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结核分枝杆菌eis基因表达对人THP-1细胞细胞因子分泌的影响

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结核分枝杆菌eis基因表达对人THP-1细胞细胞因子分泌的影响

作者：朱坤生重庆医科大学

学位级别：硕士

目的:结核菌的持留性和结核分枝杆菌的耐药性为目前控制结核病的两大难题,结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)的持留性,结核持留菌的存在是结核病感染呈现慢性化的最主要原因。结核持留菌在机体内的存在是临床上诊断和治疗... 详细信息

目的:结核菌的持留性和结核分枝杆菌的耐药性为目前控制结核病的两大难题,结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)的持留性,结核持留菌的存在是结核病感染呈现慢性化的最主要原因。结核持留菌在机体内的存在是临床上诊断和治疗结核病时结核菌的潜伏感染、结核病复发、结核菌耐药、迁延不愈,结核病治疗期限延长、预后不佳等一系列问题发生的原因,持留菌通过多种渠道和方式从抗结核药物的灭菌和机体的免疫系统杀伤中逃逸出来,保持了结核分枝杆菌在环境中的稳定性和对机体内环境的适应性和无反应性,导致耐药和持留。至今结核分枝杆菌的持留的机制尚未完全明确,持留的途径尚未完全揭开,因此临床上迄今为止并没有针对结核持留菌进行完全有效治疗的方法,并进一步控制结核病。而研究发现MTB能进入巨噬细胞,且被巨噬细胞吞噬后,由于巨噬细胞内特殊基因的表达,导致了结核菌对巨噬细胞胞内环境的适应,从而达到持留作用。结核分枝杆菌基因组者全序列的阐明基础研究中为临床上根除持留菌从基因和分子生物学的角度为揭开结核杆菌持留生存的机制提供了理论支持。MTBeis基因仅存在于致病性MTB中,可抑制细胞保护性免疫反应,增加非致病性MTB在宿主细胞内的持留,eis基因产物Eis蛋白为一可溶性分泌蛋白,分子量大致为42kd,能作用于巨噬细胞,有研究证实该42kd蛋白能够影响巨噬细胞肿瘤坏死因子(tunlornecrosisfactor,tnf)-a和白介素(interlukin,il)-10的分泌,有效的抑制了单核巨噬细胞细胞的活化而与持留的的关联。本课题组之前何师姐的实验结果已经证实结核分枝杆菌eis基因的产物eis蛋白能够提升巨噬细胞吞噬耻垢分枝杆菌之后耻垢杆菌于宿主巨噬细胞内的生存率,结核分枝杆菌在单核巨噬细胞内的比较具体的持留机制尚不清楚。目前已有文献指出,机体细胞因子表达和分泌的变化对机体的免疫和结核分枝杆菌在巨噬细胞的持留和潜伏感染都会产生影响,eis基因可增加结核菌在巨噬细胞的持留是否与其可能影响吞噬细胞细胞因子的分泌和作用有关,目前文献中报到的很少。IL-10具有非常广泛的生物学的活性,其为一种多功能的机体负性免疫调节的细胞因子,是一种免疫抑制性的细胞因子,且有高效性。能改变机体免疫应答和mhcⅡ类抗原表达,也可选择性抑制巨噬细胞某些方面的功能,也抑制了对t细胞和b细胞的功能。本次实验的主要目的即使为了要探索eis基因对结核分枝杆菌感染单核巨噬细胞之后的巨噬细胞分泌和表达的各种细胞因子影响,筛选出具有差异性表达的细胞因子,为进一步从细胞免疫入手研究eis基因持留机制提供实验依据。方法:1.以rpmi1640培养基(内含10%胎牛血清)培养浓度为1×105的thp-1细胞,之后pma诱导细胞使thp-1细胞分化,将重组结核分枝杆菌ms-pmv261-eis及对照菌ms-pmv261培养7天后离心集菌,少量培养基用力吹打、震荡混合均匀,紫外光分光光度计计算细菌浓度,最后按moi=10:1感染thp-1细胞分化的巨噬细胞。2.取细胞上清液,用elisa方法检测eis基因对thp-1细胞中il-10的影响将thp-1细胞种至6孔板,以pma诱导分化24小时后以pbs清洗细胞并以重组分枝杆菌感染细胞,18h收集细胞上清液,室温下1000g离心15min,取100hul以elisa检测il-4,il-6,il-10,il-12,inf-γ表达情况;根据标准品浓度和测得的od值绘制成为标准曲线,根据描绘的标准曲线计算出各实验组细胞因子的浓度。3.收集细胞提取细胞总rna,rt-pcr检测试剂盒进一步检测il-10的浓度,在基因层面的表达。18h后收集细胞,提取总rna,根据上述elisa检查结果设计特异性表达il-10细胞因子的引物,rt-pcr检测进一步确证该细胞因子的基因表达。引物序列:上游引物:5’-ggcttcctaactgctaca-3’下游引物:5’-ctcctgacctcaagtgat-3;反应条件:pcr反应条件为:95oc预变性5min;95oc变性30s,60oc退火30s,72oc延伸30s,共35个循环后再72oc延伸10min。pcr扩增结束,pcr扩增的产物进行收集,后进行1%琼脂糖凝胶电泳。4.用统计学分析数据,spss15.0统计软件,以x±s表示,两组进行t检验。结果:1.pma成功诱导thp-1细胞转化为巨噬细胞,重组结核分枝杆菌MS-pmv261-eis及对照菌MS-pmv261,按MOI=10:1感染Thp-1细胞分化的巨噬细胞。2.ELISA结果显示,结核分枝杆菌eis基因可引起IL-10 OD值明显增加(P0.05)3.收集细胞后提取的巨噬细胞细胞RNA,之后进行的RT-PCR的检测,测定的结果为IL-10的mRNA条带的表

