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猪流行性腹泻病毒PCR-ELISA检测方法的建立

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猪流行性腹泻病毒PCR-ELISA检测方法的建立

作者：朱红晓河南科技学院

学位级别：硕士

猪流行性腹泻是由猪流行性腹泻病毒引起的一种急性、接触性肠道传染病,能够引起猪的腹泻、呕吐、脱水,对哺乳仔猪的致死率可达80%-100%。2010年以来,该病在我国暴发流行,给生猪养殖业造成了巨大的经济损失。目前,PEDV的防控主要包括病... 详细信息

猪流行性腹泻是由猪流行性腹泻病毒引起的一种急性、接触性肠道传染病,能够引起猪的腹泻、呕吐、脱水,对哺乳仔猪的致死率可达80%-100%。2010年以来,该病在我国暴发流行,给生猪养殖业造成了巨大的经济损失。目前,PEDV的防控主要包括病原监测、免疫防控、生物安全、加强畜群营养管理、临床诊断等综合措施,其中病原的的PCR-ELISA方法用以该病的早期监测。对GenBank公布的PEDV的ORF3基因序列,进行比对分析,针对保守序列设计合成一对RT-PCR特异性引物,通过PCR扩增获得PEDV ORF3目的基因片段,将其克隆至pMD19-T载体上,构建pMD19-T-ORF3重组质粒,质粒经PCR鉴定和测序,完成目的基因的鉴定。对该上下游引物的5’端分别标记地高辛和生物素,合成一对带有标记物的引物。以构建好的质粒为模板,用带有标记物的引物在相同条件下进行PCR扩增,得到两端带有标记物的PCR产物。按照PCR-ELISA的操作步骤对PCR-ELISA所用链霉亲和素的包被浓度、BSA封闭液的封闭浓度、PCR产物的作用时间、酶标二抗的工作稀释浓度以及作用时间、显色时间等进行优化,进而确定反应的最佳条件,取经PCR鉴定为PEDV阴性的35份样品,进行PCR-ELISA检测,测其OD值,依据公式校正值=平均值(??)+3×标准方差(SD)确定PCR-ELISA检测方法的临界值。将PEDV的基因组cDNA进行倍比稀释,进行PCR-ELISA检测,确定其敏感性。以PRRSV、PRV、CSFV、PCV-2、猪乙型脑炎的DNA为模板,在最佳反应条件下进行PCR-ELISA检测其特异性。通过用不同的病料对同一时间包被的酶标板进行批内重复性检测和不同时间包被的酶标板进行批间重复性检测,确定该检测方法的重复性。通过与普通PCR检测和Q-PCR的检测结果比较其符合性。结果显示,常规PCR扩增出条带大小为227bp,经测序分析,与GenBank上发布的PEDV ORF3基因的同源性为100%,证明扩增的目的片段为PEDV ORF3基因。对PCR-ELISA各个试验条件进行优化,筛选出最佳反应条件:1:800稀释的链霉亲和素(1mg/mL)4℃包被过夜,2%的BSA封闭液37℃条件下封闭15min,1:50稀释的PCR产物37℃作用15min,2000倍稀释的酶标二抗(1mg/mL)37℃反应15min,显色5min。将已知PEDV阴性的35份样品,经PCR-ELIAS检测,样本OD值大于等于0.35的判定为阳性,小于0.29判定为阴性,介于二者之间为可疑样品。本试验建立的PCR-ELISA可检测到阳性质粒的最低检测限3.94×10copies/μL,而常规PCR可以检测到的最低限为3.94×10copies/μL,由结果可以看出,PCR-ELISA敏感性比常规PCR高1000倍,并与PRRSV、PRV、CSFV、PCV-2、猪乙型脑炎无交叉反应,说明其特异性好。对64份临床样品进行检测,PCR检测出31份阳性,阳性检出率为48.4%,PCR-ELISA检测出36份阳性样品,阳性检出率为56.2%,Q-PCR检测出36份阳性。将PCR鉴定为阴性PCR-ELISA和Q-PCR检测为阳性的5份样品进行病毒分离培养、IFA鉴定,结果均为阳性,说明建立的PCR-ELISA检测方法准确度高,与荧光定量PCR的符合率为100%。总之,本试验建立了一种高效、快速、特异、灵敏、安全的PEDV检测方法,为进一步组装试剂盒或研制试纸条用于PEDV的流行病学调查、猪场的环境监测以及诊断提供技术支撑。

