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新型超声快速处理活检标本保存不同年限对DNA质量的影响

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中国组织工程研究 2024年

作者：石晨曦朱卫东李三恩李秀明师逢丁亚云苏州大学附属第一医院病理科苏州市立医院本部皮肤科

背景：新型超声组织处理技术越来越多地被用来进行分子生物学分析，研究新型超声处理不同存储年限组织DNA的质量，对进一步分子检测的标本质控具有重要意义。目的：探讨新型超声处理活检标本存储不同年限对DNA质量的影响，以期为分子检测探索最佳的标本存储时间。方法：收集40例乳腺穿刺小活检组织，采用超声技术制作石蜡标本，按照存储年限分为4组：3-5年组及>5年组，每组10例，对石蜡标本进行切片，每张切片厚3μm，切片10-15张，提取DNA后通过Nanophotometer N60超微量分光光度计和Qubit 4.0荧光计检测DNA的质量浓度，记录A260/A280比值判定DNA的纯度，利用全自动毛细管电泳核酸分析仪(Qsep 100)检测DNA片段完整性，以评估DNA片段的质量。结果与结论：4组样本A260/A280均值在1.8-2.0之间，达到纯度要求，无明显差异。4组样本的DNA质量浓度(Qubit浓度)均值分别为30.39,14.33,2.52,1.95 ng/μL;DNA的平均N/Q比值分别为6.48,14.18,24.56,29.86;DNA质量数均值分别为5.64,1.76,1.24,0.80；大片段占比均值分别为56.08%,17.72%,12.68%,7.90%。PCR检测内控基因Ct均值分别为15.32,17.09,18.39,21.24。与<1年组相比，其余3组DNA浓度显著降低，N/Q比值显著增加，DNA质量数和大片段占比均值显著降低，Ct值升高，差异有显著性意义(P<0.05)。实验结果表明，对于新型超声处理活检标本，应优先选择存储<1年的样本进行日常分子检测，储存3年内的样本可满足二代测序等检测要求，5年内样本仅可尝试进行PCR等检测，存储超过5年的样本不建议进行后续分子检测。

关键词：超声处理存储年限 DNA质量片段完整性降解程度二代测序

烤片时间对淋巴瘤累及骨髓穿刺组织石蜡切片EBER原位杂交检测的影响

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中国血液流变学杂志 2024年第1期34卷 146-148页

作者：李三恩阎萌张昊石晨曦苏州大学附属第一医院病理科江苏苏州215006

目的探讨淋巴瘤累及骨髓穿刺组织石蜡切片EBER原位杂交检测最佳烤片时间。方法选取苏州大学附属第一医院病理科EBER原位杂交检测结果为阳性的淋巴瘤累及骨髓穿刺组织20例。所有骨髓标本均经10%中性福尔马林固定、混合酸脱钙、石蜡包埋组... 详细信息

目的探讨淋巴瘤累及骨髓穿刺组织石蜡切片EBER原位杂交检测最佳烤片时间。方法选取苏州大学附属第一医院病理科EBER原位杂交检测结果为阳性的淋巴瘤累及骨髓穿刺组织20例。所有骨髓标本均经10%中性福尔马林固定、混合酸脱钙、石蜡包埋组织,每例标本连续切片6张,根据烤片时间不同随机分成6组,烤片后进行EBER原位杂交检测。结果烤片5 min和10 min组均出现脱片现象,烤片30 min及以上,则骨髓组织结构完整,无脱片现象发生。烤片30 min组EBER染色质量评分最高,随着烤片时间延长,EBER阳性信号着色强度逐渐减弱,阳性细胞核数量逐渐减少,EBER阳性率也降低。结论75℃烘箱中烤片30 min,骨髓石蜡切片EBER原位杂交检测效果最佳,无脱片现象发生、组织结构完整、阳性信号呈棕黄色定位于细胞核、背景干净,阳性率高。

关键词：骨髓淋巴瘤烤片 EBER 原位杂交

两种脱钙液对骨髓穿刺组织DNA质量的影响比较

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临床与实验病理学杂志 2023年第8期39卷 1006-1008页