关键词：结核分枝杆菌 eis基因单核巨噬细胞白介素-10

结核分枝杆菌eis基因表达对人THP-1细胞细胞因子分泌的影响

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免疫学杂志 2015年第8期31卷 697-700页

作者：朱坤生易敏周向东李升锦重庆医科大学附属第二医院呼吸内科 400010

目的研究结核分枝杆菌eis基因表达对人单核巨噬细胞Thp-1细胞的影响,筛选出差异性表达细胞因子,探讨结核分枝杆菌eis基因在单核巨噬细胞致持留的免疫机制。方法 eis基因重组耻垢分枝杆菌MS-pmv261-eis及对照组细菌MSpmv261感染经PMA诱... 详细信息

目的研究结核分枝杆菌eis基因表达对人单核巨噬细胞Thp-1细胞的影响,筛选出差异性表达细胞因子,探讨结核分枝杆菌eis基因在单核巨噬细胞致持留的免疫机制。方法 eis基因重组耻垢分枝杆菌MS-pmv261-eis及对照组细菌MSpmv261感染经PMA诱导分化的人单核巨噬细胞Thp-1细胞;细胞信号传导通路抑制剂用于分析作用机制;ELISA方法检测细胞上清中IL-4、IL-6、IL-10、IL-12、INF-γ表达水平;筛选差异性表达的细胞因子,RT-PCR进一步确定该细胞因子的基因表达。结果结核分枝杆菌eis基因可引起IL-10表达增加(P0.05),RT-PCR结果也进一步确证了IL-10基因的高表达。2-AP和U0126能明显抑制MS-pmv261-eis(MS-eis)感染引起的IL-10的释放(P<0.05)。结论结核分枝杆菌eis基因可上调Thp-1细胞IL-10在蛋白水平和基因水平的表达,可能通过MEK1/2或PKR信号通路刺激IL-10的释放来增强机体的免疫功能,其作用可能与结核分枝杆菌持留性有关。

关键词：结核分枝杆菌 eis基因单核巨噬细胞白介素-10

关于志书篇目设置的几个问题——参加我省第二轮志稿评议的一些体会

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广东史志．视窗 2009年第2期 26-27页

作者：朱坤生江门市地方志办

最近．我到本省一些地方参加了地方志稿评议会．感到大部分志稿的质量不错．深受鼓舞。但也看到一些问题．其中之一就是普遍存在对篇目设置不够科学、要求不严谨，造成志书记述内容重复、缺项、繁杂、零散，以致志史不分，非驴非马。对... 详细信息

最近．我到本省一些地方参加了地方志稿评议会．感到大部分志稿的质量不错．深受鼓舞。但也看到一些问题．其中之一就是普遍存在对篇目设置不够科学、要求不严谨，造成志书记述内容重复、缺项、繁杂、零散，以致志史不分，非驴非马。对此．我想谈几点体会：

关键词：篇目设置志稿评议志书内容重复地方志议会

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试析初中数学课堂师生互动教学举措

当代教研论丛 2020年第3期7卷 72-73页

作者：朱坤生福建省云霄县元光中学福建漳州363300

新课程教学改革背景下,初中数学课堂效率的提升要充分注重教学方式方法的创新,为提高课堂活力提供动力。本文主要就初中数学课堂教学中的师生互动展开探究,旨在为课堂教学效率的提高提供有益的思路,从而促进教学质量的提升。

