菌感染中的作用。方法利用CRISPR/Cas9技术构建ctsb基因敲除的人宫颈癌HeLa细胞株,并检测ctsb敲除对细胞增殖的影响。通过CCK-8法和胞内菌计数检测布鲁菌感染中ctsb敲除对细胞增殖活性和细菌胞内存活的影响,并通过Western印迹检测揭示ctsb调控布鲁菌感染的分子机制。结果成功构建了ctsb基因敲除细胞株;CCK-8结果表明敲除ctsb不影响布鲁菌感染前后的细胞增殖率;胞内菌计数结果显示KO细胞感染4 d后胞内布鲁菌数量显著减少;Western印迹检测结果提示KO细胞在布鲁菌长期感染中自噬相关蛋白表达水平显著下调。结论ctsb基因敲除能够抑制长期感染中布鲁菌的胞内存活,为慢性布鲁菌病的治疗提供了潜在的靶点。

关键词：布鲁菌组织蛋白酶B 自噬 CRISPR/Cas9基因编辑

表达HPV16 E7基因的重组腺病毒质粒的构建及鉴定

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国际病毒学杂志 2024年第1期31卷 22-27页

作者：邵云亭楼张蓉符军李山虎黄芳王芃吴成君大连理工大学医学部基础医学院 116024 山东大学微生物技术国家重点实验室济南250100 军事医学研究院生物工程研究所北京100850

目的构建表达HPV16E7基因的重组腺病毒质粒.方法设计携带酶切位点和无酶切位点的两对引物以扩增ccdBKan目的片段.分别将ccdBKan与质粒pBR322-Ad4-eGFP共转至电转感受态GB08red-gyr462构建两种表达ccdBKan基因的重组Ad4质粒.利用ccdB正... 详细信息

目的构建表达HPV16E7基因的重组腺病毒质粒.方法设计携带酶切位点和无酶切位点的两对引物以扩增ccdBKan目的片段.分别将ccdBKan与质粒pBR322-Ad4-eGFP共转至电转感受态GB08red-gyr462构建两种表达ccdBKan基因的重组Ad4质粒.利用ccdB正反筛选系统与ExoCET/Red重组结合将HPV16E7基因插入Ad4的E1A区,构建表达HPV16 E7基因的重组腺病毒质粒pBR322-Ad4-E 1 Amut-C16E7P,经酶切、测序验证.提取质粒pBR322-Ad4-EIAmut-C 16E7P释放基因组,转染293T细胞以包装和扩增病毒,用病毒感染293T细胞,检测HPV16E7基因在细胞内的转录水平和蛋白表达.重组病毒经肌肉接种BALB/C裸鼠,收集小鼠血清用于病毒中和实验.结果成功构建表达HPV16 E7基因的重组腺病毒质粒,并在293T细胞中成功包装出重组病毒.qRT-PCR和Western blotting验证了重组病毒HPV16 E7基因的成功表达,病毒中和实验结果提示经重组病毒免疫后的小鼠血清能够中和Ad4-HPV16E7.结论成功构建了表达HPV16E7基因的重组腺病毒株,为进一步研究HPV16 E7在癌症发病机制中的作用以及HPV感染相关癌症的治疗方法提供新的思路和依据,并且可能为HPV治疗性疫苗的研究探索提供了一种潜在策略.

关键词： HPV16 E7基因腺病毒重组病毒

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轴向运动悬臂梁的独立模态振动控制——Ⅰ近似理论分析

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应用力学学报 2002年第1期19卷 35-38页

作者：李山虎杨靖波黄清华陈德成北京大学北京100871

利用Euler Bernoulli梁理论并在低速轴向运动假设的基础上 ,对伸展悬臂梁的独立模态振动控制进行了理论近似解的推导 ,为数值仿真计算结果提供了一定意义下的对照参考模型。

关键词：悬臂梁轴向运动独立模态控制多尺度方法数值仿真近似理论

简谐及随机激励下柔性悬臂梁振动主动控制的实验研究

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振动与冲击 2001年第3期20卷 1-4,15页

作者：李山虎杨靖波黄清华陈德成北京大学力学与工程科学系北京100871

利用压电陶瓷作为传感器 ,对根部施加了简谐、随机激励的柔性悬臂梁的振动主动控制进行实验研究。在使用数字滤波器的基础上 ,实现了对前两阶模态的控制 ,效果明显。比较了应变率负反馈和应变正反馈控制律的控制效果。

