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猫白血病病毒gp70蛋白单克隆抗体的制备及应用

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中国兽医学报 2024年第1期44卷 74-79页

作者：杜文广彭佳佳曾悦李佳康史开拓周登元曹胜波张燕李秋燕华中农业大学动物医学院湖北武汉430070 武汉科前生物股份有限公司湖北武汉430040

猫白血病病毒(FeLV)是一种在家猫和野生猫科动物中水平传播的逆转录病毒,可引起淋巴肿瘤、免疫抑制、贫血等疾病,且国内缺乏针对FeLV的诊断试剂及预防或治疗用生物制剂。膜表面糖蛋白gp70是FeLV中和抗体的主要作用靶点,本研究通过构建g... 详细信息

猫白血病病毒(FeLV)是一种在家猫和野生猫科动物中水平传播的逆转录病毒,可引起淋巴肿瘤、免疫抑制、贫血等疾病,且国内缺乏针对FeLV的诊断试剂及预防或治疗用生物制剂。膜表面糖蛋白gp70是FeLV中和抗体的主要作用靶点,本研究通过构建gp70重组表达载体,表达纯化gp70重组蛋白,并以纯化的gp70蛋白免疫6周龄的BALB/c小鼠,进行单克隆抗体的制备。结果表明,成功构建了pET-32a-gp70重组表达质粒,并应用IPTG诱导表达、包涵体纯化获得了原核表达的gp70重组蛋白;成功制备出3株能稳定分泌针对gp70蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株,分别命名为2H5、3B1、5A8;Western blot检测表明仅有2H5单克隆抗体能与gp70蛋白特异性结合;IFA检测表明2H5单克隆抗体能与真核杆状病毒表达的gp70蛋白发生特异性反应,2H5单抗效价可达1∶2048000。本研究成功制备了针对FeLV gp70蛋白的单克隆抗体,为进一步建立准确快速的FeLV诊断方法及研究预防或治疗用生物制剂奠定基础。

关键词：猫白血病病毒(FeLV) gp70蛋白原核表达单克隆抗体杆状病毒表达系统

PRRSV、SS和Pm多重TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立与初步应用

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中国兽医学报 2024年第2期44卷 231-236页

作者：詹存林王庚孙秀秀冯贺龙林正丹胡薛英谷长勤张万坡陶攀陈品钱平曹胜波张伟超程国富华中农业大学动物医学院湖北武汉430000 广西扬翔股份有限公司广西贵港537000

为了建立一种可同时检测并鉴别猪繁殖和呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪链球菌(SS)和猪多杀性巴氏杆菌(Pm)多重TaqMan荧光定量PCR检测方法,本试验通过MEGA7.0分析NCBI上已登录的3种病原体基因序列,分别根据PRRSV的ORF6基因、SS的GDH基因和Pm... 详细信息

为了建立一种可同时检测并鉴别猪繁殖和呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪链球菌(SS)和猪多杀性巴氏杆菌(Pm)多重TaqMan荧光定量PCR检测方法,本试验通过MEGA7.0分析NCBI上已登录的3种病原体基因序列,分别根据PRRSV的ORF6基因、SS的GDH基因和Pm的KMT1基因设计出特异性引物和探针,并对反应条件进行优化。结果显示,该方法能够特异性地检测PRRSV、SS和Pm,对其他病原无交叉反应;对PRRSV、SS和Pm的最低检测浓度分别为9.93×10^(2)、1.10×10^(2)和1.07×10^(2)拷贝/μL;组内和组间变异系数均小于1.85%。结果表明,该方法特异性强、灵敏性高、稳定性好,可应用于临床检测。

关键词：猪繁殖和呼吸综合征病毒猪链球菌猪多杀性巴氏杆菌多重TaqMan荧光定量PCR

裂谷热病毒Gn1蛋白在杆状病毒系统中的表达与纯化

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中国动物传染病学报 2022年第2期30卷 126-133页

作者：孙潇张艳芳叶静曹胜波陈政华中农业大学动物医学院武汉430070 华中农业大学农业微生物学国家重点实验室武汉430070

采用杆状病毒表达系统表达并纯化裂谷热病毒(RVFV)Gn蛋白,并对其反应原性进行鉴定。根据GenBank公布的Gn蛋白的序列,选取其主要抗原区Gn1设计引物进行PCR扩增,将扩增产物克隆至pFastBac HTB载体,构建重组转移载体,并将其转化DH10Bac感... 详细信息