关键词：猪流行性腹泻病毒 RT-PCR PCR-ELISA 荧光定量PCR

某典型沿海城市大气细颗粒物污染特征及来源解析

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某典型沿海城市大气细颗粒物污染特征及来源解析

作者：朱红晓山东师范大学

学位级别：硕士

近年来,威海市大气污染防治工作不断取得进展,环境空气质量明显改善。但受特殊气候条件及污染传输影响,大气污染事件仍有发生,尤其受冬季采暖期污染物排放和春季沙尘天气的影响,污染天细颗粒物PM浓度显著提高。对威海市细颗粒物开展监... 详细信息

近年来,威海市大气污染防治工作不断取得进展,环境空气质量明显改善。但受特殊气候条件及污染传输影响,大气污染事件仍有发生,尤其受冬季采暖期污染物排放和春季沙尘天气的影响,污染天细颗粒物PM浓度显著提高。对威海市细颗粒物开展监测分析及来源解析研究,对威海市制定具有针对性的PM污染控制措施,改善PM大气污染现状至关重要。为明确威海市冬、春季细颗粒物组分特征及来源,本研究通过分析威海市2017018年PM浓度数据,得到威海市近几年PM污染变化特征,结合威海市PM污染贡献较大的污染源和地区特点,选取山大分校、临港木工机械和文登园林局3个监测点位。于2018年1月月,采用间断采样方式,共采样50天,采集300个威海市细颗粒物PM样品。对采集的样品进行样品称重、元素碳/有机碳分析、金属元素分析和水溶性离子分析,筛选出各监测站点样品中离子浓度较高的特征组分,对采样期间污染天与清洁天PM组分特征及贡献占比进行对比,选取采样期间的三次污染过程进行对比分析,并通过文献查阅及污染源实地调查建立PM化学成分谱,结合PMF受体模型对威海市大气细颗粒物来源进行解析。本文的主要研究结果如下:(1)2015年至2018威海市的PM年平均浓度为31.24μg/m,超标天数为63天,PM成为威海近年来的主要空气污染物之一。PM浓度随季节性变化特征比较明显,污染天多集中在采暖季和春季,PM浓度在冬季浓度较高,达到41.76μg/m,春季稍低,夏季和秋季持平。PM污染物日变化没有明显的规律性,小时平均浓度大约为31.13μg/m。PM年变化趋势呈现“单峰”型变化趋势,PM在12月达到浓度最大值46.18μg/m。(2)采样期间PM质量浓度的空间分布差异不明显,三个监测点之间山大点浓度较高,临港点较低,质量浓度变化范围在34.0635.946μg/m之间。采样期间有机碳(OC)质量浓度高于元素碳浓度(EC),OC的质量浓度范围在2.975.183μg/m之间,EC的质量浓度范围在1.299.681μg/m之间。文登位于郊区,生物质燃烧及采暖期间散煤燃烧较多,导致该点碳组分浓度较高;山大点位于市区,碳排放相对较少。水溶性离子质量浓度变化范围为:NO(7.335.321)μg/m、NH(5.107.183)μg/m、SO(4.435.731)μg/m、Na(0.213.305)μg/m、Ca(0.548.767)μg/m、Cl(0.630.873)μg/m、K(0.228.307)μg/m、Mg(0.141.190)μg/m。文登点受采暖季燃煤、农业源排放以及二次转化等因素影响,二次离子、K和Cl离子质量浓度较高;山大点靠近海边,海盐粒子影响较大,且该点附近存在建筑施工扬尘,导致Na、Ca和Mg离子质量浓度较高。金属元素组分中,占比较大的金属元素质量浓度变化范围为:Si(0.373.658)μg/m、Al(0.263.425)μg/m、Fe(0.453.547)μg/m、Zn(0.130.185)μg/m、Cu(0.040.049)μg/m、Pb(0.025.043)μg/m。山大点受火电厂燃煤排放及附近扬尘影响,导致Si和Al质量浓度较高;临港点由于周边的工业企业排放导致Fe质量浓度较高。(3)污染天PM组分中NH、NO、SO三类离子的浓度总和为62.42μg/m,清洁天为14.78μg/m,明显升高,采暖期NO主要来源是区域传输,铵盐气溶胶主要来源于输送和本地贡献。污染天水溶性离子的浓度比清洁天高,清洁天水溶性离子在PM中所占的比例高于污染天。海盐离子的变化趋势最为明显,山大点Na在清洁天PM中的占比为11.14%,污染天比例为3.48%,Mg在清洁天PM中的占比为0.62%,污染天为0.24%,由于Na、Mg主要来源于海上的清洁天气团,污染天气团主要来源于内陆,所以Na、Mg在清洁天PM中的占比较高。(4)采样期间共采集到三次典型污染过程,Haze 1的PM浓度为(50.10±35.69μg/m),Haze2的PM浓度为(74.80±9.09μg/m),Haze 3的PM浓度为(100.77±15.55μg/m)。分析三次污染过程细颗粒物组分得出:Haze1中Cl的浓度(1.13±0.86)μg/m、占比较高为2.26%,K质量浓度(0.73±0.52)μg/m、占比为1.46%,K是生物质燃烧的特征因子,Cl是燃烧源的特征因子,Haze 1污染过程受燃烧源排放影响较大。Haze 2中K占比相较于另两次污染占比小,受燃烧排放影响小。Haze 3中二次无机离子浓度高于前两次污染过程,NO、NH、SO质量浓度分别为(31.27±5.09)、(20.74±2.48)、(13.94±1.94)μg/m,硝酸盐和硫酸盐区域性传输特征,表明此次污染过程受到区域传输影响,同时Ca浓

