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鳗鲡肝肾肿大及体表溃烂症病原菌的分离与鉴定

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鳗鲡肝肾肿大及体表溃烂症病原菌的分离与鉴定

鳜源嗜水气单胞菌GYK1株外膜蛋白OmpA的生物信息学分析

2008年中国水产学会学术年会

作者：余露军李宁求刘礼辉付小哲石存斌吴淑勤中国水产科学研究院珠江水产研究所上海海洋大学生命与科技学院

2008年3月从广东虎门患病鳗鲡肾脏分离到两株优势菌GHAn0803-1和GHAn0803-2。患病鳗鲡体表有大量出血点,鳍条充血,有些体表溃烂,肝脏部位皮肤甚至溃烂穿孔,肛门红肿,挤压腹部有红色粘液流出,解剖检查,肝、肾肿大,胃肠明显充血。通过常... 详细信息

2008年3月从广东虎门患病鳗鲡肾脏分离到两株优势菌GHAn0803-1和GHAn0803-2。患病鳗鲡体表有大量出血点,鳍条充血,有些体表溃烂,肝脏部位皮肤甚至溃烂穿孔,肛门红肿,挤压腹部有红色粘液流出,解剖检查,肝、肾肿大,胃肠明显充血。通过常规细菌学方法和应用ATB细菌自动鉴定仪,GHAn0803-1和GHAn0803-2分别与迟钝爱德华氏菌（Edwardsiella trade）和创伤弧菌（Vibrio vulnificus）生化谱接近。为了进一步确定其分类地位,测定了GHAn0803-1的16S rRNA基因序列和GHAn0803-2的HSP60基因部分序列。PCR扩增16S rRNA获得1431bp的基因片段,与迟钝爱德华氏菌（AB050832）的16S rRNA基因同源性达99.7%,16S rRNA基因构建的系统进化树表明,菌株GHAn0803-1与Edwardsiella trade聚类;PCR扩增HSP60获得505bp的基因片段,与创伤弧菌（BA000037）的同源性达99.8%,HSP60基因构建的系统进化树表明,菌株GHAn0803-2与Vibrio vulnificus聚类。综合上述结果,进一步鉴定GHAn0803-1和GHAn0803-2分别为迟钝爱德华氏菌和创伤弧菌。人工感染实验证明,GHAn0803-1和GHAn0803-2均具有致病性,对鳗鲡的半数致死量（LD50）分别为1.70×104CFU/g和2.41×106CFU/g,因此推断鳗鲡肝肾肿大及体表溃烂症为爱德华氏菌和创伤弧菌混合感染引起。国内外已有大量文献报道由迟钝爱德华氏菌引起鳗鲡肝肾病,创伤弧菌引起鳗鲡溃烂病也有报道,但尚未见由这两种菌混合感染引起鳗鲡发病的报道。

关键词：鳗鲡迟钝爱德华氏菌创伤弧菌

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鳜源嗜水气单胞菌GYK1株外膜蛋白OmpA的生物信息学分析

中国水产学会鱼病专业委员会2013年学术研讨会

作者：方翔付小哲李宁求林强潘厚军黄志斌石存斌吴淑勤中国水产科学研究院珠江水产研究所

鳜鱼(Siniperca chuatsi)是我国重要的淡水鱼特色养殖品种之一。由嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)引起的细菌性败血症、溃疡病是鳜鱼的主要养殖病害,给鳜鱼养殖产业带来了较大的损失。该菌的外膜蛋白A(Out membrane proteinA,OmpA... 详细信息