采用杆状病毒表达系统表达并纯化裂谷热病毒(RVFV)Gn蛋白,并对其反应原性进行鉴定。根据GenBank公布的Gn蛋白的序列,选取其主要抗原区Gn1设计引物进行PCR扩增,将扩增产物克隆至pFastBac HTB载体,构建重组转移载体,并将其转化DH10Bac感受态细胞进行蓝白斑筛选。将鉴定正确的重组杆粒转染Sf9细胞获得重组杆状病毒,经SDS-PAGE和Western blot鉴定蛋白正确表达后,将重组杆状病毒感染High5细胞,大量表达重组蛋白,并用镍柱亲和层析法进行纯化,最终获得纯度较高的Gn1重组蛋白。本研究为RVF新型疫苗研发及诊断试剂的研发提供了重要材料。

关键词：裂谷热病毒 Gn1蛋白重组杆状病毒蛋白纯化

湖北省神农架林区野猪分布与传播非洲猪瘟风险分析

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兽类学报 2022年第2期42卷 189-195页

作者：饶静徐茹洁余辉亮李巨平叶静曹胜波李翔华中农业大学动物科学技术-动物医学院武汉430070 华中农业大学园艺林学学院武汉430070 国家动物遗传育种与繁殖国际联合研究中心武汉430070 农业动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室武汉430070 神农架国家公园管理局神农架442411 神农架金丝猴保育生物学湖北省重点实验室神农架442411 神农架林业管理局神农架442400 华中农业大学神农架科技创新中心武汉430070

野猪是非洲猪瘟(ASF)传播的重要媒介,神农架林区野猪种群数量高、分布广,调查野猪分布对ASF防控有着重要意义。本研究首先通过布设红外相机117台、样线287条调查神农架林区野猪实体和痕迹位点后,应用最大熵模型预测林区野猪分布,再根据... 详细信息

野猪是非洲猪瘟(ASF)传播的重要媒介,神农架林区野猪种群数量高、分布广,调查野猪分布对ASF防控有着重要意义。本研究首先通过布设红外相机117台、样线287条调查神农架林区野猪实体和痕迹位点后,应用最大熵模型预测林区野猪分布,再根据野猪、居民区、交通要道的空间分布数据,应用核密度估计法分析神农架林区各地野猪传播ASF的风险。调查发现野猪实体及其粪便、足迹链、巢穴等共2 070处,遍布神农架林区全境,预估野猪数量为18 424头;林区松柏镇、阳日镇、新华镇、省道S307和国道G209沿线等野猪密度高、人口集中的地区为野猪传播ASF极高风险区;极高风险区约4 km外的地区为高风险区;其他地区为中低风险区。本研究表明,松柏镇、阳日镇、新华镇、省道S307、国道G209及周围地区是ASF疫情防控工作中的重点区域,应在这些重点区域做好主动监测防控工作,实时监测ASF动态变化。

关键词：神农架林区野猪非洲猪瘟风险分析

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畜禽重大疫病防控的关键科学问题

中国科学基金 2023年第1期37卷 98-106页

作者：王臣曹胜波肖少波郝海红冯雪莲任红艳国家自然科学基金委员会生命科学部农业动物科学处北京100085 国家自然科学基金委员会生命科学部北京100085 华中农业大学武汉430070

畜禽重大疫病不仅严重危害养殖业健康发展,而且还威胁着公共卫生安全与人民健康。基于第275期“双清论坛”,本文阐述了非洲猪瘟和新冠肺炎疫情下,我国畜禽重大疫病防控的重大需求及面临的挑战,回顾了近年来畜禽重大疫病研究领域的重要进... 详细信息

畜禽重大疫病不仅严重危害养殖业健康发展,而且还威胁着公共卫生安全与人民健康。基于第275期“双清论坛”,本文阐述了非洲猪瘟和新冠肺炎疫情下,我国畜禽重大疫病防控的重大需求及面临的挑战,回顾了近年来畜禽重大疫病研究领域的重要进展,凝炼了该领域未来需要解决的关键科学问题,探讨了本领域未来科学基金资助战略。