作者：李三恩石晨曦程丽丽朱卫东苏州大学附属第一医院病理科苏州215006

骨髓穿刺组织是病理科常见的标本,随着精准医学的发展和个体化治疗需求的增加,除了进行常规HE染色和免疫组化检测外,还需辅助分子生物学检测。良好的DNA质量是分子生物学检测的前提,脱钙液的选择对DNA质量有重要影响[1],因此进行分子生... 详细信息

骨髓穿刺组织是病理科常见的标本,随着精准医学的发展和个体化治疗需求的增加,除了进行常规HE染色和免疫组化检测外,还需辅助分子生物学检测。良好的DNA质量是分子生物学检测的前提,脱钙液的选择对DNA质量有重要影响[1],因此进行分子生物学检测前需要评估脱钙后骨髓穿刺组织DNA质量。混合酸脱钙液和EDTA脱钙液是本科室两种常用的骨髓穿刺组织脱钙液,在常规组织学染色方面已经取得良好的效果,但其对DNA质量的影响尚不清楚。本实验通过提取两种脱钙液脱钙骨髓穿刺组织的DNA,从浓度、纯度、片段长度及RT-PCR检测Ct值比较两种脱钙液对DNA质量的影响,取得较好效果,现报道如下。

关键词：骨髓穿刺组织脱钙混合酸 EDTA DNA

Pten功能缺失协同Sonic Hedgehog信通路促进髓母细胞瘤发生的作用机理

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Pten功能缺失协同Sonic Hedgehog信通路促进髓母细胞瘤发生的作用...

作者：李三恩南京医科大学

学位级别：硕士

髓母细胞瘤是儿童中最常见的一种恶性脑部肿瘤,许多基因和信号通路对肿瘤的形成都有重要的影响。在小脑的发育过程中,由普金野氏细胞(Purkinje cells)释放的Sonic Hedgehog(SHH)配基通过激活Shh信号通路下游转录因子Gli调节小脑外颗粒层... 详细信息

髓母细胞瘤是儿童中最常见的一种恶性脑部肿瘤,许多基因和信号通路对肿瘤的形成都有重要的影响。在小脑的发育过程中,由普金野氏细胞(Purkinje cells)释放的Sonic Hedgehog(SHH)配基通过激活Shh信号通路下游转录因子Gli调节小脑外颗粒层(external granule layer,EGL)的颗粒细胞前体细胞(granular cells precursor,GNP)的增殖。颗粒前体细胞经过一段时间Shh配基依赖的增殖后,退出细胞周期,开始分化并向内迁移。最后,颗粒细胞穿过普金野氏细胞层,在小脑形成了内颗粒层(internal granule layer,IGL)。髓母细胞瘤起源于颗粒细胞前体细胞,目前的一种假设认为正常小脑发育过程中的秩序发生了紊乱,过度激活的Sonic Hedgehog信号通路在外颗粒层表达,使颗粒前体细胞发生过度增殖,没有适时地退出细胞周期,残留在外颗粒层。最近有研究表明髓母细胞瘤中时常伴有PI3K信号通路激活和PTEN基因的甲基化沉默,并且在Ptc1基因杂合的基础上缺失PTEN基因的表达可以加速髓母细胞瘤形成的概率,但是对这种髓母细胞瘤早期发生机制的研究还不清楚。为了研究髓母细胞瘤发生早期PTEN表达与Sonic Hedgehog信号通路之间交互作用,我们使用一种髓母细胞瘤模型鼠,即Ptc1基因杂合小鼠。然后我们又在Ptc1基因杂合的背景下利用Nestin-cre转基因鼠使PTEN基因在神经干细胞和颗粒前体细胞中特异性沉默。我们研究发现几乎所有Ptenfl/+;Nes-cre;Ptc1+/-(简称Pten+/-;Ptc1+/-)小鼠的小脑在六周时都有异位表达的细胞,这些异位表达的细胞代表肿瘤的新生阶段。这些异位表达的细胞与肿瘤细胞的组织学形态存在差异。和Ptc1+/-小鼠相比,Pten+/-;Ptc1+/-小鼠小脑六周时的部分异位细胞中PTEN蛋白的表达水平明显降低,PI3K信号通路过度激活,磷酸化Akt(S473)的表达水平显著升高。我们的研究能帮助更好了解髓母细胞瘤形成早期阶段的分子机制,为髓母细胞瘤的早期检测提供了新的生物标记物。综合这些发现和已有的研究可以为治疗伴有PI3K信号通路激活的髓母细胞瘤提供新的线索。