鳜鱼(Siniperca chuatsi)是我国重要的淡水鱼特色养殖品种之一。由嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)引起的细菌性败血症、溃疡病是鳜鱼的主要养殖病害,给鳜鱼养殖产业带来了较大的损失。该菌的外膜蛋白A(Out membrane proteinA,OmpA)是一种跨膜蛋白,是革兰氏阴性菌的主要外膜蛋白之一,具有重要的生物学功能。本研究通过生物信息学方法对鳜鱼嗜水气单胞菌GYK1株的OmpA氨基酸序列进行了家族分析,结果表明N末端的Asn25-Ala205片段属于OM通道蛋白超家族(OM-channels superfamily),而靠近C末端的Ser230-Val342片段属于类OMPA超家族(OMPA-like superfamily)。我们通过同源模建方法构建了OMPA的三维结构,结果显示Asn25-Ala205片段折叠成一个8链的反向平行β桶状(eight-stranded anti-parallelβ-barrel)结构域,而Ser230-Val342片段则形成一个α/β折叠(α/βfold)结构域。β桶状结构域上有四个亲水性外环区,其平均柔性(average flexibility)显著高于其余部位,表明这些环区极有可能通过诱导契合方式参与受体——配体的结合。本研究初步探索了OMPA蛋白的结构特性,为嗜水气单胞菌呈递外源蛋白基因工程疫苗的研究奠定了基础。

关键词：嗜水气单胞菌 OmpA 序列分析同源模建平均柔性

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病毒灭活疫苗诱导云斑尖塘鳢脾脏转录组分析

基因组学与应用生物学 2019年第10期38卷 4404-4412页

作者：周阳李本旺林强付小哲李敏梁红茹刘礼辉卢伟华李宁求中国水产科学研究院珠江水产研究所农业部渔用药物创制重点实验室广东省水产动物免疫技术重点实验室广州510380 上海海洋大学水产与生命学院上海201306 广东省东莞市水生动物防疫检疫站东莞523127

为阐明云斑尖塘鳢对病毒灭活疫苗的免疫应答机制,本研究采用RNA-sequencing技术结合生物信息学方法分析了传染性脾肾坏死病毒、鳜弹状病毒二联灭活疫苗接种云斑尖塘鳢后脾脏转录谱。分别构建疫苗接种后7 d、14 d脾脏cDNA文库并对其进行... 详细信息

为阐明云斑尖塘鳢对病毒灭活疫苗的免疫应答机制,本研究采用RNA-sequencing技术结合生物信息学方法分析了传染性脾肾坏死病毒、鳜弹状病毒二联灭活疫苗接种云斑尖塘鳢后脾脏转录谱。分别构建疫苗接种后7 d、14 d脾脏cDNA文库并对其进行高通量测序,共获得85547条Unigenes,其中32386条Unigenes被注释;共筛选得到13593个差异表达基因,其中免疫后7 d上调基因1291个、下调基因2030个,14 d上调基因3732个、下调基因6540个。GO功能注释显示,差异表达基因编码蛋白主要与免疫应答、细胞黏附以及细胞增殖相关;KEGG分析表明差异表达基因集中在细胞-细胞受体互作通路、细胞粘附分子通路和MAPK信号通路等。选取差异表达的IL-1β、IL-12、MHCⅠ、MHCⅡ等4个基因进行qPCR验证,结果与转录谱结果相符。研究结果为阐明云斑尖塘鳢对传染性脾肾坏死病毒、鳜弹状病毒二联灭活疫苗的免疫应答机制提供依据。

关键词：云斑尖塘鳢转录组传染性脾肾坏死病毒鳜弹状病毒免疫应答

杂交鳢舒伯特气单胞菌弱毒疫苗候选株筛选及其免疫效果评价

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淡水渔业 2019年第5期49卷 74-79页

作者：胡蕾刘礼辉杨圆圆方伟林强付小哲梁红茹刘山桂李宁求中国水产科学研究院珠江水产研究所农业农村部渔用药物创制重点实验室广东省水产动物免疫技术重点实验室广州510380 上海海洋大学水产与生命学院上海201306 广东省水生动物疫病预防控制中心广州510220

为获得一种安全、高效的舒伯特气单胞菌(Aeromanas schubertii)弱毒疫苗候选株,通过鱼体攻毒实验筛选天然弱毒株,用筛选的弱毒株制备弱毒疫苗,对杂交鳢进行免疫后,采用荧光定量RT-PCR方法评价免疫相关基因表达情况,同时采用强毒株攻毒... 详细信息