关键词：兽医畜禽重大疫病人兽共患病防控进展科学问题

重组猫干扰素ω2的原核表达及抗病毒效果检测

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中国兽医科学 2023年第8期53卷 997-1002页

作者：陆衍波魏宁曹龙龙曹胜波周登元李秋燕华中农业大学动物医学院湖北武汉430070 华中农业大学农业微生物学国家重点实验室湖北武汉430070 武汉科前生物股份有限公司湖北武汉430070

为开发具有高抗病毒活性且经济的猫用干扰素产品,弥补国内猫用干扰素市场的空白,笔者以原核表达的形式生产重组猫干扰素ω2,将猫干扰素ω2成熟肽基因克隆至pET28-SUMO载体,通过质粒在N端携带的水溶性SUMO标签与干扰素的融合表达来实现... 详细信息

为开发具有高抗病毒活性且经济的猫用干扰素产品,弥补国内猫用干扰素市场的空白,笔者以原核表达的形式生产重组猫干扰素ω2,将猫干扰素ω2成熟肽基因克隆至pET28-SUMO载体,通过质粒在N端携带的水溶性SUMO标签与干扰素的融合表达来实现蛋白在工程菌中的可溶性表达。优化表达体系后的重组猫干扰素ω2产量得到有效提高,重组蛋白产量可高达90 mg/L菌液。抗病毒活性测试结果表明,用该方法生产的猫重组干扰素ω2可显著激活干扰素下游各信号分子的表达,其抗VSV-GFP效价高达1010.23 U/mg,显著高于市面同类产品(P<0.001),同时对猫杯状病毒(FCV)也具有较好的抗病毒功效。本研究提供了一种具有高抗病毒活性的重组猫科动物干扰素ω2,为国内猫干扰素产品提供了更为优质的选择。

关键词：猫干扰素ω2 原核表达抗病毒药物猫杯状病毒

2020年—2022年华中地区犬副流感病毒检测及其F、HN基因系统发育分析

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中国动物传染病学报 2023年

作者：惠晓晨戴佩华曹龙龙叶佳雯陈林文汪文渊周登元曹胜波李秋燕武汉科前生物股份有限公司华中农业大学动物医学院湖北省黄石市农业综合执法支队

为探究华中地区犬副流感病毒（canine parainfluenza virus， CPIV）的流行及遗传进化情况，利用RT-PCR方法对华中地区2020年9月至2022年1月收集的418份病料样品进行了CPIV病原检测，并利用生物信息学软件对分离的CPIV毒株的F、HN基因... 详细信息

为探究华中地区犬副流感病毒（canine parainfluenza virus， CPIV）的流行及遗传进化情况，利用RT-PCR方法对华中地区2020年9月至2022年1月收集的418份病料样品进行了CPIV病原检测，并利用生物信息学软件对分离的CPIV毒株的F、HN基因进行同源性、氨基酸位点分析及系统发育分析。病原检测的结果显示，CPIV阳性率为15.8%。在此基础上，扩增获得9株CPIV的F、HN基因的序列，并成功将这9株CPIV毒株分离培养。同时，将分离株的F、HN基因与19株副流感病毒参考毒株进行序列比对分析，结果表明，F基因核苷酸同源性为95.1%～100%，氨基酸同源性为94.6%～99.8%；HN基因核苷酸同源性为95.9～99.9%，氨基酸同源性为95.8%～99.6%。CPIV的F及HN基因与参考毒株相比均有部分氨基酸发生了突变。系统发育分析结果显示，本研究获得的8株分离株与美国株CPI-和CPI+处于同一分支上，亲缘关系较近，另一株分离株CS-324与中国株HeN0718和韩国株D277位于同一分支上。本研究丰富了华中地区CPIV的流行病学调查资料，并为该病的综合防控提供了理论依据。

关键词：犬副流感病毒 F基因 HN基因遗传进化分析

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新发展理念视阈下的我国畜禽疫病防控

中国科学院院刊 2019年第2期34卷 145-151页

作者：常帅刘嘉叶静陈焕春曹胜波华中农业大学动物医学院武汉430070

畜禽疫病的发生与流行是制约我国养殖产业可持续发展的关键因素之一。同时,畜禽疫病还会对动物性食品的源头安全、人民健康以及生态环境造成严重危害。一些烈性畜禽传染病的暴发甚至还会给社会稳定和国家安全带来重大冲击。因此,新时期... 详细信息

