检索结果-南通市图书馆

纤溶酶原激活剂作用的结构基础及变构体研究进展

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科学通报 1998年第17期43卷 1805-1812页

作者：朱甫祥田原贺福初军事医学科学院放射医学研究所北京100850

溶栓药物在治疗心脑血管血栓性疾病中发挥重要作用 ,但是传统的溶栓剂由于半衰期短、血栓特异性差等缺点使其在临床应用中往往伴随系统性溶栓副作用 .近年来 ,随着人们对溶栓剂分子结构与功能认识的不断深入 ,用分子生物学方法对传统的... 详细信息

溶栓药物在治疗心脑血管血栓性疾病中发挥重要作用 ,但是传统的溶栓剂由于半衰期短、血栓特异性差等缺点使其在临床应用中往往伴随系统性溶栓副作用 .近年来 ,随着人们对溶栓剂分子结构与功能认识的不断深入 ,用分子生物学方法对传统的溶栓剂进行改构 ,构建了一系列新型溶栓剂 .组织纤溶酶原激活剂 (t_PA)和尿激酶 (u_PA)是目前研究较多的两种溶栓剂 ,通过某些氨基酸的突变、替换、缺失以及结构重排 ,得到了一些血栓特异性高、半衰期延长和活性增强的突变体和嵌合体 ,有些变构体溶栓剂在临床试验中显示出高效安全的溶栓特性 .发展新型的溶栓剂分子 ,对于更有效地治疗严重困扰人类的心血管疾病具有十分重要的意义 ,人们在这个领域已经并仍在做不懈的努力 .但是 ,也应该看到 ,溶栓剂分子结构的改变势必会或多或少地引起整个分子空间构象的改变 ,进而打破该类重要生理病理调节分子多种功能的自然平衡与自身调节 ,这类问题需要在实际应用中不断地探索 .现就目前对t PA和u_PA的结构与功能关系的认识 ,以及近年来以这两者为基础的新型溶栓剂的研究情况进行综述 .

关键词：溶栓剂变构体纤溶酶原激活剂心血管系统药物

内含肽介导F309SfVⅢ的连接和重链分泌的增强

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生理学报 2009年第6期61卷 526-532页

作者：朱甫祥刘泽隆屈慧鸽迟晓艳鲁东大学生命科学学院烟台264025

凝血因子VⅢ(coagulation factor VⅢ,fVⅢ)是一种分泌性血浆蛋白,在凝血级联反应中发挥重要作用,由fVⅢ缺陷导致的甲型血友病是一种最常见的X-联锁隐性遗传性出血性疾病,基因治疗被认为是该病的理想治疗模式,但在运用最有希望的腺辅助... 详细信息

凝血因子VⅢ(coagulation factor VⅢ,fVⅢ)是一种分泌性血浆蛋白,在凝血级联反应中发挥重要作用,由fVⅢ缺陷导致的甲型血友病是一种最常见的X-联锁隐性遗传性出血性疾病,基因治疗被认为是该病的理想治疗模式,但在运用最有希望的腺辅助病毒(adeno-associated virus,AAV)载体转fVⅢ基因时受到AAV的容量限制。本文旨在利用内含肽(intein)的蛋白质反式剪接,研究双载体真核细胞转具有促分泌作用的F309S突变体全长fVⅢ(F309SfVⅢ)基因。内含肽是一种包埋在蛋白质前体中的多肽序列,其在蛋白质成熟过程中通过蛋白质剪接作用被切除。将F309SfVⅢ的cDNA于B结构域的Ser1239密码子前断裂为重链(heavy chain,HC)和轻链(light chain,LC)两部分,分别与Ssp DnaB intein编码序列融合,插入到pcDNA3.1,构建一对质粒表达载体。共转染或分别单独转染293细胞,48h后用Western blot观察细胞内转基因的表达和F309SfVⅢ的剪接,用ELISA检测培养上清中分泌的F309SfVⅢ蛋白量以及HC含量,用Coatest法检测培养上清的fVⅢ生物活性。结果显示,共转染细胞有明显的完整F309SfVⅢ蛋白条带形成,细胞培养上清中的F309SfVⅢ蛋白浓度为(71±9)ng/mL,所产生的fVⅢ生物活性为(0.38±0.09)IU/mL,从单独转染后合并培养的细胞上清仍可检测到F309SfVⅢ蛋白和fVⅢ生物活性,分别为(25±6)ng/mL和(0.12±0.05)IU/mL,说明上清中的F309SfVⅢ蛋白由分泌前、后剪接两部分共同形成。共转染细胞培养液上清中的HC含量明显高于单独转染融合内含肽和HC的细胞培养液上清[(135±10)ng/mL vs(37±7)ng/mL,P<0.01)]。以上结果提示内含肽可作为一种技术手段用于双载体系统真核细胞F309SfVⅢ基因转移,并可改善F309SfVⅢ的分泌,为体内甲型血友病基因治疗研究中应用AAV载体、克服其容量限制转F309SfVⅢ基因提供了一种解决方案。

