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鸟苷酸结合蛋白GBP1和GBP2抑制猪轮状病毒体外复制

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畜牧兽医学报 2024年第1期55卷 245-257页

作者：陈姝宇朱雪蛟周金柱陶然张雪寒索朗斯珠贡嘎李彬西藏农牧学院动物科学学院林芝860000 江苏农业科学院兽医研究所南京210000 兽用生物制品(泰州)国泰技术创新中心泰州225300

本研究旨在探究鸟苷酸结合蛋白1(guanylate-binding protein-1,GBP1)、鸟苷酸结合蛋白2(guanylate-binding protein-2,GBP2)的全长、片段、GTPase酶活性对猪轮状病毒(porcine rotavirus,PoRV)复制的影响。以猪肾细胞cDNA和GBP1、GBP2质粒为模板,PCR扩增出GBP1、GBP 2基因的全长和截断体(G、M、E、ME区),克隆到pCDNA3.1(+)真核表达载体上。在恒河猴细胞(MA104)细胞上过表达或沉默GBP1、GBP 2基因,探究对PoRV复制的影响。设置不同的时间点,筛选GBP1、GBP2对PoRV复制产生影响作用的时间点。应用泛GTPase酶抑制剂(CID-1067700)探究GBP1、GBP2的GTPase酶活性对PoRV的作用。通过免疫印迹法Western blot、荧光定量PCR、病毒毒价测定等方法检测GBP1、GBP2蛋白的表达情况,并研究其抗病毒功能。结果表明:成功构建pCDNA3.1(+)-GBP1-HIS和pCDNA3.1(+)-GBP2(47aa-592aa)、(131aa-592aa)-HIS重组质粒,经验证能够表达。PoRV在蛋白和mRNA水平上能显著促进GBP1、GBP2基因表达上调。过表达GBP1、GBP2基因能显著抑制PoRV复制,沉默GBP1、GBP2基因的表达能显著促进PoRV复制。成功构建并表达了GBP1、GBP2蛋白的G、M、E、ME结构域截断体。过表达截断体基因发现GBP1、GBP2的G区域抑制PoRV的复制。通过泛GTPase抑制酶活性,发现GBP1、GBP2抑制PoRV复制需要依赖GTPase酶活性。GBP1、GBP2蛋白能够抑制PoRV的复制,该抑制作用依赖GBP蛋白GTPase酶活性区域。研究结果为PoRV寻找新的药物靶点和研发新型疫苗提供理论依据。

关键词：猪轮状病毒 GBP1 GBP2 抗病毒结构域

猪轮状病毒G1P[7]株分离鉴定及多克隆抗体制备

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畜牧与兽医 2024年第4期56卷 101-107页

作者：李素芬汤学超周金柱王丹丹朱雪蛟陶然李运川郭容利张雪寒李彬南京农业大学动物医学院江苏南京210095 江苏省农业科学院兽医研究所江苏南京210014

旨在明确猪场腹泻原因并分离猪轮状病毒(PoRV)。采集腹泻猪粪便,经RT-PCR检测为阳性的样品接种于单层细胞,通过细胞病变(CPE)和间接免疫荧光(IFA)来检测病毒增殖;RT-PCR扩增VP4和VP7基因并测序以确定G/P基因型,生物信息学软件分析VP4和... 详细信息

旨在明确猪场腹泻原因并分离猪轮状病毒(PoRV)。采集腹泻猪粪便,经RT-PCR检测为阳性的样品接种于单层细胞,通过细胞病变(CPE)和间接免疫荧光(IFA)来检测病毒增殖;RT-PCR扩增VP4和VP7基因并测序以确定G/P基因型,生物信息学软件分析VP4和VP7基因的遗传进化特征;传代病毒灭活后制苗接种家兔制备多克隆抗体,测定中和抗体,并经Western blot和IFA鉴定其特异性。结果:猪流行性腹泻病毒(PEDV)、传染性胃肠炎(TGEV)、猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)、伪狂犬病毒(PRV)和牛病毒性腹泻病毒(BVDV)均为阴性,只有PoRV为阳性;过滤粪便样接种单层MA104细胞,连续传5代均可观察到以细胞圆缩、最后瓦解脱落为特征的CPE,IFA检测到PoRV的特异性荧光,表明病毒分离成功,命名为JSNJ2019;分离株连续传代,病毒滴度逐步升高,介于105~106.5 TCID50/mL;分离株JSNJ2019为G1P[7]基因型;3次免疫后家兔血清的中和抗体滴度最高可达211,Western blot出现特异性条带且IFA荧光亮而特异。本研究成功分离PoRV JSNJ2019(G1P[7])且免疫原性良好,制备的多克隆抗体特异性强,为研究PoRV致病机制奠定基础。