畜禽疫病的发生与流行是制约我国养殖产业可持续发展的关键因素之一。同时,畜禽疫病还会对动物性食品的源头安全、人民健康以及生态环境造成严重危害。一些烈性畜禽传染病的暴发甚至还会给社会稳定和国家安全带来重大冲击。因此,新时期科学有效地防控畜禽疫病是我国养殖业实现转型升级与可持续发展的国家重大需求。文章从我国畜禽疫病防控的重要意义与历史成就切入,分析了我国畜禽疫病的流行现状及防控困难,并就此提出了未来科技创新的重点方向。

关键词：新发展理念视阈畜禽疫病防控

猫泛白细胞减少症病毒、猫杯状病毒和猫疱疹病毒1型三重TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用

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中国预防兽医学报 2023年第11期45卷 1141-1147,1198页

作者：陈林文冀伟曹龙龙王莹李秋燕曹胜波陈清秀周登元武汉科前生物股份有限公司湖北武汉430070 华中农业大学动物医学院湖北武汉430070 浙江海正动物保健品有限公司浙江杭州311400

为建立一种能够快速检测猫泛白细胞减少症病毒(FPV)、猫杯状病毒(FCV)和猫疱疹病毒1型(FHV-1)的三重荧光定量RT-PCR方法,本研究根据FPV VP2基因、FCV ORF2基因和FHV-1 TK基因分别设计引物与探针,采用上述引物经PCR分别扩增上述3种病原... 详细信息

为建立一种能够快速检测猫泛白细胞减少症病毒(FPV)、猫杯状病毒(FCV)和猫疱疹病毒1型(FHV-1)的三重荧光定量RT-PCR方法,本研究根据FPV VP2基因、FCV ORF2基因和FHV-1 TK基因分别设计引物与探针,采用上述引物经PCR分别扩增上述3种病原的目的基因并克隆至pMD18-T载体中,构建重组质粒标准品pMD18-T-FPV、pMD18-T-FCV和pMD18-T-FHV-1,并均经PCR和测序鉴定。将3种重组质粒标准品稀释到同一浓度1×10^(8)拷贝/μL,按体积比1∶1∶1混合后作为模板,采用方阵法优化各反应条件后,建立了检测上述病原的三重TaqMan荧光定量RT-PCR方法。以FPV、FCV、FHV-1、猫博卡病毒、猫冠状病毒、猫支原体、猫白血病病毒、猫星状病毒的基因组为模板采用本研究建立的方法检测,评估该方法的特异性,结果显示,该方法仅能检测到FPV、FCV、FHV-1,而其他病原的检测结果均为阴性。选取1×10^(0)拷贝/μL~1×10^(6)拷贝/μL的混合质粒标准品和10^(-0.5) TCID_(50)/mL~10^(5.5) TCID_(50)/mL的混合病毒液分别作为模板,采用本研究建立的方法检测,评估该方法检测重组质粒和病毒的敏感性,结果显示,该方法对重组质粒标准品pMD18-T-FPV、pMD18-T-FCV和pMD18-T-FHV-1的检测限均为1.0×10^(1)拷贝/μL,对3种病毒的检测限均约为10^(0.5) TCID_(50)/mL;以1×10^(7)拷贝/μL、1×10^(5)拷贝/μL、1×10^(3)拷贝/μL质粒标准品混合物作为模板分别进行组内和组间的重复性试验,结果显示,组内和组间重复性试验的变异系数(CV)均低于3%。利用建立的该三重荧光定量RT-PCR和常规PCR对81份临床样品(77份猫的眼、鼻、咽、肛混合拭子样品和4份组织病料样品)分别检测,结果显示三重荧光定量RT-PCR检测出47份FPV、13份FCV和13份FHV-1阳性样品,而常规PCR分别检测出39份FPV、9份FCV和6份FHV-1阳性样品,该三重荧光定量RT-PCR与FPV、FCV、FHV-1常规PCR的总符合率分别为90.12%、95.06%、92.59%。本研究建立的三重TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法特异性强、敏感性高、重复性好,为FPV、FCV、FHV-1临床样品的快速鉴别检测提供了有力技术支持。

关键词：猫泛白细胞减少症病毒猫杯状病毒猫疱疹病毒1型三重荧光定量RT-PCR