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抗人CA15-3单克隆抗体的制备、鉴定及化学发光检测体系的建立

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细胞与分子免疫学杂志 2014年第1期30卷 66-70页

作者：曹领改蓝兴国魏德强李玉花东北林业大学生命科学学院黑龙江哈尔滨150040 大庆麦伯康生物技术有限公司黑龙江大庆163316 东北林业大学大庆生物技术研究院黑龙江大庆163316

目的获得抗人CA15-3单克隆抗体（mAb），建立CAl5-3双抗体夹心化学发光检测体系。方法人CAl5-3糖抗原免疫小鼠后，通过细胞融合，筛选到阳性杂交瘤细胞。杂交瘤细胞扩大培养后，纯化获得抗CAl5-3的mAb。对抗体进行纯度、效价、表位和亚... 详细信息

目的获得抗人CA15-3单克隆抗体（mAb），建立CAl5-3双抗体夹心化学发光检测体系。方法人CAl5-3糖抗原免疫小鼠后，通过细胞融合，筛选到阳性杂交瘤细胞。杂交瘤细胞扩大培养后，纯化获得抗CAl5-3的mAb。对抗体进行纯度、效价、表位和亚型的鉴定并建立双抗体夹心检测CAl5—3化学发光体系，对该体系进行准确度、最低检测限、线性、重复性与特异性评估。结果获得5株阳性信号较强的杂交瘤细胞（分别为#3-1-3、#5-2-2、#11-2-2、#12—1—3和#16-1-3）。其分泌的抗体效价均大于10qg／mL，轻链均为K链，重链#3—1-3为IgG2a、#5-2-2与#12-1-3为IgG2b、#11-2-2与#16—1-3为IgG3。双抗体夹心体系在（0。300）U／mL范围内线性关系良好，其准确度的回收率为97．45％；最低检测限为0．59U／mL；线性相关系数为0．9978；低高值的变异系数（cy）均小于10％；与肿瘤标志物AFP、CEA、CAS0、CAl9-9和CA72-4均不交叉。结论成功制备了抗人CAl5-3mAb，建立了双抗体夹心检测CAl5-3化学发光体系。

关键词：肿瘤标志物糖抗原CA15-3 单克隆抗体化学发光免疫分析

抗人游离前列腺特异性抗原(f-PSA)单克隆抗体的制备及应用

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细胞与分子免疫学杂志 2018年第9期34卷 839-844页

作者：张兰兰曹领改魏德强东北林业大学生命科学学院黑龙江哈尔滨150040

目的建立产生抗人游离前列腺特异抗原单克隆抗体(f-PSA m Ab)的细胞株,获得抗体后建立抗人f-PSA化学发光免疫分析法(CLIA)并进行应用。方法采用杂交瘤技术获得2株稳定分泌抗f-PSA m Ab的细胞株,将细胞株用转瓶扩大培养并将上清液采用亲... 详细信息

目的建立产生抗人游离前列腺特异抗原单克隆抗体(f-PSA m Ab)的细胞株,获得抗体后建立抗人f-PSA化学发光免疫分析法(CLIA)并进行应用。方法采用杂交瘤技术获得2株稳定分泌抗f-PSA m Ab的细胞株,将细胞株用转瓶扩大培养并将上清液采用亲和纯化法获得抗体,ELISA测定抗体效价、特异性及表位,表面等离子共振法测抗体亲和力;建立双抗体夹心CLIA,采用标准曲线定量法对该体系进行分析性能评估,同时对426例临床血清样本进行检测[其中130例的总PSA水平在(4～10) ng/mL,为"诊断灰区"],评价该试剂与罗氏试剂的检测一致性。结果获得抗人f-PSA m Ab的杂交瘤细胞株(f-10-1、f-14-1)。用f-10-1和f-14-1建立的CLIA的检测范围为(0. 1～30) ng/mL,灵敏度为0. 05 ng/mL,检测结果的相对偏差均在±5%内,与癌胚抗原(CEA)、甲胎蛋白(AFP)及结合态PSA(c-PSA)无交叉反应,该试剂与罗氏试剂相关系数达到0. 99,灰区样本阳性符合率、阴性符合率、总符合率均高于90%。结论成功制备了抗人f-PSA m Ab,建立了特异性定量检测人f-PSA的双抗体夹心CLIA。

关键词：游离前列腺特异抗原(f-PSA) 前列腺癌单克隆抗体双抗体夹心化学发光法(CLIA)