关键词：猪轮状病毒分离鉴定基因型免疫原性,多克隆抗体

猪流行性腹泻病毒抑制干扰素λ的病毒蛋白筛选及验证

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畜牧与兽医 2023年第10期55卷 48-55页

作者：高杰朱雪蛟范宝超宋诗莹许信刚李彬西北农林科技大学动物医学院陕西杨凌712100 江苏省农业科学院兽医研究所江苏南京210014 西藏农牧学院动物科学学院西藏林芝860000

旨在验证猪流行性腹泻病毒(PEDV)变异株在非洲绿猴胚胎肾细胞(MARC-145)上是否具有抑制宿主Ⅲ型干扰素λ(IFN-λ)的能力,筛选并鉴定介导抑制宿主IFN-λ的病毒蛋白。通过预测猪IFN-λ1和IFN-λ3启动子序列,以提取的猪小肠上皮细胞(IPEC-... 详细信息

旨在验证猪流行性腹泻病毒(PEDV)变异株在非洲绿猴胚胎肾细胞(MARC-145)上是否具有抑制宿主Ⅲ型干扰素λ(IFN-λ)的能力,筛选并鉴定介导抑制宿主IFN-λ的病毒蛋白。通过预测猪IFN-λ1和IFN-λ3启动子序列,以提取的猪小肠上皮细胞(IPEC-J2)基因组DNA为模板,扩增启动子序列,构建启动子荧光素酶报告基因质粒pIFN-λ1-Luc和pIFN-λ3-Luc,使用双荧光素酶报告基因、实时荧光定量PCR两种方法分别检测病毒感染、病毒蛋白表达对IFN-λ1和IFN-λ3启动子活性和转录本水平的调控。结果显示:成功构建了启动子荧光素酶报告质粒pIFN-λ1-Luc和pIFN-λ3-Luc,证实了PEDV AH2012/12变异株在MARC-145上能够抑制宿主IFN-λ产生,且非结构蛋白(NSP)1、5、9和开放阅读框(ORF)3下调IFN-λ1,NSP1、NSP5、NSP8和ORF3下调IFN-λ3,其中NSP5的下调作用最为明显。研究结果为PEDV逃逸IFN-λ提供了理论依据,丰富了PEDV调控先天性免疫的分子机制。

关键词：猪流行性腹泻病毒 λ干扰素非结构蛋白5 免疫逃逸

PCV2 Rep蛋白抑制TCF/LEF启动子关键作用位点的分析

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PCV2 Rep蛋白抑制TCF/LEF启动子关键作用位点的分析

胞内劳森氏菌间接ELISA抗体检测方法的建立及应用

中国畜牧兽医学会兽医产科学分会第十六次学术研讨会

作者：李荷然肖琦温立斌朱雪蛟何孔旺芮荣南京农业大学动物医学院江苏省农业科学院兽医所

引言猪圆环病毒2型（Porcine Circovirus 2,PCV2）是一种无囊膜的单股负链环状DNA病毒,在临床上是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征（post-weaning multisystemic wasting syndrome,PMWS）的主要病因,在世界上广泛存在。Wnt信号通路是一种...

引言猪圆环病毒2型（Porcine Circovirus 2,PCV2）是一种无囊膜的单股负链环状DNA病毒,在临床上是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征（post-weaning multisystemic wasting syndrome,PMWS）的主要病因,在世界上广泛存在。Wnt信号通路是一种保守的信号通路,在经典途径中,它通过激活相关靶基因来控制细胞生长、分化、凋亡等过程。实验室前期试验证实了PCV2在体外和小鼠体内均可抑制Wnt信号通路的表达,PCV2orf1表达的Rep蛋白会通过降低TCF/LEF启动子的活性并阻止β-catenin进入细胞核来抑制Wnt信号通路。本试验旨在通过构建Rep截断蛋白及Rep点突截断蛋白来寻找影响TCF/LEF启动子活性的关键作用位点,再构建PCV2点突变病毒验证该位点对Wnt信号通路下游mRNA的影响,为将来通过影响Wnt信号通路来预防或治疗PMWS提供供试验依据。