关键词：振动主动控制压电陶瓷数字滤波 SIMO控制柔性结构控制律柔性悬臂梁简谐激励随机激励飞行器

负载型氧化铁吸附剂的制备及对五氯苯酚作用研究

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负载型氧化铁吸附剂的制备及对五氯苯酚作用研究

作者：李山虎武汉理工大学

学位级别：硕士

五氯苯酚(Pentachlorophenol，简写PCP)作为杀虫剂、防腐剂而被广泛应用，鉴于其在水环境和土壤中分布的广泛性以及对人类和环境的持久性、高毒性危害，已成为全球性的环境污染物之一。目前对PCP的主要处理方法有：生物方法、芬顿试剂... 详细信息

五氯苯酚(Pentachlorophenol，简写PCP)作为杀虫剂、防腐剂而被广泛应用，鉴于其在水环境和土壤中分布的广泛性以及对人类和环境的持久性、高毒性危害，已成为全球性的环境污染物之一。目前对PCP的主要处理方法有：生物方法、芬顿试剂法、光化学、电化学、臭氧处理、超声波及金属催化氧化等处理方法。这些方法各有优缺点，国内外学者研究的也较多，然而对于矿物材料在含PCP废水中的应用研究较少。铁(氢)氧化物矿物在地表土壤和水体沉积物中分布广泛，比表面积巨大，表面氧化还原活性高，以及电子输运能力强，因此铁矿物与PCP的表面作用对PCP的地球化学循环、环境效应起着重要的控制作用。其中尤以赤铁矿(α=FeO)对PCP作用最为显著。研究PCP与α-FeO的相互作用机理，对深入了解PCP在土壤和水体沉积物中的迁移、转化、降解及残留规律具有理论及实际意义。本论文选择五氯苯酚为研究对象，采用两种方法制备和负载α-FeO，研究了PCP与原位制备的α-FeO上的界面作用，并对不同条件下对界面作用的影响以及五氯苯酚与α-FeO之间的作用机制进行了研究。主要研究工作内容如下： 1、利用高温氧化法(原位生成)直接制备、负载α-FeO，采用陶瓷滤料负载制备α=FeO。通过X射线衍射、拉曼光谱、扫描电子显微镜等手段进行分析表征。结果显示：高温氧化法制备的α=FeO，不仅制备方法简单可行、α-FeO性状稳定，而且在抗酸碱能力、抗机械摩擦能力实验中，损失重量小，有效的解决了吸附剂难以固定的问题。 2、通过静态吸附实验，研究了PCP与α-FeO二者之间的吸附动力学、吸附等温线及pH对吸附的影响。实验结果表明：铁板原位生成α-FeO矿物对PCP的吸附在2．5h达到吸附和解吸动力学平衡，吸附动力学符合二级动力学;Freundlich吸附等温式可以较好的描述PCP在α-FeO上的吸附行为;α=FeO对PCP吸附的pH关系等温线是一峰型曲线，α-FeO吸附容量峰值出现在pH=6．0处。 3、通过α-FeO吸附前后的红外光谱图分析其吸附机理，结果表明：两者的吸附发生在赤铁矿表面;pH值6．0时，两者之间作用以静电吸附为主，氢键作用为辅;pH值8．5时，两者之间主要以氢键作用产生吸附。 4、研究了α-FeO的重复利用。采用两种方法处理吸附PCP后的α-FeO，结果表明：α-FeO的重复利用效果较好，将吸附PCP后的原位生成负载α-FeO经过600℃煅烧1 h后能够较好的获得再生，可以完全恢复α-FeO原有吸附性能。并且重复利用四次后α-FeO对PCP的吸附能力为首次吸附能力的98．9％。

关键词： α-Fe2O3 陶瓷滤料吸附 PCP

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攻击性驾驶行为评价方法研究

攻击性驾驶行为评价方法研究

作者：李山虎长安大学

学位级别：硕士

攻击性驾驶行为是指有意识的对驾驶环境中他人进行身体、心理或情感伤害的行为。它的产生是由多种原因造成的,如驾驶员个体性格、工作压力大、生活不顺心和生活环境恶劣等都可能会引发车辆驾驶中的攻击性行为。攻击性驾驶行为在道路交... 详细信息