关键词：凝血因子VIII 分泌内含肽蛋白质反式剪接

双载体断裂CFTR基因转移及翻译后的连接和功能

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药学学报 2010年第1期45卷 60-65页

作者：朱甫祥刘泽隆屈慧鸽迟晓艳鲁东大学生命科学学院山东烟台264025

囊性纤维化跨膜电导调节体(CFTR)基因突变导致一种常染色体隐性遗传病囊性纤维化(CF),利用腺辅助病毒(AAV)载体转运CFTR基因的基因疗法受到AAV载体容量的限制。本文采用intein的蛋白质反式剪接技术,以双载体转运CFTR基因,研究了于其调... 详细信息

囊性纤维化跨膜电导调节体(CFTR)基因突变导致一种常染色体隐性遗传病囊性纤维化(CF),利用腺辅助病毒(AAV)载体转运CFTR基因的基因疗法受到AAV载体容量的限制。本文采用intein的蛋白质反式剪接技术,以双载体转运CFTR基因,研究了于其调节结构域(R)断裂成两部分的CFTR基因翻译后的连接及其产生的Cl-通道功能。将人CFTRcDNA于R结构域的Ser712密码子前断裂,构建一对融合SspDna Bintein编码序列的真核表达载体。将这对载体共转染培养的幼年仓鼠肾(BHK)细胞,通过瞬时表达,全细胞和单通道膜片钳记录Cl-电流,并用Westernblotting观察CFTR蛋白的剪接。结果表明,共转染细胞显示较高的全细胞Cl-电流和单个Cl-通道开放活性,说明CFTR的Cl-通道功能的恢复,用CFTR特异性抗体进行的细胞总蛋白Westernblotting显示有完整的CFTR蛋白条带形成,表明intein可有效连接翻译后的两部分CFTR蛋白。结果提示,蛋白质剪接技术可有效用于双载体系统转运CFTR基因,为进一步应用双AAV载体转运CFTR基因的CF基因治疗研究提供了实验依据。

关键词：蛋白质反式剪接囊性纤维化跨膜电导调节体基因氯离子通道双载体系统

二硫键形成促进双载体转断裂B区缺失型凝血因子Ⅷ基因

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生物化学与生物物理进展 2012年第2期39卷 181-187页

作者：朱甫祥杨树德刘泽隆缪静屈慧鸽迟晓艳鲁东大学生命科学学院烟台264025

双载体共转B区缺失型凝血因子Ⅷ(BDD-FⅧ)重链和轻链基因是克服腺相关病毒载体(AAV)容量限制的一种策略,但重链分泌的低效性产生链不均衡性,影响转基因的功效.假设重、轻链链间二硫键形成可提高双载体转BDD-FⅧ基因的功效,本文将BDD-F... 详细信息