关键词：威海市 PM2.5 质量浓度组分特征来源解析

典型沿海城市采暖期细颗粒物组分特征及来源解析

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环境科学 2020年第4期41卷 1550-1560页

作者：李明燕杨文魏敏朱红晓刘厚凤山东师范大学地理与环境学院济南250014 威海市环境保护监测站威海264200

为明确威海市采暖期细颗粒物的组分及来源,于2018年1~3月在威海市3个空气质量例行监测点采集了环境空气PM2.5样品,分析OC、EC、水溶性离子及元素组分特征,利用PMF模型解析PM2.5的来源.结果表明,采样期间威海市PM2.5日均质量浓度为(33.80... 详细信息

为明确威海市采暖期细颗粒物的组分及来源,于2018年1~3月在威海市3个空气质量例行监测点采集了环境空气PM2.5样品,分析OC、EC、水溶性离子及元素组分特征,利用PMF模型解析PM2.5的来源.结果表明,采样期间威海市PM2.5日均质量浓度为(33.80±22.45)μg·m^-3,NO-3、NH+4、SO4^2-、OC和EC是其主要组分.作为沿海城市其Cl-占比相对较高,同时PM2.5组分特征体现出颗粒物成分受本地工业特征污染物排放的影响.NO-3/SO4^2-和OC/EC比值均表明威海市采暖期移动源对PM2.5贡献大;水溶性离子中酸碱离子比例分析表明,威海市采暖期PM2.5呈弱碱性,NH+4过量,主要以NH4NO3和(NH4)2SO4等形式存在.污染时段威海市二次污染物浓度上升明显,主要组分NH+4、NO-3、SO4^2-、OC和EC质量浓度是清洁时段的4.21、5.27、3.23、2.02和1.81倍.源解析结果表明,二次气溶胶占PM2.5的32.4%~36.0%,移动源(15.6%~18.9%)、燃煤源(12.1%~17.8%)、生物质燃烧源(9.0%~10.4%)和扬尘(8.6%~11.3%)是威海市环境空气PM2.5的主要来源,而工艺过程源(2.1%~8.3%)、非道路移动源(2.4%~3.7%)和海盐(3.5%~5.6%)贡献比例较小.