关键词：髓母细胞瘤 Pten Sonic Hedgehog信号通路 PI3K/Akt

基于捕获法的靶向测序技术在弥漫大B细胞淋巴瘤IgH基因重排检测中的应用价值

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临床与实验病理学杂志 2023年第3期39卷 317-320页

作者：李三恩石晨曦朱卫东王玉红郭凌川苏州大学附属第一医院病理科苏州215000

目的探讨基于捕获法的靶向测序技术在弥漫大B细胞淋巴瘤IgH基因克隆性重排检测中的应用价值。方法收集2020年3月~2022年1月苏州大学附属第一医院送检的DLBCL标本99例,提取患者基因组DNA,使用基于捕获法的靶向测序技术进行IgH基因克隆性... 详细信息

目的探讨基于捕获法的靶向测序技术在弥漫大B细胞淋巴瘤IgH基因克隆性重排检测中的应用价值。方法收集2020年3月~2022年1月苏州大学附属第一医院送检的DLBCL标本99例,提取患者基因组DNA,使用基于捕获法的靶向测序技术进行IgH基因克隆性重排检测。结果27.3%(27/99)患者检测到IgH基因完全IgHV-IgHD-IgHJ重排,50.5%(50/99)患者检测到IgH基因不完全IgHD-IgHJ重排,IgH基因克隆性重排联合检出率为66.7%(66/99)。27例患者检测到32种IgHV-IgHD-IgHJ重排,50例患者检测到52种IgHD-IgHJ重排,在IgHV-IgHD-IgHJ重排中,IgHV3、IgHD3和IgHJ4家族基因的取用频率最高,在IgHD-IgHJ重排中,IgHD3和IgHJ4家族基因的取用频率最高。3例患者捕获到未知IgH基因融合伴侣,其中2例为MIR4507-IgH融合,1例为IRF8-IgH融合。结论基于捕获法的靶向测序技术不仅可以检测IgH基因克隆性重排具体方式,还能发现IgH基因未知融合伴侣,对DLBCL诊断及个体化治疗策略制定具有重要意义。

关键词：淋巴瘤弥漫大B细胞淋巴瘤捕获法靶向测序 IgH基因重排

一种Ziehl-Neelsen抗酸染色试剂盒方法的改良

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诊断病理学杂志 2023年第7期30卷 713-714页

作者：李三恩石晨曦郭凌川朱卫东苏州大学附属第一医院病理科江苏苏州215000

结核病是由结核分枝杆菌感染引起的传染病,发病率、死亡率高,严重危害人类健康。病理科常用Ziehl-Neelsen抗酸染色试剂盒检测结核杆菌,但镜下观察结核杆菌与背景对比不清、抗酸染色的阳性率较低,笔者摸索出一种新的抗酸染色方法,使相同... 详细信息

结核病是由结核分枝杆菌感染引起的传染病,发病率、死亡率高,严重危害人类健康。病理科常用Ziehl-Neelsen抗酸染色试剂盒检测结核杆菌,但镜下观察结核杆菌与背景对比不清、抗酸染色的阳性率较低,笔者摸索出一种新的抗酸染色方法,使相同视野下着色的结核杆菌数量明显增多,抗酸染色阳性率也显著提高,现介绍如下。

关键词：抗酸染色结核杆菌改良

Sonic Hedgehog信号在小脑早期发育中的作用

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南京医科大学学报（自然科学版） 2015年第7期35卷 899-904页

作者：刘晓同李三恩乐珅程雁南京医科大学发育遗传学系江苏南京210029

目的 :研究Sonic Hedgehog(Shh)信号在小脑发育早期对小脑外颗粒层的颗粒细胞前体(GCP)细胞增殖迁移的影响。方法:通过石蜡切片免疫荧光观察小脑外颗粒层GCP细胞增殖情况;建立体外培养小鼠脑片系统,检测小脑外颗粒层GCP细胞的增殖和动... 详细信息