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利用NtBBL基因编辑创制超低烟碱材料

西南农业学报 2024年

作者：曹领改张洁刘杰张盼张孝廉余世洲贵州省烟草科学研究院北京生命科技研究院

【目的】探明利用NtBBL基因编辑创制超低烟碱材料的途径，为选育与开发利用超低烟碱烟草材料提供理论依据。【方法】以普通烟草品种K326为试验材料，采用qPCR对烟碱合成途径中的关键酶基因NtBBLa、NtBBLb、NtBBLc和NtBBLd进行表达模式... 详细信息

【目的】探明利用NtBBL基因编辑创制超低烟碱材料的途径，为选育与开发利用超低烟碱烟草材料提供理论依据。【方法】以普通烟草品种K326为试验材料，采用qPCR对烟碱合成途径中的关键酶基因NtBBLa、NtBBLb、NtBBLc和NtBBLd进行表达模式分析，筛选表达模式相近的同源基因；随后采用CRISPR/Cas9基因编辑载体对NtBBLa、NtBBLb和NtBBLc同源基因保守序列分别设计编辑位点并转化，获得3个基因同时编辑的K326阳性株系材料，最后通过干重法和GC-MS检测编辑材料中烟碱等生物碱的含量，进一步验证创制低烟碱材料的烟碱含量，并对K326阳性株系材料的主要农艺性状进行分析评价。【结果】从烟草NtBBLa、NtBBLb和NtBBLc基因同时进行编辑的株系中筛选出烟碱含量低于0.40 mg/g DW的超低烟碱材料9份，分别为F45-1、F45-2、F45-3、F45-5、F45-7、F45-8、F45-10、F45-11和F45-12株系，其中F45-10株系的烟碱最低含量，为0.23 mg/g DW。基因编辑材料除降烟碱含量（0.068 84～0.232 33mg/g）较对照（0.058 39 mg/g）升高外，其余生物碱含量与对照基本持平或下降。【结论】创制出9份低烟碱含量的材料，为满足烟草制品对原料低烟碱含量需求和培育低烟碱烟草品种提供了材料基础和技术保障。

关键词：烟碱 NtBBL基因 CRISPR/Cas9基因编辑超低烟碱烟草材料

抗人t-PSA单克隆抗体的制备及化学发光检测方法的建立

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中国免疫学杂志 2019年第13期35卷 1599-1603页

作者：曹领改张兰兰魏德强东北林业大学生命科学学院

目的:制备抗人前列腺癌特异性抗原(t-PSA)单克隆抗体,建立t-PSA的化学发光CLIA检测方法。方法: t-PSA抗原免疫小鼠后,通过细胞融合、HTS筛选、扩大培养及亲和纯化后得到t-PSA单克隆抗体(mAb),测定抗体亲和力、特异性及表位,最后选择抗... 详细信息

目的:制备抗人前列腺癌特异性抗原(t-PSA)单克隆抗体,建立t-PSA的化学发光CLIA检测方法。方法: t-PSA抗原免疫小鼠后,通过细胞融合、HTS筛选、扩大培养及亲和纯化后得到t-PSA单克隆抗体(mAb),测定抗体亲和力、特异性及表位,最后选择抗不同表位的单克隆抗体建立双抗体夹心 CLIA检测方法。结果:获得4株阳性信号较强的抗人t-PSA的mAb(3-21-1、3-26-1、3-40-1、3-41-1)。用3-21-1 mAb-HRP和3-26-1 mAb-HRP建立的CLIA体系检测范围为0.1~100 ng/ml,最低检测限为 0.09 ng/ml,相对偏差均在±5%之内,与肿瘤标志物CEA、AFP、Myo无交叉反应。与罗氏试剂检测t-PSA结果对比,一致性检验KAPPA系数为0.933,相关系数为0.936,两组数据具有较好的一致性和相关性。结论:本研究成功制备了抗人t-PSA mAb,建立了定量检测t-PSA的双抗体夹心CLIA 方法。

关键词：人前列腺癌特异性抗原单克隆抗体肿瘤标志物化学发光免疫分析

普通烟草β-半乳糖苷酶基因(NtBGAL)的生信分析及其在不同组织及原核诱导的表达

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西南农业学报 2024年第6期37卷 1220-1227页

作者：曹领改刘杰张洁张盼余世洲贵州省烟草科学研究院贵阳550081 北京生命科技研究院北京100101

【目的】探明普通烟草β-半乳糖苷酶基因NtBGAL的表达模式与蛋白特征,为后期创制烟草多用途利用的底盘材料提供依据。【方法】通过比对普通烟草K326基因序列与本氏烟草NbBGAL1基因的同源性,以K326的cDNA为模板经PCR技术克隆获得NtBGAL基... 详细信息