双载体共转B区缺失型凝血因子Ⅷ(BDD-FⅧ)重链和轻链基因是克服腺相关病毒载体(AAV)容量限制的一种策略,但重链分泌的低效性产生链不均衡性,影响转基因的功效.假设重、轻链链间二硫键形成可提高双载体转BDD-FⅧ基因的功效,本文将BDD-FⅧ的重链A2区的Met662和轻链A3区的Asp1828突变为Cys.双载体培养的COS-7细胞共转染突变重链和轻链基因,Western blot显示细胞内二硫键交联的重、轻链蛋白形成,ELISA和Coatest分析细胞培养上清的BDD-FⅧ重链分泌量和生物活性,分别为(109±13)μg/L和(0.65±0.12)U/ml,明显高于共转野生型重链和轻链基因细胞((71±11)μg/L和(0.35±0.05)U/ml).结果表明,链间二硫键形成可提高双载体转BDD-FⅧ基因的功效,为进一步动物体内运用双AAV载体转BDD-FⅧ基因提供了实验依据.

关键词： B区缺失型凝血因子Ⅷ 双载体转基因链间二硫键

尿激酶氨基末端基因抗乳腺癌细胞转移的实验研究

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中华肿瘤杂志 2001年第2期23卷 115-117页

作者：朱甫祥邢桂春贺福初军事医学科学院放射医学研究所北京100850

目的　探讨尿激酶氨基末端 (ATF)基因转移对肿瘤转移的抑制作用。方法　构建重组ATF基因真核表达载体pcDNA3 ATF ,用脂质体Lipofectin介导 ,将其导入其证明尿激酶 (uPA)和尿激酶受体 (uPAR)均有表达的人乳腺癌细胞系MCF 7。用Westernblo... 详细信息

目的　探讨尿激酶氨基末端 (ATF)基因转移对肿瘤转移的抑制作用。方法　构建重组ATF基因真核表达载体pcDNA3 ATF ,用脂质体Lipofectin介导 ,将其导入其证明尿激酶 (uPA)和尿激酶受体 (uPAR)均有表达的人乳腺癌细胞系MCF 7。用Westernblot检测转染细胞ATF基因的表达 ;体外观察并比较了野生型和转基因MCF 7细胞侵袭人工基底膜能力 ;裸鼠皮下接种癌细胞 ,复制自发性肿瘤转移模型 ,观察成瘤性和转移性。结果　uPA/uPAR在MCF 7中有较高水平的表达 ;转ATF基因后 ,可检测到ATF的明显表达 ,体外侵袭穿透人工基底膜的能力明显降低 ,体内原位成瘤性不受影响 ,但自主性肺转移能力有一定程度的下降。结论　ATF基因转移后 ,ATF的表达可能竞争性抑制内源性uPA与uPAR的结合 ,在一定程度上抑制癌细胞的侵袭和转移。

关键词：乳腺肿瘤肿瘤转移尿激酶基因转移乳腺癌基因治疗

引入糖基化位点和L303E/F309S突变促进intein介导的断裂凝血Ⅷ因子剪接

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药学学报 2010年第11期45卷 1361-1366页

作者：朱甫祥刘泽隆缪静屈慧鸽迟晓艳鲁东大学生命科学学院山东烟台264025

作者最近证明intein的蛋白质剪接技术可用于双载体转B区缺失型FVIII(BDD-FVIII)基因,在此基础上,本研究将具有促FVIII分泌作用的L303E/F309S双突变和B结构域糖基化位点引入BDD-FVIII重链,观察重链变体对intein剪接的BDD-FVIII蛋白分泌... 详细信息