目的 :研究Sonic Hedgehog(Shh)信号在小脑发育早期对小脑外颗粒层的颗粒细胞前体(GCP)细胞增殖迁移的影响。方法:通过石蜡切片免疫荧光观察小脑外颗粒层GCP细胞增殖情况;建立体外培养小鼠脑片系统,检测小脑外颗粒层GCP细胞的增殖和动态迁移情况。结果:小鼠出生后7 d小脑外颗粒层增殖的GCP细胞最多;Shh信号通路促进小脑外颗粒层GCP细胞的增殖,用环巴胺(cyclopamine,CPA)抑制信号通路后小脑外颗粒层GCP细胞增殖受到抑制,但迁移不受影响。结论:Shh信号通路是促进小脑外颗粒层细胞增殖及有丝分裂必不可少的一部分,且它的作用只部分局限于外颗粒层。

关键词： Shh信号通路颗粒细胞前体细胞体外培养脑片

淋巴结活检组织EBER原位杂交检测条件优化探讨

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中国血液流变学杂志 2022年第3期32卷 450-453页

作者：肖玉娇李三恩朱卫东石晨曦山西省晋城市人民医院病理科山西晋城048000 苏州大学附属第一医院病理科江苏苏州215006

目的对淋巴结活检组织行EBV编码的小RNA(EBV encoded RNA,EBER)原位杂交检测的条件进行优化,以期提高检测效率及EBV相关疾病中EBV的检出率。方法收集11例淋巴结活检组织标本行EBER检测,通过对比实验,比较不同切片厚度、不同蛋白酶消化... 详细信息

目的对淋巴结活检组织行EBV编码的小RNA(EBV encoded RNA,EBER)原位杂交检测的条件进行优化,以期提高检测效率及EBV相关疾病中EBV的检出率。方法收集11例淋巴结活检组织标本行EBER检测,通过对比实验,比较不同切片厚度、不同蛋白酶消化时间、不同探针孵育时间下EBER原位杂交检测的染色质量情况。淋巴结活检组织切片厚度分别为1μm,2μm,3μm,4μm,5μm;胃蛋白酶消化时间范围为5~30 min,进行5 min间隔的梯度时间消化;探针孵育时间为2 h,4 h,过夜(16 h)。结果切片厚度3μm,蛋白酶消化时间为20 min的组织杂交效果好,阳性细胞着色深,定位准确,无非特异性背景染色,结果清晰易辨;杂交时间2 h,4 h,过夜(16 h)条件下杂交染色质量无明显差异。结论组织切片厚度3μm,胃蛋白酶消化20 min时淋巴结活检组织行EBER原位杂交检测的染色质量最佳,为EBV相关疾病的诊断和鉴别诊断提供重要依据并指导治疗及预后。此外,杂交时间2~4 h可大大提高检测效率,必要时可采用。

关键词：淋巴结活检组织 EBER 原位杂交条件优化

应用EBER-RNA探针原位杂交技术检测鼻咽癌组织中的EB病毒

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中国血液流变学杂志 2017年第1期27卷 103-104页

作者：李三恩苏州大学附属第一医院病理科江苏苏州215006

目的用EBER-RNA探针原位杂交技术检测鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma,NPC）组织中的Epstein-Barr（EB）病毒.方法收集苏州地区非角化性鼻咽癌组织46例,慢性鼻咽炎组织4例作为对照,应用EBER-RNA探针原位杂交技术检测鼻咽癌中的EB病... 详细信息

目的用EBER-RNA探针原位杂交技术检测鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma,NPC）组织中的Epstein-Barr（EB）病毒.方法收集苏州地区非角化性鼻咽癌组织46例,慢性鼻咽炎组织4例作为对照,应用EBER-RNA探针原位杂交技术检测鼻咽癌中的EB病毒.结果 46例非角化性鼻咽癌组织中EB病毒表达均为阳性,4例慢性鼻咽炎组织中EB病毒表达均为阴性.结论 EBER-RNA探针原位杂交技术是检测鼻咽癌EB病毒的重要技术方法.

关键词：鼻咽癌 EB病毒原位杂交