关键词： PM2.5 组分特征源解析正定矩阵因子分析法(PMF) 威海市

某沿海城市典型行业NMHCs排放特征及对二次污染物生成潜势研究

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环境科学学报 2021年第2期41卷 395-405页

作者：刘厚凤李明燕许鹏举朱红晓魏敏山东师范大学地理与环境学院济南250014 山东师范大学环保技术与政策研究中心济南250014

采用SUMMA罐采样、GC⁃FID技术分析了威海市渔具、造船和橡胶等6种典型行业代表企业废气中59种非甲烷碳氢化合物(NMHCs)组分及占比,并计算了各行业NMHCs的臭氧(O_(3))和二次有机气溶胶(SOA)生成潜势,提出了NMHCs治理建议.结果表明,涉及... 详细信息

采用SUMMA罐采样、GC⁃FID技术分析了威海市渔具、造船和橡胶等6种典型行业代表企业废气中59种非甲烷碳氢化合物(NMHCs)组分及占比,并计算了各行业NMHCs的臭氧(O_(3))和二次有机气溶胶(SOA)生成潜势,提出了NMHCs治理建议.结果表明,涉及溶剂使用的渔具、造船、汽车制造业喷涂工序的NMHCs组分以芳香烃为主,橡胶和化工行业以芳香烃和烷烃为主,光纤制造业以烷烃为主.不同行业喷涂废气特征成分存在差异,渔具喷涂废气主要组分为甲苯和邻二甲苯,造船喷涂废气主要组分为邻二甲苯、乙苯和间/对二甲苯,汽车制造喷漆废气主要组分为二乙苯、1,2,4⁃三甲苯和1,2,3⁃三甲苯,甲基环己烷和甲苯分别是橡胶和化工行业的主要组分,异丁烷和异戊烷是光纤行业的主要组分.研究结果可为构建当地典型行业NMHCs成分谱、精准制定控制O_(3)和PM_(2.5)污染的NMHCs优先减排行业提供基础和参考依据.

关键词： NMHCs 典型行业组分特征臭氧生成潜势(OFP) 二次有机气溶胶生成潜势(SOAFP)

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巧用皮筋有效学练五禽戏

中国学校体育 2022年第8期41卷 46-47页

作者：朱红晓安徽省毫州市涡阳县第二中学

《校园五禽戏（高中版）》是人民体育出版社出版，根据传统健身气功五禽戏中的虎、鹿、熊、猿、鸟改编，较传统的五禽戏而言，改编后的校园五禽戏动作节拍明显，学生更容易掌握。笔者针对《校园五禽戏（高中版）》的技术特点，巧用皮筋...

《校园五禽戏（高中版）》是人民体育出版社出版，根据传统健身气功五禽戏中的虎、鹿、熊、猿、鸟改编，较传统的五禽戏而言，改编后的校园五禽戏动作节拍明显，学生更容易掌握。笔者针对《校园五禽戏（高中版）》的技术特点，巧用皮筋设计练习方法，纠正易错动作。

关键词：

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德州市PM10无机组分特征及来源解析

中国环境管理干部学院学报 2019年第5期29卷 9-11,75页

作者：朱红晓刘厚凤山东师范大学地理与环境学院

统计分析了山东省大气超级站德州站2018年1月—3月逐小时离子组分、金属组分和碳组分在线监测数据(共332个样本)。利用正定矩阵因子(PMF)和主成分分析(PCA)模型对德州市PM10进行来源解析,将PM10的主要来源分为6类,分别是交通源(27.9%)... 详细信息

统计分析了山东省大气超级站德州站2018年1月—3月逐小时离子组分、金属组分和碳组分在线监测数据(共332个样本)。利用正定矩阵因子(PMF)和主成分分析(PCA)模型对德州市PM10进行来源解析,将PM10的主要来源分为6类,分别是交通源(27.9%)、二次源(26.2%)、燃煤源(30.1%)、燃油源(<0.05%)、建筑尘(0.8%)、其他源(15.0%)。PCA分析结果表明,德州市PM10的主要来源是燃煤源,其次是交通源,因此应重点加强对燃煤源及交通源的排放控制。