【目的】探明普通烟草β-半乳糖苷酶基因NtBGAL的表达模式与蛋白特征,为后期创制烟草多用途利用的底盘材料提供依据。【方法】通过比对普通烟草K326基因序列与本氏烟草NbBGAL1基因的同源性,以K326的cDNA为模板经PCR技术克隆获得NtBGAL基因,随后利用生信工具软件分析其基因结构及蛋白理化性质,并采用qRT-PCR检测该基因在烟草不同组织部位(根、茎、叶和花)的表达模式,最后开展原核诱导表达、蛋白纯化及蛋白表征研究。【结果】克隆获得烟草NtBGAL基因,其与本氏烟草NbBGAL1基因同源性最高,二者具有相同的结构域(Motif);该基因定位于9号染色体上,含有18个内含子,mRNA长度为6649 bp,CDS长度为2541 bp,编码846个氨基酸,翻译的β-半乳糖苷酶属于GH35家族,NtBGAL蛋白的分子量为92.44 kDa,理论等电点(pI)为6.8,GRAVY为-0.222,定位于细胞壁。该基因在普通烟草不同组织部位的表达量为花>叶>茎>根,差异显著。在37℃下进行原核诱导,NtBGAL蛋白有明显表达;采用包涵体纯化方法获得较高纯度的NtBGAL蛋白。NtBGAL蛋白酶促反应最适温度为30~40℃,最适pH为4.0~6.5,Mn^(2+)浓度为0.05~0.15 mmol/L时对NtBGAL酶活性有增强作用。【结论】研究明确NtBGAL基因的组织表达模式及蛋白表征,为进一步通过改造NtBGAL基因,利用普通烟草生产人源化糖蛋白奠定基础。

关键词：烟草 NtBGAL基因 β-半乳糖苷酶生信分析原核诱导蛋白表征

抗人妊娠相关血浆蛋白A单抗的制备、鉴定及化学发光和胶体金检测体系的建立

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中国免疫学杂志 2020年第22期36卷 2753-2758页

作者：张兰兰于洋曹领改魏德强(指导) 东北林业大学生命科学学院哈尔滨150040

目的:构建抗人妊娠相关血浆蛋白A(PAPP-A)单抗细胞株,成功筛选配对抗体后建立PAPP-A双抗体夹心化学发光(CLIA)及免疫胶体金(ICG)检测方法。方法:采用杂交瘤技术获得5株稳定分泌抗PAPP-A单抗的细胞株,将细胞株扩大培养并亲和纯化上清液... 详细信息

目的:构建抗人妊娠相关血浆蛋白A(PAPP-A)单抗细胞株,成功筛选配对抗体后建立PAPP-A双抗体夹心化学发光(CLIA)及免疫胶体金(ICG)检测方法。方法:采用杂交瘤技术获得5株稳定分泌抗PAPP-A单抗的细胞株,将细胞株扩大培养并亲和纯化上清液获得抗体,测定抗体纯度、效价、特异性、表位,建立双抗体夹心CLIA及胶体金体系,并对各体系进行灵敏度、特异性等分析性能评估。结果:获得抗人PAPP-A的杂交瘤细胞株(#13-2-2、#20-1-1、#21-1-1、#44-1-1和#53-2-1)。其分泌的抗体效价均大于10-8 g/ml。化学发光体系在0~10000 ng/ml范围内线性关系良好,其准确度的回收率为107.2%;灵敏度为9.56 ng/ml;线性相关系数为0.9966;低高值的变异系数(CV)均小于10%;胶体金体系灵敏度不小于50 ng/ml。两种检测方法与人甲胎蛋白(AFP)、人泌乳素(PRL)、人胎盘催乳素(hPL)和人绒毛膜促性腺激素(HCG)均不存在交叉。结论:本研究成功制备了抗人PAPP-A单抗,建立了检测PAPP-A化学发光及免疫胶体金体系。该体系为PAPP-A的定量检测和产前诊断等临床应用提供了基础。

关键词：人妊娠相关血浆蛋白A 单克隆抗体化学发光法免疫胶体金

抗人CA19-9单克隆抗体的制备和鉴定及化学发光检测体系的建立

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细胞与分子免疫学杂志 2014年第12期30卷 1282-1286页

作者：蓝兴国曹领改魏德强赵洪梅李玉花东北林业大学生命科学学院黑龙江哈尔滨150040 大庆麦伯康生物技术有限公司黑龙江大庆163316 东北林业大学大庆生物技术研究院黑龙江大庆163316

目的制备抗人糖抗原19-9（CA19-9）单克隆抗体（mAb）,建立双抗体夹心检测CA19-9化学发光体系。方法 CA19-9免疫小鼠后,通过细胞融合技术,获得抗CA19-9的mAb。鉴定其抗体的纯度、效价、特异性和配对,建立双抗体夹心化学发光体系。在包... 详细信息