关键词：

来源： cnki会议评论

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中国预防兽医学报 2022年第4期44卷 396-401,444页

作者：王丹丹周俊明倪艳秀祝昊丹朱雪蛟周金柱李彬江苏省农业科学院兽医研究所江苏南京210014

为建立胞内劳森氏菌(LI)抗体的间接ELISA检测方法,本研究构建了含有LI外膜蛋白基因的重组质粒pET32-LI1022并进行原核表达。结果显示LI1022基因在BL21(DE3)宿主菌内以可溶性表达重组LI1022蛋白(rLI1022),western blot结果显示rLI1022具... 详细信息

为建立胞内劳森氏菌(LI)抗体的间接ELISA检测方法,本研究构建了含有LI外膜蛋白基因的重组质粒pET32-LI1022并进行原核表达。结果显示LI1022基因在BL21(DE3)宿主菌内以可溶性表达重组LI1022蛋白(rLI1022),western blot结果显示rLI1022具有较好的反应原性,可作为建立间接ELISA检测方法的包被抗原。进一步经Ni柱纯化获得纯化r LI1102,以其为包被抗原,对ELISA条件进行优化,结果显示纯化的rLI1022以4.69 ng/孔4℃过夜包被最佳;血清最佳反应条件为1:100稀释,37℃作用1 h;羊抗猪IgG-HRP最佳反应条件为1:10000稀释,37℃作用1 h;25℃TMB底物显色15 min。对建立的间接ELISA方法的特异性、敏感性、重复性进行分析,结果显示包被抗原与PRRSV、PRV、FMDV、PEDV等阳性血清均无交叉反应,仅可特异性检测LI抗体;当LI阳性血清稀释倍数为1:400时仍为阳性,表明该方法敏感性较好;批内、批间重复性试验变异系数均小于10%。与国外商品化ELISA检测试剂盒对比,二者的符合率达94.44%;利用所建立的间接ELISA方法对江苏部分地区319份临床猪血清样品进行检测,其中LI阳性检出率为87.77%,表明LI在江苏猪群中普遍存在。本研究首次建立了检测LI的间接ELISA方法,为临床LI血清流行病学调查提供了可行技术手段。

关键词：胞内劳森氏菌间接ELISA 抗体检测 LI1022重组蛋白

表达猪圆环病毒2型ORF2基因的重组猪繁殖与呼吸综合征病毒的构建与鉴定

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病毒学报 2015年第1期31卷 65-73页

作者：张挺杰刘星孙涛朱雪蛟范宝超白娟姜平南京农业大学农业部动物细菌学重点实验室南京210095

猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)和猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)是目前危害世界养猪业的两种重要病原。本研究采用PCR方法构建PRRSV疫苗株TJM-F92全长cDNA克隆载体pCMV-TJM,并在其ORF7和3′UTR之间插入AflⅡ/MluⅠ酶切位点和转录调控序列TRS6,构建获得pCMV-TJM-TRS表达载体。将PCV2ORF2基因插入该载体AflⅡ/MluⅠ位点,获得重组质粒pCMV-TJM-Cap。将pCMV-TJM、pCMV-TJM-TRS和pCMV-TJM-Cap分别转染Marc-145细胞,拯救获得3种重组病毒rTJM、rTJM/TRS和rTJM/Cap。基因测序列、酶切鉴定、Western blot、间接免疫荧光和病毒生长特性结果显示,3种重组PRRSV病毒都含有特征性分子标记,在Marc-145细胞增殖特性与亲本病毒相似;rTJM/Cap传至第8代,仍含有外源Cap基因,病毒感染细胞能有效表达PCV2Cap蛋白,从而为PRRSV致病机制和PRRSV-PCV2疫苗研究奠定了重要基础。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒猪圆环病毒2型反向遗传重组病毒