关键词：德州市源解析 PMF PCA

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电力企业项目风险管理与应对策略研究

无抗发酵饲粮对猪小肠黏膜形态和杯状细胞的影响

中国科技纵横 2024年第8期 5-7页

作者：李锋朱红晓国网河南淅川县供电公司河南淅川 474450

电力企业项目风险管理面临着多样化挑战和风险.本研究采用案例分析和文献综述相结合的方法,以丰富的实践案例和理论知识为基础,分析电力企业项目风险管理的基本原则和应对策略,旨在为电力企业在不断变化的市场环境中提供有益的经验和启... 详细信息

电力企业项目风险管理面临着多样化挑战和风险.本研究采用案例分析和文献综述相结合的方法,以丰富的实践案例和理论知识为基础,分析电力企业项目风险管理的基本原则和应对策略,旨在为电力企业在不断变化的市场环境中提供有益的经验和启示,以确保项目的顺利实施和可持续发展.

关键词：电力企业项目风险管理应对策略研究分析

来源：博看期刊评论

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博看期刊

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动物营养学报 2019年第4期31卷 1797-1805页

作者：魏小兵张秀林王秋霞刘明成朱红晓胡会龙刘兴友河南科技学院动物科技学院新乡453003 动物病毒病防控与药残分析河南省重点学科开放实验室新乡453003 畜禽智能化清洁生产河南省工程实验室新乡453003 新乡学院新乡453003

本试验旨在研究无抗发酵饲粮对猪小肠黏膜形态和杯状细胞的影响。试验选取遗传背景相似的初生健康乳猪120头,随机分为试验组和对照组,每组6个重复,每个重复10头猪。对照组饲喂含抗生素的基础饲粮,试验组饲喂以10%发酵饲粮代替部分无抗... 详细信息

本试验旨在研究无抗发酵饲粮对猪小肠黏膜形态和杯状细胞的影响。试验选取遗传背景相似的初生健康乳猪120头,随机分为试验组和对照组,每组6个重复,每个重复10头猪。对照组饲喂含抗生素的基础饲粮,试验组饲喂以10%发酵饲粮代替部分无抗生素基础饲粮的试验饲粮,营养和能量水平调到与对照组相当。结果表明:1)试验组和对照组在小肠黏膜形态上有一定的差异。2)在44日龄时,试验组空肠绒毛高度比对照组提高7.19%(P0.05)。4)在44日龄时,试验组回肠绒毛高度/隐窝深度(V/C)比对照组提高17.18%(P<0.01)。5)在44日龄时,对照组十二指肠、空肠和回肠黏膜上皮间杯状细胞数量极显著高于试验组(P<0.01)。在75日龄时,对照组十二指肠黏膜上皮间杯状细胞数量极显著高于试验组(P<0.01)。综上所述,无抗发酵饲粮能改善小肠黏膜形态,增大吸收面积,从而促进小肠对营养物质的吸收。

关键词：无抗发酵饲粮猪小肠黏膜杯状细胞

PCR-ELISA在疫病病原分子诊断中的应用

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中国家禽 2018年第13期40卷 63-65页

作者：陈晴王秋霞欧长波李鹏朱红晓魏小兵闫艺婷张秀林胡会龙刘兴友河南科技学院河南新乡453003 新乡学院河南新乡453003

PCR-ELISA是一种分子免疫学检测技术,生物素标记的DNA在酶标板上固定以后可以直接确定PCR产物的含量。这种方法与普通PCR相比具有快速、敏感和检测限低等优势。PCR-ELISA的高特异性、敏感性以及半定量的能力使其成为医疗、兽医和农业等... 详细信息

PCR-ELISA是一种分子免疫学检测技术,生物素标记的DNA在酶标板上固定以后可以直接确定PCR产物的含量。这种方法与普通PCR相比具有快速、敏感和检测限低等优势。PCR-ELISA的高特异性、敏感性以及半定量的能力使其成为医疗、兽医和农业等行业重要的检测工具。PCR-ELISA在具体针对某一个病原时,需要进行引物的优选、条件的优化。文章对PCR-ELISA用于疫病分子诊断的原理、特点、应用及研究进展等方面进行了简要概述,从而为PCR-ELISA在疫病诊断中的研究提供参考。

关键词： PCR PCR-ELISA 疫病病原分子诊断