为获得一种安全、高效的舒伯特气单胞菌(Aeromanas schubertii)弱毒疫苗候选株,通过鱼体攻毒实验筛选天然弱毒株,用筛选的弱毒株制备弱毒疫苗,对杂交鳢进行免疫后,采用荧光定量RT-PCR方法评价免疫相关基因表达情况,同时采用强毒株攻毒免疫的杂交鳢测定相对免疫保护率(relative percentage survival,RPS),综合评价弱毒株作为活疫苗侯选株的潜力。结果显示:筛选到一株舒伯特气单胞菌天然弱毒株OM170701,其对靶动物杂交鳢与非靶动物大口黑鲈均无明显致病性;该弱毒疫苗候选株能诱导杂交鳢肝脏中IL-8、IL-1β、补体C3表达量上调,免疫后72 h相对表达量达到最高,分别是对照组的相对表达量的4.95倍、5.57倍、3.94倍;免疫组IgM的相对表达量显著高于对照组,其中第28天时免疫组IgM相对表达量是对照组的17.26倍;攻毒后免疫组成活率显著高于对照组,其RPS为65%。结果表明,该弱毒株通过注射免疫能引发杂交鳢非特异性和特异性免疫应答,并提供良好的免疫保护。

关键词：杂交鳢舒伯特气单胞菌(Aeromanas schubertii) 弱毒疫苗免疫基因相对免疫保护率

鳗源迟缓爱德华氏菌菌蜕的构建及制备条件优化

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水产学报 2012年第11期36卷 1754-1762页

作者：李宁求余露军付小哲刘礼辉林强常藕琴石存斌黄志斌吴淑勤中国水产科学研究院珠江水产研究所农业部渔药创制重点实验室广东省免疫技术重点实验室

菌蜕具有完整细菌表面抗原结构,可诱导机体的体液和细胞免疫应答,成为疫苗制备的候选之一,为了探讨鳗鲡迟缓爱德华氏菌菌蜕疫苗的可行性,实验采用基因重组技术构建了噬菌体PhiX174裂解酶基因(Lysis E)的温控表达载体,转化迟缓爱德华氏菌... 详细信息

菌蜕具有完整细菌表面抗原结构,可诱导机体的体液和细胞免疫应答,成为疫苗制备的候选之一,为了探讨鳗鲡迟缓爱德华氏菌菌蜕疫苗的可行性,实验采用基因重组技术构建了噬菌体PhiX174裂解酶基因(Lysis E)的温控表达载体,转化迟缓爱德华氏菌,成功制备其菌蜕,并对菌蜕形态、溶菌动力学、裂解效率以及制备条件等进行了研究。结果表明,细菌菌蜕表面形成溶菌孔道,细胞因内容物流失而发生明显的皱缩;构建的迟缓爱德华氏菌诱导后1 h开始裂解,5 h后裂解基本完成,裂解效率为99.99%,冷冻干燥后重悬涂布平板,未检出活菌,电镜观察表明冻干前后细胞形态未见明显变化;构建的迟缓爱德华氏菌分别在OD600值为0.4和0.6进行诱导,其裂解过程和裂解效率没有明显区别;分别用LB、BHI、NB 3种培养基进行比较研究,其中LB培养基制备的菌蜕细胞较完整、裂解完全,是制备迟缓爱德华氏菌菌蜕最优培养基。本研究成功构建了鳗源迟缓爱德华氏菌菌蜕,并对其制备条件进行了优化,为鳗鲡爱德华氏菌病疫苗开发奠定了基础。

关键词：鳗鲡迟缓爱德华氏菌菌蜕条件优化

鳜蛙病毒及鳜弹状病毒双重PCR检测方法的建立及应用

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中国预防兽医学报 2021年第3期43卷 290-295页

作者：梁红茹黄瑜聪付小哲林强刘礼辉牛银杰黄志斌林蠡李宁求中国水产科学研究院珠江水产研究所农业农村部渔用药物创制重点实验室/广东省水产动物免疫技术重点实验室广东广州510380 仲恺农业工程学院动物科技学院广东广州570228