非洲绿猴FILIP1L真核表达质粒的构建及其抑制PEDV复制的研究

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畜牧与兽医 2023年第1期55卷 77-82页

作者：汤学超李运川张雪寒范宝超朱雪蛟周金柱赵永祥郭容利李彬李鹏长江大学动物科学学院湖北荆州434025 江苏省农业科学院兽医研究所江苏南京210014

为探究FILIP1L(filamin A-interacting protein 1-like)蛋白对猪流行性腹泻病毒(PEDV)的影响,以Vero细胞中提取的总RNA反转录的cDNA为模板,PCR扩增出FILIP1L基因,克隆到p3×FLAG-CMV-10真核表达载体上。过表达或沉默FILIP1L基因,通过免疫印迹和定量PCR检测FILIP1L蛋白的表达情况,并研究其抗病毒功能。结果:成功构建3×FLAG-CMV-10-FILIP1L重组质粒,转染后能够正常表达。PEDV感染Vero细胞后,FILIP1L基因的mRNA表达显著上调;过表达FILIP1L基因显著抑制PEDV的复制;下调FILIP1L的表达可显著促进PEDV的复制。综上,FILIP1L蛋白能够抑制PEDV在Vero细胞的复制,研究结果为寻找新的抗PEDV药物靶点和研发新型疫苗提供理论依据。

关键词：猪流行性腹泻病毒 FILIP1L 抗病毒复制

耐热Taq DNA聚合酶的酸酐修饰及其在降低PCR非特异性扩增中的应用评价

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浙江农业学报 2011年第3期23卷 500-505页

作者：周晓薇朱雪蛟田玲曹林南京农业大学食品科技学院江苏南京210095 南京农业大学动物医学院江苏南京210095

酸酐能与聚合酶上的赖氨酸结合形成聚合物,试验通过选用合适的酸酐,修饰TaqDNA聚合酶。在常温下,酶活性被封闭,升温过程中不表现酶活,从而减少非特异性扩增和引物二聚体的形成;而在较高的温度下一段时间后,一般为94℃、15 min,酸酐脱落... 详细信息

酸酐能与聚合酶上的赖氨酸结合形成聚合物,试验通过选用合适的酸酐,修饰TaqDNA聚合酶。在常温下,酶活性被封闭,升温过程中不表现酶活,从而减少非特异性扩增和引物二聚体的形成;而在较高的温度下一段时间后,一般为94℃、15 min,酸酐脱落,聚合酶得以恢复正常的扩增活性,从而实现PCR反应的热启动。由此建立的热启动PCR体系灵敏度高,可以检测到10个拷贝的DNA分子,较普通PCR体系提高了2个数量级。此方法较其他方法操作简单成本低廉,且所得的热启动TaqDNA聚合酶稳定性好,便于保存,其灵敏性与特异性也更高。这种通过化学修饰形成的复合物达到热启动PCR目的的方法的建立,具有着重要的意义,是提高PCR灵敏度和特异性的重要方法之一。

关键词：热启动PCR Taq DNA聚合酶化学修饰

鉴别检测PCV2a与PCV2b的PCR的建立与应用

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中国兽医科学 2015年第1期45卷 50-56页

作者：朱雪蛟白娟王先炜姜平南京农业大学动物医学院江苏南京210095

为了快速鉴别猪圆环病毒2型(PCV2)的2个基因型PCV2a与PCV2b,根据PCV2a和PCV2b基因序列特征,设计PCR引物,成功建立了鉴别检测PCV2a与PCV2b的PCR,并进行了敏感性试验和特异性试验。结果显示,该方法对PCV2a和PCV2b的敏感性分别为9.74fg/μL... 详细信息

为了快速鉴别猪圆环病毒2型(PCV2)的2个基因型PCV2a与PCV2b,根据PCV2a和PCV2b基因序列特征,设计PCR引物,成功建立了鉴别检测PCV2a与PCV2b的PCR,并进行了敏感性试验和特异性试验。结果显示,该方法对PCV2a和PCV2b的敏感性分别为9.74fg/μL和16.3fg/μL;与猪细小病毒、伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒等没有交叉反应性。用该方法对采自我国华东地区的125份断奶仔猪多系统衰竭综合征病猪的淋巴组织样品进行检测,结果显示,单独感染PCV2a占8.0%(10/125),PCV2b占41.6%(52/125),PCV2a或PCV2b共感染占50.4%(63/125)。选取PCV2a或PCV2b单独感染的淋巴结组织病料进行病毒分离和全基因序列分析,结果分离获得4株PCV2b和1株PCV2a,与该鉴别PCR的检测结果一致,说明本研究建立的PCR可以有效鉴别PCV2a与PCV2b,具有较高的特异性和敏感性,可用于断奶仔猪多系统衰竭综合征病猪的临床样品中PCV2的快速检测。

关键词： PCV2a PCV2b PCR