作者最近证明intein的蛋白质剪接技术可用于双载体转B区缺失型FVIII(BDD-FVIII)基因,在此基础上,本研究将具有促FVIII分泌作用的L303E/F309S双突变和B结构域糖基化位点引入BDD-FVIII重链,观察重链变体对intein剪接的BDD-FVIII蛋白分泌和活性的影响。用分别融合Ssp DnaB intein的重链变体(DMN6HCIntN)和轻链(IntCLC)基因共转染培养的293细胞,用ELISA分析分泌至培养上清液中的剪接BDD-FVIII蛋白量,并用发色法检测培养上清液的凝血生物活性。结果显示,DMN6HCIntN和IntCLC共转基因细胞上清液中剪接BDD-FVIII的浓度为(149±23)***-1,活性为(1.12±0.14)***-1,明显高于intein融合的野生型重链(HCIntN)与轻链(IntCLC)共转基因细胞[(99±14)***?1和(0.77±0.13)***?1],提示重链变体能明显促进剪接BDD-FVIII蛋白的分泌和活性;另外,还检测到不依赖细胞机制的BDD-FVIII剪接。本研究为进一步动物体内双AAV载体转BDD-FVIII基因研究提供了依据。

关键词：凝血VIII因子重链变体分泌 intein 蛋白质剪接

猪VⅢ因子A1和A3结构域对翻译后剪接的人/猪杂合VⅢ因子的促分泌作用

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生理学报 2010年第4期62卷 373-381页

作者：朱甫祥刘泽隆屈慧鸽迟晓艳鲁东大学生命科学学院烟台264025

凝血VⅢ因子(fVⅢ)蛋白的低效分泌以及基因过大是基于转fVⅢ基因的甲型血友病基因治疗的不利因素。本室前期用内含肽(intein)的蛋白质反式剪接实验证明,运用双载体共转fVⅢ基因,通过翻译后蛋白质剪接,轻链可顺式促进fVⅢ蛋白的分泌。本... 详细信息

凝血VⅢ因子(fVⅢ)蛋白的低效分泌以及基因过大是基于转fVⅢ基因的甲型血友病基因治疗的不利因素。本室前期用内含肽(intein)的蛋白质反式剪接实验证明,运用双载体共转fVⅢ基因,通过翻译后蛋白质剪接,轻链可顺式促进fVⅢ蛋白的分泌。本文用猪fVⅢ蛋白的A1和A3结构域替换人fVⅢ蛋白相应的结构,构建人/猪杂合fVⅢ(human/porcinehy-bridfVⅢ,HP-fVⅢ),研究基于内含肽的双载体转HP-fVⅢ基因后剪接HP-fVⅢ的分泌和活性。构建一对分别融合SspDnaB内含肽的HP-fVⅢ重链和轻链基因表达质粒,瞬时共转染COS-7细胞,用ELISA和Coatest法定量分析分泌至培养上清中HP-fVⅢ的剪接和生物活性,用Western blotting检测了细胞内HP-fVⅢ的剪接。结果显示,双载体转HP-fVⅢ基因细胞上清的剪接HP-fVⅢ蛋白量为(184±34)ng/mL,活性为(1.18±0.22)IU/mL,明显高于双载体转人fVⅢ基因[蛋白量为(48±12)ng/mL,活性为(0.31±0.10)IU/mL],提示猪fVⅢ的A1和A3结构域能显著促进内含肽剪接的HP-fVⅢ的分泌和活性;另外,还在混合培养的分别转内含肽融合HP-fVⅢ重链和轻链基因细胞上清中检测到剪接的HP-fVⅢ蛋白量为(27±5)ng/mL,活性为(0.19±0.07)IU/mL,提示内含肽对HP-fVⅢ的剪接可不依赖细胞机制,分泌出胞的前体蛋白仍可进行剪接反应;双载体转HP-fVⅢ基因细胞内检测到与转hfVⅢ基因阳性对照细胞内hfVⅢ条带大小接近的剪接HP-fVⅢ蛋白条带,进一步证实HP-fVⅢ的剪接。该结果为进一步在动物体内应用内含肽的双腺相关病毒载体转HP-fVⅢ基因奠定了实验基础。