目的制备抗人糖抗原19-9（CA19-9）单克隆抗体（mAb）,建立双抗体夹心检测CA19-9化学发光体系。方法 CA19-9免疫小鼠后,通过细胞融合技术,获得抗CA19-9的mAb。鉴定其抗体的纯度、效价、特异性和配对,建立双抗体夹心化学发光体系。在包被缓冲液、包被浓度及加样模式上优化化学发光体系,对该体系进行准确度、最低检测限、线性、重复性评估以及血清样本的检测。结果获得4株名称为#1-1、#2-1、#3-1和#4-1的mAb。抗体效价均大于10^-8,与CA125、CA15-3、CA72-4均无交叉反应。其中#3-1 mAb与#2-1-HRP建立的双抗体夹心体系经优化后,其检测范围为0~1 000 U/mL;最低检测限为2.0 U/mL;线性相关系数为0.9999。与罗氏试剂检测结果对比,Kappa系数大于0.75;相关系数大于0.9。结论成功制备了抗人CA19-9 mAb,建立了双抗体夹心检测CA19-9化学发光体系。

关键词： CA19-9 单克隆抗体酶联免疫吸附分析化学发光免疫分析

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烟草白粉病抗性连锁分子标记开发及育种利用

中国烟草学报 2021年第5期27卷 45-51页

作者：张孝廉张吉顺贾蒙骜张莉莉曹领改贵州省烟草科学研究院烟草行业分子遗传重点实验室贵阳市550081 贵州大学生命科学学院贵州省农业生物工程重点实验室山地植物资源保护与种质创新省部共建教育部重点实验室贵阳550025

【目的】提高烟草白粉病抗病育种效率,有效防止抗性丢失。【方法】通过烟草种质资源白粉病抗性鉴定获得抗源材料,利用F2和BCF1分离群体进行白粉病抗性遗传规律和分子标记连锁分析,开发与烟草白粉病抗性紧密连锁的分子标记。【结果】获... 详细信息

【目的】提高烟草白粉病抗病育种效率,有效防止抗性丢失。【方法】通过烟草种质资源白粉病抗性鉴定获得抗源材料,利用F2和BCF1分离群体进行白粉病抗性遗传规律和分子标记连锁分析,开发与烟草白粉病抗性紧密连锁的分子标记。【结果】获得白粉病抗源材料2份,分别为台烟7号和KE1,其中台烟7号的白粉病抗性符合双基因隐性遗传规律。根据抗感亲本的NtMLO基因的差异开发了分子标记,利用分离群体证明该标记与白粉病抗性共分离,并应用于主栽品种的抗性回交改良。【结论】开发了与烟草Ntmlo白粉病抗性共分离的分子标记,可显著提高烟草白粉病抗病育种效率。

关键词：白粉病分子标记回交改良资源鉴定

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烟草种质基因分型核心SNP标记的开发

生物技术通报 2023年第3期39卷 89-100页

作者：余世洲曹领改王世泽刘勇边文杰任学良贵州省烟草科学研究院贵阳550081 河北科技师范学院秦皇岛066004 河南农业大学郑州450002 安徽中烟工业有限责任公司合肥230088

基于KASP(kompetitive allele specific PCR)技术平台,开发并验证可用于烟草核心种质基因分型的SNP(single nucleotide polymorphism)标记和对应检测引物,为烟草种质基因型鉴定评价、遗传多样性分析、核心种质筛选等提供技术和数据支持... 详细信息

基于KASP(kompetitive allele specific PCR)技术平台,开发并验证可用于烟草核心种质基因分型的SNP(single nucleotide polymorphism)标记和对应检测引物,为烟草种质基因型鉴定评价、遗传多样性分析、核心种质筛选等提供技术和数据支持。利用Python和Perl脚本程序对覆盖烟草全基因组的1 179 154个SNP位点进行KASP引物设计和筛选,并通过试验验证其准确度和可用性。结果共有217 621个SNP位点完成了对应KASP引物设计,选择1 378个SNP位点进行试验验证,明确了732个可作为SNP标记,并确定48个SNP标记作为烟草种质资源基因分型的核心标记。这48个核心标记在烟草24条染色体上平均分布,平均PIC为0.36,平均MAF为0.39。利用确定的48个核心SNP标记,可以将各供试种质特别是将当前主栽烟草品种基因型进行区分,且标记具有极高的可靠性。

关键词：烟草种质资源单核苷酸多态性竞争性等位基因特异性PCR