攻击性驾驶行为是指有意识的对驾驶环境中他人进行身体、心理或情感伤害的行为。它的产生是由多种原因造成的,如驾驶员个体性格、工作压力大、生活不顺心和生活环境恶劣等都可能会引发车辆驾驶中的攻击性行为。攻击性驾驶行为在道路交通中的主要表现有跟车距离太近、超速、咒骂、违章驾驶、阻止他人超车等。研究表明,攻击性驾驶是引发交通事故的主要原因之一。本研究从驾驶人攻击性驾驶行为的表现角度出发,确定了速度控制行为、跟车驾驶行为、变换车道行为和不良驾驶行为四个指标作为攻击性驾驶行为的一级评价指标,使用层次分析法和专家调查问卷法对攻击性驾驶行为的评价指标进行了权重分析,得到了攻击性驾驶行为一级评价指标的权重值;从转向灯信号、方向盘信息、踏板信息、速度控制信息、跟车驾驶行为信息、变换车道行为信息和不良驾驶行为信息等方面提取了攻击性驾驶行为的二级评价指标,并依据试验和观察得到的基础数据,研究确定了具体二级评价指标的评价标准和分值。最后,结合三个驾驶人的城市道路驾驶试验数据,分析了驾驶过程中车辆操纵和车辆运动行为特征,并应用所建立的攻击性驾驶行为的评价方法,对三个驾驶人的驾驶行为攻击性进行了验证,结果表明这种攻击性驾驶行为的评价方法是比较合理的,具有可行性。

关键词：攻击性驾驶行为层次分析法评价方法表征指标应用实例

面向SMT工艺流程中的极性器件智能识别方法

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面向SMT工艺流程中的极性器件智能识别方法

作者：李山虎天津大学

学位级别：硕士

在表面安装技术（Surface-Mount Technology,SMT）工艺流程中有一种效率低下但极其重要的的自检防错机制,该机制需要检测人员以印刷电路板（Printed Circuit Board,PCB）的位号图为基准对生产的首个产品样板进行检测,重点是元器件的极... 详细信息

在表面安装技术（Surface-Mount Technology,SMT）工艺流程中有一种效率低下但极其重要的的自检防错机制,该机制需要检测人员以印刷电路板（Printed Circuit Board,PCB）的位号图为基准对生产的首个产品样板进行检测,重点是元器件的极性方向。在实际检测过程中,工作人员仅能在元器件数量较少的情况下进行有效检测。为了使检测人员能对产品样板实现更高效的检测,本文提出了一种基于深度学习理论的极性器件智能识别方法。首先对原始PCB工程位号图进行预处理,构建了PCB位号图数据集Bitmap＿dataset并通过二维旋转的方式进行了数据增强。通过分析对比Faster R-CNN、SSD、YOLOv3这三种在工程应用中经常使用的经典目标检测算法,并在本文首次构建的数据集Bitmap＿dataset上进行三种算法的性能对比实验,最终选用YOLOv3作为本次实际应用的基础算法并进行实际应用研究。为提高网络模型在位号图中检测极小元器件的能力,主要对原有YOLOv3网络做了两点改进,一是使用特征融合方法将网络深层的细粒度特征与浅层提取到的位置特征进行融合,二是通过使用K-means算法聚类分析本文数据集,选定了适合本数据集的锚框数量及尺寸大小,增加了模型收敛速度。本文对训练图像的输入分辨率进行了调整,优化了网络超参数,并得到用于极性器件检测的最佳网络模型。最终改进的网络模型在验证集上得到的AP值达到97.5%,进行多张实际工程位号图的测试的平均极性器件检出率可达95.13%,在此基础上,本文通过使用HTML、Javascripts以及Flask框架搭建了极性器件的智能在线检测系统,将实现的智能检测算法部署在该系统上,为生产人员提供了在线检测位号图中极性器件的平台,提高了SMT流程中自检防错机制的执行效率。