为建立可以同时检测鳜蛙病毒(SCRIV)和鳜弹状病毒(SCRV)的方法,本研究参考GenBank中登录的SCRIV MCP基因和SCRV N基因序列保守片段分别设计特异性引物,将扩增的MCP基因和N基因分别克隆于pEASY-T1载体,构建重组质粒标准品p-SCRIV和p-SCRV... 详细信息

为建立可以同时检测鳜蛙病毒(SCRIV)和鳜弹状病毒(SCRV)的方法,本研究参考GenBank中登录的SCRIV MCP基因和SCRV N基因序列保守片段分别设计特异性引物,将扩增的MCP基因和N基因分别克隆于pEASY-T1载体,构建重组质粒标准品p-SCRIV和p-SCRV,通过优化退火温度和引物浓度建立了可以同时检测SCRIV(400 bp)和SCRV(280 bp)的双重PCR方法。利用该方法对传染性胰坏死病毒、草鱼呼肠孤病毒、锦鲤疱疹病毒、新加坡石斑鱼虹彩病毒、神经坏死病毒、传染性脾肾坏死病毒、罗非鱼湖病毒及鲤春病毒血症病毒等鱼类常见病毒均无扩增条带,而仅对SCRIV和SCRV有特异性扩增条带,特异性较强;该方法对p-SCRIV的检测下限是1 000拷贝/μL,对p-SCRV检测下限是430拷贝/μL,敏感性较高。对21份临床样品的检测结果表明该双重PCR方法的扩增结果与单一PCR扩增结果一致,二者的符合率为100%。本研究建立的双重PCR检测方法特异性较强,敏感性较高,可以用于上述两种病毒的快速鉴别检测和分子流行病学调查。

关键词：鳜蛙病毒鳜弹状病毒双重PCR

山莨菪碱提高嗜水气单胞菌灭活疫苗浸泡免疫鲫的效果

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山莨菪碱提高嗜水气单胞菌灭活疫苗浸泡免疫鲫的效果

An outbreak of granulomatous inflammation associated with Francisella noatunensis subsp, orientalis in farmed tilapia (Oreochromis niloticus × O. aureus) in China

2014年中国水产学会学术年会

作者：时云朵任燕张德峰付小哲林强李宁求石存斌吴淑勤中国水产科学研究院珠江水产研究所广东省水产动物免疫技术重点实验室农业部渔药创制重点实验室上海海洋大学水产与生命学院

将山莨菪碱和嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）全菌灭活疫苗联合浸泡免疫异育银鲫,首次浸泡免疫7天后加强免疫一次。通过实时荧光定量PCR检测第2d、4d、7d、11d、14d、21d脾脏中Ig M、IL-1β、C3、C-凝集素以及溶菌酶的m RNA表达... 详细信息

将山莨菪碱和嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）全菌灭活疫苗联合浸泡免疫异育银鲫,首次浸泡免疫7天后加强免疫一次。通过实时荧光定量PCR检测第2d、4d、7d、11d、14d、21d脾脏中Ig M、IL-1β、C3、C-凝集素以及溶菌酶的m RNA表达量和第21d进行同源菌株活菌攻击试验,研究山莨菪碱在细菌灭活疫苗浸泡免疫中的作用。结果显示,山莨菪碱组第4d Ig M和IL-1β的表达量达到最高值,分别为28.3和332.7;而无佐剂疫苗组第11d Ig M和IL-1β达到最高值,分别为56.1和791.8。山莨菪碱组的补体C3、C-凝集素以及溶菌酶的表达量都显著高于无佐剂组和对照组,且表达持续时间长。活菌攻击试验表明山莨菪碱组的相对保护率可达80.0%,显著高于无佐剂组的56.0%（p＜0.05）。结果表明,山莨菪碱与嗜水气单胞菌灭活疫苗共同浸泡免疫银鲫,可以增强脾脏中Ig M、IL-1β、C3、C-凝集素以及溶菌酶基因表达,提高银鲫相对免疫保护率。

关键词：山莨菪碱浸泡免疫灭活疫苗异育银鲫免疫效果

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Chinese Journal of Oceanology and Limnology 2016年第3期34卷 460-466页