关键词：初中数学师生互动课堂教学

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商业银行中间业务增收渠道研究

金融与经济 2008年第8期 48-51页

作者：江西城市金融学会课题组初苏华朱坤生刘艺琴刘映瑞王平黄霞江西城市金融学会课题组

在我国金融业全面开放和金融体制改革的深入发展的背景下,商业银行纷纷把经营重点转向发展中间业务,在新的经营形势下,如何拓宽中间业务增收渠道,保持中间业务持续快速发展,是当前商业银行面临的重要课题,对商业银行实现经营转型具有至... 详细信息

在我国金融业全面开放和金融体制改革的深入发展的背景下,商业银行纷纷把经营重点转向发展中间业务,在新的经营形势下,如何拓宽中间业务增收渠道,保持中间业务持续快速发展,是当前商业银行面临的重要课题,对商业银行实现经营转型具有至关重要的作用。

关键词：商业银行中间业务增收渠道

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商业银行收入结构及中间业务发展问题研究

武汉金融 2006年第9期 40-41页

作者：江西省城市金融学会课题组杨经纬张毅朱坤生钟莉萍江西省城市金融学会江西南昌330008

本文着重从商业银行收入结构现状和发展趋势入手,重点研究中间业务发展对商业银行收入结构调整的积极作用,提出当前商业银行发展中间业务的战略举措,以此推动我国商业银行的健康发展。

关键词：商业银行中间业务收入结构调整

浅议现浇混凝土楼板非结构裂缝原因的分析与防治

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科技资讯 2006年第1期4卷 43-43页

作者：王双良朱坤生哈尔滨市第二建筑工程公司 150010

近几年在工业与民用建筑中，现浇钢筋混凝土楼板施工时，经常会出现非荷载因素引起的裂缝，而这种混凝土的非结构荷载裂缝的发生频率呈上升趋势。这些裂缝的产生困扰着施工企业，监理单位，业主等诸多单位。

关键词：现浇混凝土楼板裂缝原因非结构现浇钢筋混凝土楼板防治监理单位民用建筑上升趋势发生频率荷载裂缝

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中国公共卫生财政支出分析

中国卫生政策研究 2024年第5期17卷 33-40页

作者：朱坤中国财政科学研究院北京100142

本文对我国新医改以来的公共卫生财政支出进行分析,发现主要存在以下问题:一是公共卫生纵向与横向投入不协同,不利于提升专业公共卫生机构在我国公共卫生体系中的地位;二是公共卫生领域的事权与支出责任划分,不利于“预防为主”目标的实... 详细信息

本文对我国新医改以来的公共卫生财政支出进行分析,发现主要存在以下问题:一是公共卫生纵向与横向投入不协同,不利于提升专业公共卫生机构在我国公共卫生体系中的地位;二是公共卫生领域的事权与支出责任划分,不利于“预防为主”目标的实现;三是专业公共卫生机构在卫生服务体系中的地位日益弱化,与“预防为主”的要求不相适应;四是人员激励不足,进一步弱化了专业公共卫生机构。据此,本文提出四点政策建议:一是提高公共卫生预算的优先层级,强化公共卫生财政支出的硬约束;二是优化公共卫生财政支出结构,加强公共卫生纵向投入与横向投入的协同;三是完善公共卫生领域的中央和地方事权与支出责任,增强中央财政在横向投入中的支出责任;四是进一步健全人员激励机制,稳步强化专业公共卫生机构。

关键词：公共卫生财政支出事权与支出责任纵向投入横向投入

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光频域反射计研究进展

激光与光电子学进展 2024年第5期61卷 13-29页

作者：朱坤垚江毅北京理工大学光电学院北京100081 信息光子技术工业和信息化部重点实验室北京100081

光频域反射计(OFDR)是一种分布式光纤测量技术。将扫频激光注入光纤链路,对后向瑞利散射光进行频域分析,定位光纤链路上的反射点位置及强度。由于其具有高精度、高空间分辨率等特点,广泛地应用于航空航天、智能结构、材料加工、光学网... 详细信息

光频域反射计(OFDR)是一种分布式光纤测量技术。将扫频激光注入光纤链路,对后向瑞利散射光进行频域分析,定位光纤链路上的反射点位置及强度。由于其具有高精度、高空间分辨率等特点,广泛地应用于航空航天、智能结构、材料加工、光学网络监测、生物医学等高精度测量及制造领域。本文阐述了OFDR的基本原理,介绍了提升OFDR系统性能的关键技术研究进展,最后总结了OFDR在不同领域的应用,展望了未来的发展趋势。

关键词：光频域反射计分布式光纤传感后向瑞利散射频域分析