关键词：人/猪杂合VⅢ因子分泌内含肽蛋白质反式剪接

RGD肽与尿激酶B链融合蛋白原核重组表达质粒的构建、表达和功能的初步分析

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生物工程学报 2000年第5期16卷 582-586页

作者：朱甫祥邢桂春贺福初军事医学科学院放射医学研究所北京100850

将化学合成的RGD肽 (Arg Gly Asp)编码寡核苷酸与尿激酶B链cDNA相连成为融合基因后 ,克隆至原核表达质粒pBV2 2 0中 ,在PRPL 启动子的作用下 ,经 42℃热诱导 ,在大肠杆菌DH5α中获得了融合基因的表达 ,其表达量占菌体总蛋白的 9 2 % ,... 详细信息

将化学合成的RGD肽 (Arg Gly Asp)编码寡核苷酸与尿激酶B链cDNA相连成为融合基因后 ,克隆至原核表达质粒pBV2 2 0中 ,在PRPL 启动子的作用下 ,经 42℃热诱导 ,在大肠杆菌DH5α中获得了融合基因的表达 ,其表达量占菌体总蛋白的 9 2 % ,表达产物以无活性的包含体形式存在。经变复性处理得到纯化的融合基因的表达产物 ,经Westernblotting分析表明产物具有与天然尿激酶相似的抗原性 ,体外活性分析显示其具有一定的纤溶和抗血小板聚集的活性。

关键词： RGD肽尿激酶B链融合基因溶栓剂基因表达

亮氨酸拉链促进蛋白质剪接介导的双载体转凝血Ⅷ因子基因

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药学学报 2012年第1期47卷 39-44页

作者：朱甫祥杨树德刘泽隆缪静屈慧鸽迟晓艳鲁东大学生命科学学院山东烟台264025

作者最近基于蛋白内含子(intein)的双载体转B区缺失型凝血Ⅷ因子(BDD-FⅧ)基因研究证明,表达后的重、轻链可通过蛋白质反式剪接成为共价连接的完整BDD-FⅧ分子并发挥凝血生物活性,但存在不完全剪接的前体蛋白。本文试图通过将具有特异... 详细信息

作者最近基于蛋白内含子(intein)的双载体转B区缺失型凝血Ⅷ因子(BDD-FⅧ)基因研究证明,表达后的重、轻链可通过蛋白质反式剪接成为共价连接的完整BDD-FⅧ分子并发挥凝血生物活性,但存在不完全剪接的前体蛋白。本文试图通过将具有特异性强相互作用的亮氨酸拉链引入intein序列,提高反式剪接的效率,用双载体系统向培养的COS-7细胞共转融合intein的重链和轻链基因,通过瞬时表达观察了细胞内BDD-FⅧ的剪接和分泌至培养上清液的剪接BDD-FⅧ量和生物活性。结果显示,Western blotting检测到共转基因细胞内明显增强的BDD-FⅧ剪接,表现为前体蛋白的减少;分别用ELISA和Coatest法分析共转基因细胞培养上清液中分泌的剪接BDD-FⅧ蛋白量和生物活性为(106±12)***-1和(0.89±0.11)***-1,明显高于无亮氨酸拉链的intein融合重链和轻链基因共转基因细胞[(72±10)***-1和(0.62±0.07)***-1],而且不依赖细胞机制的蛋白质剪接反应明显增强,表现为混合培养的转重链和轻链基因细胞上清液中增加的剪接BDD-FⅧ蛋白量和生物活性[(36±11)***-1和(0.28±0.09)***-1]。结果表明,亮氨酸拉链可通过增强融合于重链和轻链的intein间的相互作用提高蛋白质反式剪接的效率,改善基于蛋白质剪接的双载体转BDD-FⅧ基因的效果,为进一步的动物体内基于蛋白质剪接的双腺相关病毒(AAV)载体转FⅧ基因研究提供了实验依据。

关键词：凝血Ⅷ因子 intein 蛋白质反式剪接亮氨酸拉链