作者：林强李宁求付小哲胡钱东常藕琴刘礼辉张德锋王广军伞桂宝吴淑勤 Pearl River Fisheries Research Institute Chinese Academy of Fishery Sciences Key Laboratory of Fishery Drug Development Ministry of Agriculture Key Laboratory of Aquatic Animal Immune Technology Guangdong Province Guangzhou 510380 China Freshwater Aquaculture Collaborative Innovation Center of Hubei Province Wuhan 430070 China Panyu District Agricultural Science Research Institute Guangdong Province Guangzhou 511450 China

In 2013,a novel disease was detected in tilapia( Oreochromis niloticus × O.aureus) in Guangzhou,South China.To identify the causative pathogen,we conducted histological examination,bacteria isolation,and purification,and sequenced the 16 S rRNA gene of isolates.Infected fish had a large number of white granulomas in the kidney,liver,heart,and spleen.The head kidney and spleen were markedly swollen.A bacterium strain designated as gz201301 was recovered from the spleen of infected tilapia.The 16 S rRNA sequence of gz201301 revealed that it was highly similar to F.noatunensis subsp.orientalis.This is the first report of a Francisella-like infection in farmed tilapia in China.

关键词：中国南部弗朗西斯罗非鱼肉芽肿亚种养殖侧柏 rRNA基因序列

基于病毒mRNA监测的传染性脾肾坏死病毒灭活快速检验方法建立及其应用

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水产学报 2017年第9期41卷 1464-1472页

作者：张醴溪杨圆圆方伟付小哲林强李趁刘礼辉梁红茹黄志斌吴志新李宁求华中农业大学水产学院广东省水生动物疫病预防控制中心中国水产科学研究院珠江水产研究所农业部渔用药物创制重点实验室广东省水产动物免疫技术重点实验室

为建立传染性脾肾坏死病毒（ISKNV）灭活快速检验方法,从ISKNV感染CPB细胞系转录谱筛选并经q RT-PCR验证表达量最高的病毒ORF099基因作为快速检测靶基因。以质粒p MDORF099为标准品,采用q PCR方法绘制了CT值与质粒拷贝数的标准曲线,其... 详细信息

为建立传染性脾肾坏死病毒（ISKNV）灭活快速检验方法,从ISKNV感染CPB细胞系转录谱筛选并经q RT-PCR验证表达量最高的病毒ORF099基因作为快速检测靶基因。以质粒p MDORF099为标准品,采用q PCR方法绘制了CT值与质粒拷贝数的标准曲线,其线性方程为CT=–3.42lgx+39.455,最低检测限为3拷贝/μL,结果显示组间和组内变异系数均小于2%,表明该方法具有较高的灵敏度和较好的重复性。将ISKNV病毒悬液10倍稀释成100;03拷贝/m L,分别取1 m L病毒稀释液接种CPB细胞,在第7、9和11天提取细胞总RNA,经基因组DNA去除试剂盒去除残留DNA后采用qRT-PCR方法检测ORF099基因转录本,结果显示在第7天即可从接种1个拷贝病毒的细胞中检测出ISKNV ORF099转录本。将3个浓度梯度（0.05%、0.1%、0.2%）的甲醛灭活ISKNV制备的模拟样品以及实验室制备的3批次ISKNV细胞灭活疫苗样品接种CPB细胞9 d,采用上述快速检验方法进行检测。0.05%、0.1%甲醛灭活模拟样品可检测到ISKNV ORF099基因转录本,其他样品均未检测到。而细胞盲传实验显示,0.1%终浓度甲醛灭活ISKNV接种细胞盲传3代未出现CPE,鱼体安全实验显示接种鱼体后无临床发病症状和实验鱼死亡,表明本研究建立的病毒灭活快速检验方法比细胞盲传法和鱼体安全实验具有更高的灵敏度,与传统检测方法相比具有灵敏度高、耗时短、检测效率高等优点,对提高ISKNV灭活疫苗生产效率具有重要意义。

关键词：传染性脾肾坏死病毒灭活疫苗灭活检验 mRNA 荧光定量RT-PCR