关键词：极性器件检测 PCB位号图数据集深度学习特征融合在线检测系统

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λ噬菌体N蛋白介导的调控机理及靶位点研究

λ噬菌体N蛋白介导的调控机理及靶位点研究

作者：李山虎沈阳药科大学

学位级别：硕士

为了研究λ噬菌体左向PL操纵子表达调控机理，研究N蛋白介导的转录调控因子与boxA靶位点的关系。我们设计缺失了PL 操纵子中boxA及部分上游序列，采用PCR方法和引进携带突变片段方法构建缺失不同的重组质粒命名为pSH-A，pSH-A13， pSH... 详细信息

为了研究λ噬菌体左向PL操纵子表达调控机理，研究N蛋白介导的转录调控因子与boxA靶位点的关系。我们设计缺失了PL 操纵子中boxA及部分上游序列，采用PCR方法和引进携带突变片段方法构建缺失不同的重组质粒命名为pSH-A，pSH-A13， pSH-A18，pSH-A22，pSH-A26，pSH-A30。重组质粒携带CI857 PL boxA boxB N-lac基因。将以上各缺失突变质粒转入含有 CI857 PL nutL(boxA、boxB)N Kil lacZ TTT galK基因的大肠杆菌受体菌［ZH1042 rnc-，ZH1041 rnc+］。温度诱导，质粒与染色体DNA 在CI857和lacZ区域发生体内同源重组。得到大肠杆菌染色体上带有CI857 PL boxA boxB lacZ TTT galK基因的菌株 SH-A，SH-A13，SH-A18，SH-A22，SH-A26，SH-A30。最后将携带N基因的质粒转化至各突变菌株，提供N蛋白。利用双报道基因lacZ、galK检测boxA及上游序列突变对N蛋白介导的抗转录终止作用的影响。研究结果出人意料地显示：左向操纵子转录具有与右向操纵子不同的转录调控现象。经多次重复实验证明，boxA及上游序列突变导致N蛋白介导的抗转录终止功能丧失，表现在大肠杆菌RNA聚合酶不能通读转录终止子使下游galK 基因表达。其作用机理正在进一步深入研究中。我们利用N蛋白生物学特点，对James ***等人的RNA 蛋白质单杂交系统改建。用R17蛋白特异的RNA位点替代boxB 位点构建了新的lacZ、galK双报道基因菌株SHb-R17，将含R17-N 融合基因的质粒介绍进以上菌株。当R17-N融合蛋白质与相应的 RNA位点结合后，恢复了N蛋白介导的抗转录终止复合物，使下沈阳药科大学硕士学位论文入噬菌体N蛋白介导的调控机理及靶位点研究游基因转录。克服了原系统敏感性差，背景高的缺点。建立了双报道基因检测RNA结合蛋白的单杂交遗传学系统。

关键词： λ噬菌体,PL操纵子,N蛋白,双报道基因,单杂交

一种可转移的重组工程系统pYM-Red的建立

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生物化学与生物物理进展 2005年第4期32卷 359-364页

作者：于梅周建光陈伟李山虎黄翠芬军事医学科学院生物工程研究所北京100850 厦门大学生命科学学院细胞生物学与肿瘤细胞工程教育部重点实验室厦门361005

重组工程是近几年发展的新型遗传工程技术.以PCR扩增的线性低拷贝质粒pACYCl84为载体,用Gap-repair方法从大肠杆菌DY330染色体上直接体内亚克隆了包括Red重组酶基因在内的长约6.7kb的基因序列,构建了pYM-Red重组质粒.在宿主菌W3110体内... 详细信息

重组工程是近几年发展的新型遗传工程技术.以PCR扩增的线性低拷贝质粒pACYCl84为载体,用Gap-repair方法从大肠杆菌DY330染色体上直接体内亚克隆了包括Red重组酶基因在内的长约6.7kb的基因序列,构建了pYM-Red重组质粒.在宿主菌W3110体内进行了染色体上galk基因的敲除,验证了Red重组酶的生物功能,并确定了影响pYM-Red重组效率的诱导时间和线性DNA片段用量.在42℃诱导10 min和线性DNA打靶分子浓度为300 ng时,pYM-Red的重组效率可达到大约每4 000个电转存活细胞中有1个重组阳性克隆,分别比pKD46和pBR322-Red系统高5～6倍.

关键词：重组工程 Red重组系统 Gap—repair 体内克隆 pYM—Red质粒