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目的:探讨EAE小鼠星形胶质细胞的自噬水平变化以及小檗碱对在体和离体的星形胶质细胞自噬水平的影响。方法:使用MOG35-55多肽免疫C57BL/6小鼠构建EAE小鼠模型,将小鼠分为CFA组、EAE组、EAE+BBR(100mg/kg·d)组、EAE+RAPA(1mg/kg·d)组,观察各组小鼠神经系统功能评分。在EAE模型诱导成功后的3d、7d、15d、30d心脏灌注取脑和脊髓,制作石蜡切片。免疫荧光双标定位检测小鼠脊髓白质星形胶质细胞上自噬相关蛋白Beclin1、LC3B的表达水平;第30d的切片行HE染色和LFB染色观察发病30d时各组小鼠脑白质炎症浸润情况和脱髓鞘情况。从健康新生的C57BL/6小鼠大脑皮质中分离纯化出原代星形胶质细胞,经两次传代后得到稳定的星形胶质细胞,使用星形胶质细胞特异性标记GFAP抗体进行细胞鉴定,得到纯化率>95%的可用于实验的星形胶质细胞。将细胞样品分为三组进行干预:LPS组、LPS+BBR组、LPS+RAPA组,提取未干预时、干预后0.75h、1.5h、3h、6h、12h的细胞蛋白样品并采用BCA法进行蛋白定量,Western Blot法检测各组的自噬相关蛋白Beclin1、LC3B的表达水平。结果:(1)EAE小鼠最早于免疫后8d发病,大多数发病时间集中在13-15d,并于15-19d达到疾病最高峰。与EAE组的最高分和总分相比,EAE+BBR组(P0.05)。(4)通过星形胶质细胞特异性标记物GFAP与自噬相关蛋白LC3B荧光双标共定位发现,EAE小鼠免疫后7d、15d、30d时,EAE组小鼠脊髓星形胶质细胞上LC3B表达明显低于EAE+BBR组(P0.05)。(5)WB结果示,在干预后第0.75h,1.5h,3h,6h,12h,LPS组星形胶质细胞上自噬相关蛋白Beclin1的相对表达量较干预以前无明显变化(P>0.05),LPS+BBR组(P0.05),LPS+BBR组(P<0.01)和LPS+RAPA组(P<0.01)星形胶质细胞上自噬相关蛋白LC3-II/I相对表达量的比值较干预以前明显增高。结论:(1)EAE小鼠免疫后星形胶质细胞上自噬持续处于低水平表达,离体培养的原代星形胶质细胞通过LPS刺激后自噬也持续处于低水平表达。(2)雷帕霉素和小檗碱可改善EAE小鼠神经功能缺损,减轻炎症浸润和脱髓鞘情况。(3)雷帕霉素和小檗碱可诱导EAE小鼠和离体星形胶质细胞上的自噬,这可能是雷帕霉素和小檗碱改善EAE症状的机制之一。

关键词： EAE 多发性硬化小檗碱雷帕霉素星形胶质细胞自噬

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